Monosit posta ve tümör ile ilgili angiogenez periferik arter hastalığı, bir fare modeli intravital mikroskobu

Merhaba, benim adım Christian Deffge. Magdeburg'daki üniversite hastanesinde tıp doktoruyum ve Dr. Herold ve Profesör Braun-Dullaeus'un kardiyovasküler araştırma grubunda çalışıyorum. Teminat büyümesinin artırılmasını araştırıyoruz.

Bu nedenle görüntüleme kullanıyoruz. Bu videoda yöntemlerimizi açıklamak istiyoruz. Hücreleri, mililitre başına 10 ila altıncı hücre yoğunluğunda serumsuz kültür ortamında yeniden süspanse edin.

Hücre süspansiyonunun bir mililitresine beş mikrolitre bir milimolar DIO ve dimetilformamid ekleyin ve dikkatlice yeniden süspanse edin. Hücre çözeltisini 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Hücreleri beş dakika boyunca 500 g'da santrifüjleyin.

Süpernatanı yerinden çıkarın ve hücreleri 37 derece Santigrat ılık FCS takviyeli ortam ile yeniden süspanse edin. Bu adımı iki kez tekrarlayın. Neubauer sayma odası ve ışık mikroskobu yardımıyla hücreleri sayın.

Hücreleri sodyum klorür çözeltisi ile tekrar süspanse edin. Hücreleri kuyruk damarına enjekte edin. Matrigel matrisi, skuamöz sarkomdan ekstrakte edilen yeniden yapılandırılmış bir bazal membran preparatıdır.

Anjiyojenik inhibisyon yoluyla endotel hücre ağı oluşumu veya anti-kanser tedavileri için test moleküllerini tarar. Hücre tedavisi için kullanmaya çalıştığımız monositlerin tümör anjiyojenik potansiyelini yeniden değerlendirin. Matrigel'e steril koşullarda 100 nanogram BFGF, 300 nanogram VEGFA ve 26 uluslararası ünite heparin ekleyin.

Solüsyonu girdapladıktan sonra, bir mililitre insülin şırıngasına doldurun ve kullanıma kadar buz üzerinde saklayın. Deri altı Matrigel plağının daha iyi görülebilmesi için, farenin derisini enjeksiyon bölgesinde tıraş edin. Keskin bir neşter veya tüy dökücü krem kullanabilirsiniz.

Hayvanı masanın üzerine koyun ve farenin derisini yan taraftaki enjeksiyon bölgesinin yanında tutun. Deri altına 500 mikrolitre Matrigel enjekte edin. Pratik nedenlerden dolayı, deri altı dağılmasını önlemek için Matrigel'i tek bir yere kompakt bir şekilde enjekte etmek gerekir.

Deneyin sonunda fareyi feda ettikten sonra Matrigel matrisini dokudan çıkarmak daha kolay olacaktır. Deneyden önce sodyum klorür çözeltisi ile monosit enjeksiyonunu uygulayın. Monositler sistemik olarak uygulanamazsa sistemik bir etki olmayacaktır.

Bu protokol kapsamında 2,5 milyon monosit enjekte ettik. Gram başına beş mikrolitreden fazla enjekte etmemeye çalışın. Tüm işlem sırasında farenin bir ısıtma yastığı yardımıyla ısıtıldığından emin olun.

Hücrelerin sistemik uygulaması için, bir sınırlayıcı ve bir mililitre insülin şırıngasına, 30 g'lık bir iğneye ve monositlerin yeniden askıya alınmasına ve sodyum klorür çözeltisine ihtiyacınız olacaktır. Fareyi dikkatlice tutun ve hayvanı kısıtlayıcıda tutun. Farenin zarar görmediğinden ve nefes almak için yeterli alana sahip olduğundan emin olun.

Tutucuyu, kuyruğun plakaya temas edebilmesi için ısıtma yastığının üzerine koyun. Enfeksiyonu önlemek için enjeksiyon bölgesini dezenfekte ettiğinizden emin olun. Kuyruğun yan tarafında bulunan kuyruk damarlarını tanımlayın.

Kuyruğu 90 derece çevirin, böylece kuyruk damarı kuyruğun üst tarafında görünür. Monosit çözeltisini düz bir açıyla enjekte etmeye çalışın. Sistemik yan etkileri aramak için hayvanı 30 dakika boyunca gözlemleyin.

Hayvan tamamen iyileştikten sonra fareyi kafesine yerleştirin. Anestezi uygulanmış fareyi, mikroskop stabil koşullara ulaştıktan ve ayarlar bir kukla tarafından test edildikten sonra önceden ısıtılmış mikroskop aşamasına yerleştirin. Pençeleri yapışkan bantla sabitleyin.

Mikroskopi için kullanılan bacak veya yan bölgedeki cildi dezenfekte edin. Daha iyi kullanım ve saçla etkileşimi önlemek için ilgilendiğiniz bölgeyi tıraş edin. İlgilendiğiniz bölgeyi nemli tutun.

Aksi takdirde, görüntülerin ve dokunun kalitesi tehlikeye girecektir. Bacağı iki ayarlanabilir gövde arasına yerleştirin. Sapların üzerine bir kapak camı yerleştirin.

Mikroskobu başlatın ve gerekirse bacağın pozisyonunu ayarlayın. Mikroskop ayarları, kullanılan yazılıma bağlıdır. Daha fazla bilgi için lütfen protokole bakınız.

Verilerimiz, intravital mikroskopinin, küçük hayvan modellerinde kan akışı içinde nakledilen monositlerin görselleştirilmesi için güçlü bir araç olduğunu göstermektedir. Sistemik etkileri sürdürmek ve enjeksiyonun arteriyel sistemde yapılması durumunda oluşabilecek emboliyi önlemek için monositler venöz sisteme enjekte edilmelidir. Matrigel kullanılıyorsa, dispersiyonu önlemek için yavaşça enjekte etmek, daha ileri histolojik inceleme için plak eksplantasyonuna yardımcı olacaktır.

Matrigel plağı içinde, farklı deneysel ortamlarda kılcal damarları sayarak vaskülarizasyonu ölçebiliyoruz. İntravital mikroskopi bulguları histolojik inceleme ile doğrulanabilir. Tüm doku kesitlerinde intravital mikroskopi ile tespit edilen monositleri bulabiliyoruz.

Görüntülerin elde edilmesi için çok zaman gerekiyorsa, damar içindeki rodamin dekstran miktarı azalır. Damarların daha iyi görülebilmesi için, rodamin dekstran uygulaması tekrarlanmalıdır. Matrigel üzerindeki hücreler için pozitif probların kullanılması, optimum ayarların elde edilmesine yardımcı olabilir.

Periferik arter hastalığı veya iskemik kalp hastalığı terapötiklerinin amacı, hemodinamik darlığın neden olduğu diğer perfüze alanlara kan akışını arttırmaktır. Kollateral oluşumun uyarılması yoluyla monositle zenginleştirilmiş perfüzyon yoluyla hücre tedavisi, cerrahi endikasyonu olmayan hastalar için invaziv olmayan bir seçenektir. İskemik bölgelerde kollateral arterlerin gelişmesine ek olarak, monositler de tümörlerin büyümesini etkileyebilir.

Bu süreçleri araştırmak için, intravital mikroskopi ile bağlantılı olarak Matrigel enjeksiyonu kullanıyoruz. Bu protokol ile amacımız, iskeminin neden olduğu immünolojik süreçleri in vivo bir modelde incelemenin kolay ve verimli bir yolunu göstermektir. Bu yeni yöntemle, postmortem kas dokusunun histolojik incelemesine kıyasla daha gerçekçi bir test ortamı oluşturabiliyoruz.