Name: Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Öğrenin Streptococcus pneumoniae'den SP0092 karbonhidrat substrat bağlayıcı proteininin biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonunu. Bu yöntem, kristalleşme başarısını artırmak için tampon stabilite profilleri ve oligomerizasyon durumlarını belirlemenize yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Klonlama, Gemma Harris sn-alışveriş merkezleri ve beamlines I03 ve I04 elmas ışık kaynağında bilim adamları için'yardım OPPF-İngiltere anıyoruz.

Not: sinyal peptid silindi kodlama dizisi standart bir füzyon protokol sonrası pOPINF vektörde klonlanmış; yerli protein Escherichia coli BL21 Rosetta hücrelerdeki bir etiket onun füzyon olarak ifade 28 , 29. değişken etiketli selenomethionine üretici 30 göre standart yöntemleri aşağıdaki ifade edilir. SBP daha önce saflaştırılmış rekombinant 31 , 32 açıklanan.
 1. biyokimyasal karakterizasyonu <ol><li>termal kayması tahlil <ol><li>hazırlamak 48 tampon çözeltiler 4.0 arasında değişen pH 9,5 ve NaCl konsantrasyon için 0-0, 5 M ve açıklandığı gibi bir 96-şey plaka 40 µL dağıtmak Tablo 1 33.</li> <li>eklemek için 1-2 mg/mL konsantrasyonu SBP çözümün de 5 her µL.</li>
		<li>Eklemek için 20 x için (bkz: Malzemeler tablo) protein flüoresan leke de 5 her µL.</li>
		<li>Pipetting tarafından çözümleri karıştırmak, şeffaf yapışkan film kullanarak plaka mühür ve spin 112 x g oda sıcaklığında 2 min için.</li>
		<li>Deney gerçek zamanlı bir makinede çalıştırın: 99 ° C ile 10 s ayrı tutma zamanı için 4'ten 3 ° C/dak bir sıcaklık rampa ayarlayın ve floresan her 0,5 ° C uyarma, 483 nm ve emisyon 568, okumak nm.</li>
		<li>Analiz için erime sıcaklık (T m) türevi en az tanımlayan her arabellek durumuna Floresans emisyon eğrileri. 
		Not: Bu yordam protein istikrar düzelme yardım için en iyi arabellek çözüm iyi bir göstergesi verir. PH aralığı ve tuz konsantrasyonu yüksek T m ile arabellek durumuna göre seçim ve gliserol ve 0,5 mM, %2.5 (v/v) eklemek tris(2-carboxyethyl) aşağıdaki adımları (sn-tampon) için arabellek çözüm tanımlamak için fosfamin (TCEP).</li>
	</ol></li> <li>MALS ve analitik sn <ol><li>degassed filtrelenmiş su (kullanım geniş moleküler ağırlık 24 mL sütun) ile ambalajlı jel filtrasyon sütunun iki sütunlu cilt yıkama gerçekleştirmek.</li>
		<li>Sütun ışık saçılma bulmak-e doğru bağlamak ve termal üst karakter tahlil kararlı sn arabelleğinden sütunla equilibrate.</li>
		<li>5 mg/mL dengelenmiş sn sütun ve akış bir sütun hacmi sn-tampon içine, saflaştırılmış SBP enjekte 100 µL.</li>
		<li>Elüsyon Kromatografik tek veya birden çok tepeler için kontrol ve molar kütle ve tüm türler için polydispersity dizin edinme analiz yazılımı kullanarak saçılma verileri incelemek. 
		Not: bir oligomeric türlere karşılık gelen her zirve için polydispersity kontrol etmek yararlı olduğunu dizin hesaplanan molar kitle ağırlıklı molekülleri (Mw/Mn) sayısına kütle/azı kitle üzerinde ağırlıklı olarak. Polydispersity değeri 1 yakın bir monodispersed pik gösterir. 
		Not: Bütün Oligomerizasyonda türlerin tanımladıktan sonra daha yüksek konsantrasyonlarda daha büyük oligomer oluşumu lehine protein konsantrasyonu, bağımlılığını eğitim yararlı gibi.</li>
		<li>Yürütmek birden çok analitik sn çalıştırma; artan konsantrasyonları (0.1 - 10 mg/mL) dengelenmiş jel filtrasyon sütuna (kullanım geniş molekül ağırlığı 5 mL sütun), saflaştırılmış SBP 100 µL enjekte ve her zaman bir sütun birim sn-arabelleği akış.</li>
		<li>Elüsyon Kromatografik tek veya birden çok tepeler için kontrol ve 280 Absorbans Koyulukları çözümlemek için farklı başlangıç protein konsantrasyonları karşılık gelen eğrilerinin nm. Farklı doruklarına göreli yoğunluklarda sabit kalırsa, oligomeric türler arasında arası dönüştürme mevcut değildir. Farklı konsantrasyonlarda göreli Koyulukları içinde çeşididir şekilde protein konsantrasyonu bağlıdır farklı oligomeric türler arasında bir göstergesi. 
		Not: Bu karakterizasyonu hangi tür kristalizasyon için daha uygundur tanımlamak için temel adımdır. Gerçekten de, farklı monodispersed tür tanımlanmış bir konsantrasyon bir sabit oligomeric durumda olmaları durumunda kristalize daha yatkındır.</li>
	</ol></li></ol> 2. Protein hazırlık ve kristalizasyon <ol><li>partiye hazırlık sn <ol><li>bir tek sütunluk birimi sonra yıkama degassed süzülmüş suyla equilibrate sn-tampon ile (geniş bir Moleküler ağırlığı 120 mL partiye hazırlık ambalajlı jel filtrasyon sütun sütun).</li>
		<li>1-5 mL, 5-50 mg/mL saf SBP dengelenmiş jel filtrasyon sütun ve akış bir sütun hacmi sn-tampon içine enjekte.</li>
		<li>Sütun akışı aracılığıyla 1 mL kesirler toplamak.</li>
		<li>Bir tek monodisperse zirveye karşılık gelen kesirler havuz; 15 mL aralıklarla filtreleri 1.500 g de örnekte spin ve istenen konsantrasyonu elde kadar konsantrasyonu ölçmek (genellikle SP0092 için 50-100 mg/mL).</li>
	</ol></li> <li>Kristalizasyon <ol><li>kristalizasyon deney öncesi kristalizasyon Test üretici tarafından açıklandığı gibi kullanarak en iyi toplama aralığını belirlemek: <ol><li>besleme 0.5 - 1.0 mL her dört kristalizasyon testi 24-iyi oturan farklı bir rezervuar çözümlerinde kristalizasyon plaka bırakın.</li>
			<li>Protein çözüm 1 µL rezervuar çözüm 1 µL ile karıştırılarak kristalizasyon damla hazırlamak, plaka mühür ve oda sıcaklığında en az 1 (bir gecede kuluçka sonra daha güvenilir sonuçlar elde edilen) s için kuluçkaya.</li>
			<li>Kontrol damla kalite 10 x büyütme mikroskop kullanarak her yoğunlaşması. 
			Not: Test en az üç farklı protein konsantrasyonu: (I) açık kalan damla çoğunu belirtmek protein çok seyreltik kristalizasyon için; (II) damla çoğu ağır çökelti varlığı bir aşırı yüksek konsantrasyon anlamına gelir; ve (III) dengeli bir oluşum açık düþer ve çökelti (Eğer ışık daha iyi) test konsantrasyon kristalizasyon için olumlu olduğunu iyi bir göstergesidir.</li>
		</ol></li> <li>96-şey oturma inis kristalizasyon tabak hazir; her rezervuar iyi 34 , 35 , farklı ticari kristalizasyon çözeltinin 100 µL dağıtmak 36 , 37.</li> <li>dağıtmak 100 nL kristalizasyon Robotik sistem kullanarak tüm kristalizasyon damla Wells önceden tanımlanmış konsantrasyonu (Adım 1.1.6) adlı protein örneği.</li>
		Karşılık gelen kristalizasyon <li>dağıtmak 100 nL farklı baraj gölünün çözümler adım 2.2.3 reçete protein ile karıştırmak için kuyu bırak. Buharlaşma önlemek ve kristalizasyon damla ile havzanın denge etkinleştirmek için kristalizasyon plaka mühür.</li>
		<li>Kontrol damla düzenli olarak (başlangıçta her 1-2 günde, daha sonra her hafta) 10 x (en az) kullanarak kristal oluşumu ve büyüme değerlendirmek için büyütme mikroskobu. 
		Not: protein kristalizasyon için kullanılan için otomatik görüntüleme sistemi görselleştirme ve yakalama düşüyor.</li>
	</ol></li></ol> 3. Kristal karakterizasyonu ve x-ışını veri toplama <ol><li>kristal montaj <ol><li>hazırlamak cryoprotectant çözüm % 25'i (v/v) gliserol (son konsantrasyonu) ekleyerek (böylece ilk suda % 25'i yerine kristalizasyon durumuna karışımı) 38.</li>
		<li>Doldurmak bir köpük dewar sıvı azot ve yer dewar içine uni-Pak örnek muhafaza parçası ile. Sıvı azot sıcaklık için soğumasını bekleyin.</li>
		<li>Kes ve mühürleme teyp kristalizasyon plaka nerede kristalleri oluşan açılan kaldır.</li>
		<li>Bir damla hedef damla yakın konumlandırılmış bir coverslide üzerine cryoprotectant çözüm 1 µL yerleştirin.</li>
		<li>Seçili kristal bir manyetik değnek 39 , 40 üzerinde monte edilmiş bir omurga standart üsteki bir naylon cryo-döngü kullanarak cryoprotectant çözüm damla özgün damla--dan transfer.</li>
		<li>Hızlı bir şekilde kristal cryoprotectant damla--dan sıvı azot döngüsü uni-Pak örnek sahibi ilk boş pozisyon yerleştirerek, transfer.</li>
		<li>İstenen kristalleri hasat ve uni-Pak örnek tutucu içinde depolanan kadar (sızdırmazlık bandı kesme) tekrarlayın.</li>
		<li>Yer uni-Pak temel uni-Pak puck değnek kullanarak ve beamline (sıvı azot koşullarda) Pak almak. 
		Dikkat: Son derece düşük derece!</li>
		<li>Kullanmak cryo-maşa ve Pak dewar yükleme aracı uni yüklemek için-puck(s) beamline örnek değiştirici robot içine dewar. Uni-Pak örnek sahibi örnek döngü sahipleri örnek robotun içine dik bırakarak temel kapak üzerinden ayırmak dewar ve böylece sıvı nitrojeni maruz ve örnek değiştirici robot tarafından erişilmesini.</li>
	</ol></li> <li>Kristal karakterizasyonu Not: hasat kristaller daha sonra bir laboratuvar x-ışını kaynağı'nı kırınım kalitesi için veya bir sinkrotron radyasyon (SR) x-ışını kaynağı ekranlı. Makromoleküllerin kristalografisi (MX) beamlines yapı çözüm için anormal kırınım yararlanmak için ayarlanabilir enerji kaynağı sağlamak. Aşağıdaki bölümde, deneysel yetenekleri doğrultusunda çalışma talimatların elmas ışık kaynağı MX beamlines bir dizi teklif edilir ancak bu yönergeleri de MX beamlines, diğer synchrotrons dünya çapında adapte edilebilir.
	<ol><li>İlk adım olarak, onaylamak veya anormal scatterers kristal tanımlamak yararlıdır. Bu uygun bir x-ışını Floresans spektrum kristal üzerinden ölçerek elde edilebilir. İlk beamline x-ışını enerji tüm öğeler genellikle makromoleküllerin kristalleri için beklenen heyecanlandırmak için yüksek ayarlanır emin olun (14 keV veya daha yüksek).</li>
		<li>Örnek değiştirici robot tarafından monte edilebilir örnek seçmek için beamline kontrol yazılımı kullanın; döngü otomatik olarak x-ışını ışının içinde ortalanır ve kristal merkezleme beamline kontrol yazılımı kullanarak el ile onaylanabilir.</li>
		<li>Kayıt beamline kontrol yazılımı kullanarak bir x-ışını Floresans spektrum: kullanıcı bir çekim hızı seçer ve ölçüm başlatır (floresan/floresan spektrum ayarı, &#8594; koş, şekil 2A). Beamline kontrol yazılımı otomatik olarak Floresans dedektörü yerleştirin ve en az olay Floresans dedektörü okunabilir bir sinyal almak için x-ışını akı belirler X-ray konumlandırır. Edinsel spektrum sonra doğal olarak meydana gelen için donatılmış emisyon zirveleri ile otomatik bir biçimde analiz biyolojik öğeler. Bu yordamlar beamline kontrol yazılım grafik kullanıcı arabirimi (GUI) - GDA (www.opengda.org) Firmamız ve synchrotrons Europe 41 , 42 boyunca içinde kullanılabilir.</li>
		Eğer uygun öğeleri tespit <li>bu anormal kırınım deney için yararlanılabilir, kristal anormal kırınım veri toplama için en uygun dalga boyu belirlemek için bir x-ışını soğurma kenar enerji taraması gerçekleştirin: beamline tarihinde kontrol yazılımı, öğeyi seçin ve tarama başlatmak (floresan/floresan ayarı, inceden inceye gözden geçirmek &#8594; Atom adı, &#8594; koş, şekil 2B). 
		Not: bir tek anormal kırınım deneme için emme kenar zirvesine anormal saçılma en üst düzeye çıkarmak için kullanılır. Deneysel dikkat edilmesi gereken noktalar bir çok dalga boyu anormal kırınım deneyi gerçekleştirmek için daha önce ayrıntılı 43 olmuştur.</li>
		Kristal birim hücre parametreleri, simetri ve kırınım sınırı belirlemek için <li>salınım yöntemini kullanarak 45 ° aralıklarla üç x-ışını kırınım desen ölçmek (veri toplama/tarama &#8594; geçerli, koşmak Şekil 2C). Beamline kontrol yazılımı, salınım açısı ve çekim hızı ve röntgen ışını yüzdesi ayarlamak için yeteneği ile kullanıcıya sunar. Standart kristal tarama için 0.5°, bir çekim hızı 0.5 s ve % 5 x-ışını demeti iletim salınım açısı önerilir. Ölçülen kırınım görüntüleri EDNA boru hattı tarafından otomatik olarak analiz edilir ve stratejileri tam veri kümesi 22 topluluğu için bir dizi dönmek.</li>
	</ol></li> <li>X-ışını veri toplama Not: Kullanıcı standart salınım modu veya Friedel arkadaşları yakın zaman ve x-ışını doz ve yaklaşık aynı emme davranışı ile kayıt altına sağlar ters ışın modu verilerini toplamak üzere seçebilirsiniz anormal farklılıklar daha doğru bir ölçüm sağlar. İkincisi özellikle küçük anormal farklılıklar bekleniyor ve/veya örnekleri radyasyon hassas anormal kırınım deney gerçekleştirirken kullanışlıdır. En iyi veri toplama stratejileri kullanmak için önemli noktalara kapsamlı bir şekilde gözden geçirilmiş 22 , 23 , 44 , 45 olmuştur , 46 , 47. <ol><li>beamline kontrol yazılımı kullanarak içe aktarma veri koleksiyon parametrelerini sağlayacak strateji program tarafından önerilen: ı. ω-dönme ekseninin başlangıç konumunu II. Salınım genişliği ω-eksen dönme açısı için her kırınım görüntü III. Pozlama süresi her kırınım resim için IV. Sayı-in imge (dolaylı olarak toplam ω-eksen döndürme açısını tüm veri toplama için tanımlama) tam veri kümesi için aşırı pozlama ve radyasyon zarar görmemesi için x-ışını demetinin zayıflama yüzdesi v. Not: bizim kurumu için veri toplama çalışan, toplanan verilerin otomatik işleme için yazılım boru hatları iyi kurulmuş: (i) kırınım veri (dizin oluşturulmuş, tümleşik ve ölçekli) azalır xia2 boru hattı tarafından hangi kullanıcı için yansıma mtz dosyaları üretir aşamalı ve yapı çözüm/arıtma 48 için giriş olarak. (ii) ne zaman önemli bir anormal sinyal algılandığında veri çözümlemesi sırasında SHELX kullanarak bir ilk hızlı otomatik yapı çözüm boru hattı (fast_ep) ağır atom altyapı deneysel çözmeye çalışır phasing, aşamalı elektron yoğunluğu harita sağlayan nerede mümkün. Bir ikinci daha kapsamlı yapı çözüm boru hattı otomatik olarak çözmek ve structu inşa girişimleri taahhüt ederkullanarak bağımsız yazılım suites 49 , 50 , 51 , 52; Nerede bu başarılı olmadığı durumlarda, kullanıcı bir ilk model ve elektron yoğunluğu harita ile sağlanacaktır. Bu arıtma tamamlayıp modeli seçim crystallographic yazılım paketleri ile doğrulamak kullanıcı için temel sağlar.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu kağıt, açıklama ve karbonhidrat SBPs proteinler S. pneumoniaesayfasından belirli bir vurgu ile biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu için entegre bir iletişim kuralı doğrulama. Yine de, bu diğer SBPs farklı organizmalar üzerinden ve hatta diğer ilgisiz çözünür proteinler analizi için standart bir prosedür olarak kullanılabilir.
Protokol ilk bölümünü protein istikrar ve protein örnekleri hazırlanırken kristalizasyon yararlanan dördüncül yapı biyokimyasal bilgilerini sağlamaya odaklanmıştır. Termal kayması deneyleri bölümünde, biz sadece pH ve bu yordamı genel hükümlerini korumak için NaCl toplama varyasyon tanımlamak. Buna rağmen birçok diğer arabellek şartlar benzer bir şekilde, örneğin, herhangi bir kimyasal bileşik teskin katkı maddesi kullanılan da dahil olmak üzere test edilebilir: özellikle belirli bir SBP bağlamak gerçek ligand(s) Tartırmada son derece etkili m bir kaç santigrat derece31tarafından. Bazı durumlarda, denaturing eğriler kötü düşük sinyal veya protein toplama veya kısmi elinde tutmasına neden bir yüksek floresan arka plan nedeniyle tanımlanabilir. Bunu önlemek için bir protein: boya titrasyon belirsiz denaturing eğrileri en iyi duruma getirmek için gerçekleştirilebilir. Hiçbir gelişme edindiyseniz, protein kararlılığını iyileştirmek çeşitli katkı maddeleri eleme tavsiye edilir ve uygun ekranları yukarıda açıklanan54olmuştur.
Genellikle, çoğu SBPs doğal ortamlarında monomeric, ama burada gösterildiği multimerization kristalizasyon deneylerde kullanılan daha yüksek konsantrasyonlarda oluşabilir, böylece MALS ve SEC tarafından sağlanan Oligomerizasyonda davranış karakterizasyonu kristalizasyon için en uygun istikrarlı monodisperse Oligomerizasyonda durumunu değerlendirmek için gerekli. Bununla birlikte, farklı kimyasallar proteinler Oligomerizasyonda davranışı üzerinde kristalizasyon koşul dahil etkisini tahmin etmek zordur. SN ve MALS muayene protein örneği kapsamlı toplama gösteriyorsa, bu oluşma olasılığını azaltmak için aşağıdaki tavsiye ederiz: taze protein örneği (değil donma çözdürülen) kullanmak ve termal ile gerçekleştirilen sabitleme analiz genişletin shift deneyleri, olası katkı maddeleri ve hafif deterjanlar son bir kaynak olarak toplama en aza indirmek için test. Bu yazıda, bu protokol genel hükümlerini korumak için yüksek üretilen iş seyrek matris ticari kristalizasyon tarama kullanarak kristalizasyon için temel kuralları tanıtacağız. Ancak, yüksek çözünürlüklü x-ışını kırınım protein kristalleri elde etme kristalizasyon koşulları precipitant konsantrasyonu, pH, kimyasal katkı maddeleri, farklı sıcaklıklarda, ilavesi ile ilgili olarak en iyi duruma getirmek için yinelemeli ince ayar gerekir ve diğer kristal damla ve rezervuar16,17arasında değişen denge dynamics faktörler.
Protokolünün ikinci parçası üzerinde üzgün phasing için anormal veri edinimi x-ışını kırınım veri koleksiyonu belirli bir odak için en iyi strateji tanımlamak için protein kristalleri karakterizasyonu açıklar. SBPs benzer bir genel yapısı korumak (ve potansiyel olarak kullanılabilir modeller başlangıç olarak yatırılan 3D modellerinden olsa bile), bu Proteinlerin moleküler değiştirme yöntemi tarafından aşamalı her zaman değişkenlik nedeniyle basit değil İkincil yapı elemanları ve bu proteinlerin iç esneklik. Bu nedenle, biz üzgün yöntemi teklif ve bu proteinler zaten özünde metaller veya gerçekten özel bağlama metallerin anormal diffracting öğeleri bir dizi sağlayabilir kristalizasyon arabellek koşullar bağlı olduğunu vurgulamak bir bizim genel iletişim kuralı standart adımda.
Sonuç olarak, bu iletişim kuralı bir standart güdümlü iş akışı yanı sıra yapı belirlenmesi başarı oranını artırmak hızlandırmak için istismar SBPs biyokimyasal ve yapısal özellikleri ayrıntılı açıklamasını sağlayan yordamlar tanımlar SBPs yapısal karakterizasyon genel olarak.

S. pneumoniae (pnömokok) olduğunu asymptomatically neden otitis, septisemi, pnömoni, sepsis normalde steril nişler geçirmek için yeteneği ile insan solunum yolu üst solunum yolları içinde bulunan gram-pozitif bir bakteri ve Menenjit1,2. Ayrıca, pnömokok enfeksiyonu bir klinik ve ekonomik yük dünya çapında3,4' e katkıda bulunan topluluk edinilen pnömoni önde gelen nedenidir. Antibiyotik dirençli S. pneumoniae suşları dünya genelinde yayılmış ve yedi valent ve on üç-valent pnömokok protein eşlenik aşı yardımcı oldu rağmen antibiyotik direnci, yedek suşları oranını azaltmak aşı kullanımı ortaya çıkmıştır ve araştırma için artan talepleri pnömokok hastalığı5,6,7,8için yeni tedavilerin geliştirilmesi içine açmıştır.
Pnömokok ev sahibi bir karbon kaynağı9,10olarak alınan şeker bağlıdır; Gerçekten de onun alma makine taşıma 32 farklı karbonhidrat11,12,%1330'u ayırıyor. Bu ithalatçılar en az sekiz ABC-taşıyıcı13içerir. ABC Taşıyıcılar hücre dışı SBPs ligand için özgüllük belirleme ve hücre alımı için integral membran taşıyıcı için sunma temel bir rol oynar. Çünkü onlar yüzey proteinleri ve hücresel onların önemli rol SBPs yeni aşılar ve antimicrobials tasarımı için geçerli hedefler temsil eder.
Hedef protein karakterizasyonu ve ligand cepler ve etki alanları arasında esneklik gibi yapısal özellikleri ayrıntılı bir açıklama yararlı bir araç için uyuşturucu yapısı tabanlı tasarım14,15sağlar. X-ışını kristalografisi atomik çözünürlük yakın proteinlerin yapısal karakterizasyon için seçim yöntemi, ama kristalizasyon işleminin öngörülemeyen, zaman alıcı ve her zaman başarılı değil. Gelişmiş sistematik yöntemlerle başarı oranı ve örnek kalite ve istikrar önemli faktörlerdir. Kristalizasyon başarı oranını içindeki protein kimyasal özellikleri ve örnek hazırlama yöntemleri tarafından etkilenir. Bunlar etkisini değerlendirildi ve biyokimyasal karakterizasyonu16,17tarafından haberdar.
Bir başka komplikasyon yapısı tabanlı tasarımı için ele alınması gereken crystallographic faz sorun. Gibi daha fazla protein yapıları kullanılabilir, birçok yapılar homolog yapısı18gerektirir moleküler değiştirme yöntemi tarafından çözülebilir. SBPs esnek etki alanı yapısı sunmak, moleküler değiştirme de zorlu19olabilir. Hedef protein için yeterince benzer bir yapısal model kullanılabilir değilse, bir takım teknikler deneysel aşamalı20almak için kullanılabilir. Bunlar arasında tek dalga boyu anormal dağılımı (SAD) yöntemi birincil tekniği ortaya çıkmıştır ve yoğun faz sorun21çözmek için kullanılan. ÜZGÜN yönteminin kullanımı daha fazla donanım ve yazılım gibi algılama ve22,23, phasing için zayıf anormal sinyallerin kullanım izin vermek için veri toplama stratejileri geliştirmeleri ile gelişmiş 24. yapıları oluştururlar, hangi kırınım veri atomik çözünürlükte gerekli, geçmişte şimdi programda uygulanan olarak stereochemical bilgi Örneğin, birleştirerek yararlı olabilir için Ayrıca, doğrudan yöntemlerdeki gelişmeler ARCIMOLDO25. Kristalografi faz problem çözme yöntemleri yararlı bir daha gözden geçirme Taylor26tarafından verilir.
Burada karbonhidrat taşıma SBP, SP0092 S. pneumoniae, karakterizasyonu için ayrıştıran bir protokol biyokimyasal ve yapısal teknikleri (şekil 1) entegre mevcut. Bu adım adım iletişim kuralı hayat tüm Krallık içinde bulunan genel olarak, SBPs üzerinde yapısal çalışmaların başarı oranını artırmak için stratejiler yararlı örnek test olgusu sağlar. Özellikle, protokol hızlı ve etkili bir yöntem çözümde protein en istikrarlı oligomeric durumunu karakterize önemini vurgular ve kristalizasyon deneyler için takip etmek için en iyi tür tanımlamasını sağlar. 500'den fazla SBP yapıları içinde Protein veri Bankası27rapor olsa da, moleküler yedek bir menteşe bölgesi19tarafından bağlı iki α/β etki alanı doğal esnek yapısı nedeniyle zor olabilir. Böylece, iletişim kuralının ikinci bölümü, üzgün phasing üzgün yöntemiyle ilişkili metal iyonları SBPs ortak yanı sıra selenomethionine birleşme ve selenyum (Se) kullanımı olan phasing için açıklar.

<table><tbody><tr><td>SelenoMetionin Ortamı Tam</td><td>Moleküler Boyutlar</td><td>MD12-500</td><td>L-metiyonin hariç glikoz, vitaminler ve amino asitlerle desteklenmiş sentetik bir M9 minimal ortamına dayanmaktadır. Diğer eşdeğer ürünler, diğer şirketler tarafından ticari olarak temin edilebilir.</td></tr><tr><td>MicroAmp Optik 96 Kuyulu plaka</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4306737</td><td>Uygulamalı Biyosistemler MicroAmp Optik 96 Kuyulu Barkodlu Reaksiyon Plakası, hızlı, verimli PCR amplifikasyonu için eşsiz sıcaklık doğruluğu ve homojenliği sağlamak üzere optimize edilmiştir. 96 oyuklu formatta tek bir sert polipropilen parçasından yapılan bu plaka, Applied Biosystems&reg; 96 Kuyulu Gerçek Zamanlı PCR sistemleri ve termal döngüleyiciler.</td></tr><tr><td>SYPRO Turuncu Moleküler</td><td>Problar</td><td>S6651</td><td>SYPRO Turuncu Protein Jel Lekesi, 1D jellerdeki proteinler için hassas, kullanıma hazır bir floresan boyadır. Hidrofobik bölgeler için oldukça evrensel ve köklü bir protein boyası.</td></tr><tr><td>MicroAmp Optik Yapışkan film</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4311971</td><td>Uygulamalı Biyosistemler MicroAmp Optik Yapışkan Film, bir mikroplakaya uygulandığında kuyudan kuyuya kontaminasyon ve numune buharlaşması olasılığını azaltır. Düşük arka plan sağladığı için optik ölçüm için idealdir.</td></tr><tr><td>7500 Hızlı Gerçek Zamanlı PCR Sistemi</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4362143</td><td>Uygulamalı Biyosistemler 7500 Hızlı Gerçek Zamanlı PCR Sistemi, standart 96 kuyulu formatta yüksek hızlı termal döngü sağlayarak kantitatif gerçek zamanlı PCR uygulamaları için çalışma sürenizi önemli ölçüde azaltır ve yaklaşık 30 dakika içinde sonuç verir. Yükseltme Kiti, standart bir 7500 Gerçek Zamanlı PCR Sistemini bir saha servis kurulumu aracılığıyla Hızlı Yapılandırmaya yükseltmek için kullanılabilir. Diğer RT-PCR makinesi kullanılabilir. Eski veri analiz yazılımı için veri aktarımı kolay değil.</td></tr><tr><td>Superdex 200 artış 10/300 GL sütunu</td><td>GE Sağlık</td><td>28990944</td><td>Superdex 200 Artış 10/300 GL, küçük ölçekli (mg) hazırlayıcı saflaştırmada boyut dışlama kromatografisinin yanı sıra antikorlar gibi moleküler ağırlıkları 10.000 ile 600.000 arasında olan proteinlerin karakterizasyonu ve analizi için çok yönlü, önceden paketlenmiş bir sütundur. Yüksek çözünürlüklü biyofiziksel teknikler için ideal optimum ayırma.</td></tr><tr><td>DAWN HELEOS II</td><td>Wyatt</td><td></td><td>DAWN HELEOS II, çözeltideki makromoleküllerin ve nanopartiküllerin molar kütlesinin ve boyutunun mutlak karakterizasyonu için önde gelen Çok Açılı statik Işık Saçılımı (MALS) dedektörüdür. DAWN, en yüksek hassasiyeti, en geniş moleküler ağırlık, boyut ve konsantrasyon aralığını ve gelişmiş yetenekler için en geniş konfigürasyon seçimini ve isteğe bağlı modülleri sunar. Wyatt dışındaki diğer şirketlerin diğer MALS algılama sistemleri test edilmemiştir, bu nedenle ek geri bildirim sağlanamaz.</td></tr><tr><td>Superdex 200 5/150 GL</td><td>GE Sağlık</td><td>28906561</td><td>Superdex 200, biyomoleküllerin yüksek çözünürlüklü, küçük ölçekli hazırlayıcı ve analitik ayrımları için önceden paketlenmiş boyut dışlama kromatografi kolonlarıdır. Superdex 200, moleküler ağırlıkları 10.000 ile 600.000 arasında olan moleküller için bir ayırma aralığına sahiptir. Tepe ayrımı, "artış" versiyonu kadar optimal değildir, ancak bu model standart günlük kullanım için idealdir.</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 hazırlık sınıfı, yüksek çözünürlüklü hazırlayıcı jel filtrasyon kromatografisi için tasarlanmış önceden paketlenmiş XK kolonlarıdır.</td></tr><tr><td>24 Kuyulu "Büyük" Oturan Damla Kristalizasyon Plakası</td><td>MiTeGen</td><td>XQ-P-24S-A</td><td>24 kuyulu "büyük" kristalizasyon plakası, esas olarak oturarak damla buhar difüzyon teknikleri ile protein kristali taraması ve kristalleşme koşulu optimizasyonu için kullanılır. Oldukça büyük bir rezervuar kuyusuna ve numune kabına sahiptir, bu da manuel kullanımı ve büyük boyutlu protein kristali büyümesini destekler. Ek olarak, düz yüzeyleri şeffaf bant veya lamel ile kolayca kapatılabilir.</td></tr><tr><td>PCT Ön Kristalizasyon Testi</td><td>Hampton</td><td>HR2-140</td><td>PCT Ön Kristalizasyon Testi, kristalizasyon taraması için uygun protein konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>96 Kuyulu CrystalQuick</td><td>Greiner bio-one</td><td>6098xx</td><td>Kare kuyulu plakalar, rezervuar başına üç kristalizasyon kuyusuna sahiptir, bu da plaka başına 288 numunenin test edilmesini mümkün kılar. Genellikle sadece ilk tarama için kullanılır, çünkü kare kenarları kristallerin avlanmasını zorlaştırır.</td></tr><tr><td>Uni-Puck</td><td>Moleküler Boyutlar</td><td>MD7-601</td><td>Evrensel V1-Puck (Uni-puck), dünya çapındaki otomatik numune montaj sistemlerinin çoğuyla kullanım için bir numune pimi saklama ve nakliye konteyneridir - diğerlerinin yanı sıra ACTOR, SAM ve CATS sistemlerini içerir (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI ve ABD genelinde)</td></tr> <tr><td>Standart Köpük Dewar</td><td>Moleküler Boyutlar</td><td>MD7-35</td><td>5.7" çap ve 2.8" derinliğinde. 800mL kapasite.</td></tr><tr><td>Monte Edilmiş CryoLoop - 20 mikron</td> çapında naylon ile 20 mikron <td>Hampton</td><td>HR4-955</td><td>Monteli CryoLoops. Bu naylon halkalar içi boş, paslanmaz çelik MicroTubes & trade'e bağlanır; kriyokristalografik prosedürler ve X-ışını veri toplama sırasında kristali monte etmek, dondurmak ve sabitlemek için kullanılanlar. Farklı boyutlar mevcuttur ve uzunlukları uyarlanabilir. Oldukça çok yönlü araçlardır.</td></tr><tr><td>CryoWand</td><td>Moleküler Boyutları</td><td>MD7-411</td><td></td></tr><tr><td>Disk dewar yükleme aleti</td><td>Moleküler Boyutlar</td><td>MD7-607</td><td>Bu alet, tek diskleri ayırmak ve bunları robot dewar'a yüklemek için kullanılır. Teflon boru kısmı ve metal çubuk kısmı olmak üzere iki parçadan oluşur.</td></tr></tbody></table>

karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein sp0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Yeni antimicrobials ve aşı geliştirilmesi Streptococcus pneumoniae (pnömokok) için çoklu dirençli suşların hızlı artış durdurmak gerekli. Karbonhidrat substrat proteinler (SBPs) protein bazlı aşılar ve yeni antimicrobials geliştirilmesi için uygun hedefler nedeniyle ekstrasellüler onların Yerelleştirme ve pnömokok metabolizması için karbonhidrat alma merkezi temsil etmek, anılan sıraya göre. Burada açıklanan SP0092, pnömokok ve diğer bakteriler diğer karbonhidrat SBPs uzatılabilir kapsamlı bir karakterizasyonu gerçekleştirmek için entegre bir ayrıştıran protokoldür. Bu yordamı inhibitörleri bu sınıfın proteinlerin yapısı tabanlı tasarımı yardımcı olabilir. Sunulan bu yazının ilk bölümünde termal üst karakter tahlil göre biyokimyasal analiz için kurallarıdır, çok ışık saçılma (MALS) açı ve dışlama Kromatografi (sn), hangi istikrar optimize boyutu ve örnek polimerlerin yönelik kristalizasyon denemeler ve bu yüzden başarı geliştirin. Bu yordamı ikinci bölümü kristalize protein çözümlemek için kullanılan ölçüm verileri için ayarlanabilir dalga boyu anormal kırınım sinkrotron beamline ve veri koleksiyon iletişim kurallarını kullanma SBP kristalleri karakterizasyonu açıklar yapısı.

Bu tümleşik iletişim kuralı dört ile başarılı olmak için kanıtlanmıştır (iki yayınlandı ve iki yapıları yayımlanmamış) pnömokok bağlayıcı protein hedefler altı karbonhidrat analiz32,53bugüne kadar. Bu bölümde, biz SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyon SBPs yapısal çalışmaların genel rehberlik için temsil edici bir sonucu olarak mevcut.
Sonra SBP SP0092 ifade edilen ve daha önce32tanımlandığı gibi saf saf protein termal üst karakter tahlil kullanarak arabellek istikrar için analiz edildi: SP0092 sergileyen bir artan Tm pH 6,5 NaCl varlığında 0 - 0.2 M konsantrasyon aralığı (şekil 3A). Bunun ışığında, aşağıdaki adımları için arabellek çözüm olarak tanımlanmıştır: 0,02 M MES pH 6.5, 0.2 M NaCl, %2.5 (v/v) gliserol, 0,5 mM TCEP. SP0092 farklı Oligomerizasyonda durumları mutlak molar kütlesi tetrameric, trimeric, dimerik ve monomeric türleri için karşılık gelen 187.2, 140.8, 97.0 ve 49,4 kDa, moleküler ağırlık ölçme sn birleştiğinde MALS tarafından ölçüldü () sırasıyla Şekil 3B). Farklı protein dilutions sn profilde analizini artan protein konsantrasyonu, daha büyük reaksiyonlar genellikle kullanılan daha yüksek konsantrasyonlarda daha kararlı olduğunu düşündüren Oligomerizasyonda tetiklediği saptandı kristalizasyon. Nitekim, saflaştırılmış büyük oligomeric türler kristalizasyon denemeler için yönetmen başarıyla üretilen protein kristalleri tür did değil monomer tamamlayın.
En iyi duruma getirilmiş kristalleri yerli elde edilen ve Se-metiyonin SP0092 türlü etiketli x-ışını kırınım tarafından karakterize. Bu kristaller gelen x-ışını Floresans ölçümü Se beklendiği gibi sadece Se-metiyonin kristalleri için algılandı ise protein, bağlanan Zn için emisyon tepeler her iki durumda da ortaya koydu. Hangi olay x-ışını dalga boyu ilgili x-ışını soğurma kenarlarına Zn veya Se ayarlamak için doğrudan deneysel veri kristallerin anormal sinyal en üst düzeye çıkarmak için mevcut sağlanan x-ışını soğurma taramaları Se ve Zn kenarlarında sonra gerçekleştirilen Sonuç veri (şekil 4A-B) üzerinden elde edilebilir.
Düşük iletim adlı üç kırınım şablonlarını ölçmek sonra tam bir anormal veri kümesi EDNA (şekil 4 c) tarafından önerilen veri toplama stratejisini kullanarak elde edildi. Anormal sinyal mevcut otomatik aşamalı boru hattında alt yapısını belirlemek için beamline tetikler ve elde edilen ilk deneysel aşamalarında dayanan, üreten ilk haritalar ve sonra rafine ve doğrulanmış modelleri (şekil 4 d ).
Özet olarak, olası tehlikelere tekniği öncelikle kristal mevcudiyeti ve kalitesinden ortalanır. Optimizasyon protein kararlılığınızı geliştirmek için arabellek koşulların yanı sıra protein çözümde, birden fazla oligomer tanımlandığında kullanılacak en uygun oligomeric durumunu tanımlaması kristalizasyon başarısızlık riskini azaltabilir sahne. Erken bir aşamada teşhis ilişkili metal iyonları kullanımı istismar yapı çözüm kadar hız ve moleküler değiştirme yöntemleri başarısız olduğunda protein etiketli selenomethionine gereksiz üretimini önlemek.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig1.jpg"> 
Şekil 1. Karbonhidrat SBPs biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu için iş akışı diyagramı. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig2.jpg"> 
Şekil 2. Kristal karakterizasyonu GDA içinde. (A)GDA beamline kontrol yazılımı x-ışını Floresans denetimi sekmesindeki ekran görüntüsü. (B) GDA x-ışını enerji kenar-tarama denetimi sekmesinde ekran görüntüsü. (C) GDA veri toplama kristal tarama sekmesinde ekran görüntüsü. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig3.jpg"> 
Şekil 3. SP009239-491biyokimyasal karakterizasyonu. (A)3D-Yüzey grafiği pH bir fonksiyonu ve arabellek çözüm NaCl konsantrasyonu SP009239-491 erime sıcaklığı komplo. (B) sn ve MALS sonuçları için SP009239-491. Emme 280 nm mavi renkle gösterilir. Farklı Oligomerizasyonda Birleşik molar kitlelerin kırmızıyla gösterilir. Paneli (B)32değiştirildi. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig4.jpg"> 
Şekil 4. SP009239-491yapısal karakterizasyonu. (A)ve (B) x-ışını soğurma enerji Zn ve Se kenarına SP009239-491 kristalleri için tarama. Zn ve kristalleri içeren Se ölçülen Floresans gösterilen mavi ve mavi, hesaplanan f' ve f "anormal saçılma kesirler are yeşil ve kırmızı, anılan sıraya göre. X-ışını kırınım şablon örnekleri (C) SP009239-491 kristalleri toplanan. (D) Cartoon SP009239-491 dimer yapısı gösterimi. Bir protomer renkli beyaz ve diğer macenta (artıkları 39-366) ve violet (artıkları 367-491), ve anormal saçılma atomları mavi ve mavi topları Zn ve Se, sırasıyla gösterilir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0,1 M sitrik asit pH 4.0</td>
			<td>0,1 M sitrik asit pH 4.5</td>
			<td>0,1 M fosfat pH 5,0</td>
			<td>0,1 M sitrat pH 5.5</td>
			<td>0,1 M Bis-tris pH 6</td>
			<td>0,1 M ADA pH 6,5</td>
			<td>0,1 M BEZLERİ pH 7</td>
			<td>0,1 M HEPES pH 7.5</td>
			<td>0,1 M Imidazole pH 8.0</td>
			<td>0,1 M Tris pH 8,5</td>
			<td>0,1 M CHES pH 9</td>
			<td>0,1 M CHES pH 9,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0 M</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
</tr></tbody></table>			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
		
		<tr>
			<td>NaCl 0.1 M</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.2 M</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,5 M</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
		</tr>
	

Tablo 1. Termal üst karakter tahlil için arabellek oluşturma.

Karbonhidrat substrat bağlayıcı protein geniş bir biyokimyasal ve yapısal karakterizasyon Streptococcus pneumoniae gerçekleştirmek için akıcı bir protokol sunulmuştur.

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Bu prosedürün genel amacı, streptococcus pneumoniae'den elde edilen bir karbonhidrat substrat bağlayıcı proteinin biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonudur. Bu yöntem, tampon stabilite profillerinin, oligomerizasyon durumlarının ve atomik yapıların tanımlanması gibi substrat bağlayıcı proteinin öğretim çalışmalarına yardımcı olmak için temel verilerin sağlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedürün avantajları, substrat bağlayıcı proteinler için kristalizasyon ve yapı çözeltisinin başarı oranını sağlam ve basit bir şekilde artırabilecek veriler sağlamasıdır.İlk olarak, pH aralığı 4.0 ila 9.5 arasında ve sodyum klorür konsantrasyonları sıfır ila 0.5 molar arasında değişen 48 tampon çözeltisi hazırlayın. Her çözeltiden 40 mikrolitreyi 96 oyuklu bir plakaya dağıtın. Seçilen substrat bağlayıcı proteinin saflaştırılmış bir çözeltisini elde edin.Mililitre başına bir ila iki miligramlık bir konsantrasyon için her bir oyuğa beş mikrolitre SBP çözeltisi ekleyin. Daha sonra her bir oyuğa 20 kez konsantre floresan lekesinden beş mikrolitre ekleyin. Çözeltileri yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.Plakayı şeffaf yapışkan film ile kapatın. Plakayı oda sıcaklığında 112 kez G'de iki dakika santrifüjleyin. Gerçek zamanlı bir PCR sistemini, 10 saniyelik bir tutma süresiyle dakikada üç derece hızında dört santigrat dereceden 99 santigrat dereceye çıkacak şekilde yapılandırın.Sistemi her yarım derecede bir floresan okumaları alacak şekilde ayarlayın. Floresan filtre ayarını yapın. ve örnekleri atayın.Deneyi çalıştırın ve en yüksek erime sıcaklığına sahip tampon durumunu belirleyin. Daha sonra, hacimce% 2.5 gliserol ve 0.5 milimolar TCEP konsantrasyonu içeren seçilen pH ve sodyum klorür konsantrasyonuna sahip bir tampon hazırlayın. Saflaştırılmış SBP'yi, çok açılı ışık saçılımına sahip analitik boyut dışlama kromatografisi ile karakterize edin.Kristalleşme için uygun olan en kararlı türleri belirleyin ve bu türlerin saf fraksiyonlarını elde etmek için hazırlık SEC'yi kullanın. Kristalizasyon için en uygun protein konsantrasyonunu belirlemek için ön kristalizasyon testleri yapın. İstenen ticari kristalizasyon çözeltilerini optik 96 kuyulu bir oturma damla plakasının çözelti rezervuarlarına dağıtmak için bir kristalizasyon robotik sistemi kullanın.Daha sonra sistemi, her kristalizasyon damlasına 100 nanolitre protein çözeltisi dağıtmak için kullanın. Her kristalizasyon çözeltisinin 100 nanolitresini rezervuar kuyularından ilgili kuyu damlalarına aktarın. Plakayı optik yapışkan film ile kapatın.İki hafta boyunca her bir ila iki günde bir ve daha sonra haftada bir kez kristal oluşumunu ve büyümesini değerlendirmek için bir mikroskop veya otomatik görüntüleme sistemi kullanın. Yeterince büyük ve iyi şekillendirilmiş kristaller oluştuğunda, kriyoprotektan olarak hizmet etmek için hacimce %25 ek gliserol içeren bir kristalizasyon çözeltisi partisi hazırlayın. Ardından, bir köpük dewar'ı sıvı nitrojenle doldurun.Emici bir numune muhafazasını sıvı nitrojenin içine daldırın ve muhafazanın soğumasını bekleyin. Ardından filmi, ilgi kristali içeren bir damlanın üzerine kesin. 0.5 mikrolitre kriyoprotektanı, damlaya yakın bir kapak sürgüsüne veya varsa aynı durumdaki boş bırakma haznesine bırakın.Manyetik bir çubuğa, SPINE standart tabanına monte edilmiş bir kriyoloop'u takın. İlgilenilen kristali kriyoprotektan damlasına aktarmak için kriyo döngüsünü kullanın. Ardından, kristali kriyoprotektan suya batırılmış unipuck numune muhafazasının ilk boş konumuna aktarmak için kriyoloop'u kullanın.Ek kristaller elde etmek için bu işlemi tekrarlayın. İlgilenilen tüm kristaller numune muhafazasına yüklendikten sonra, çözülmüş taban plakasını muhafazaya yerleştirmek için disk çubuğunu kullanın. Sıvı nitrojen içindeki unipuck'ı ışın hattına taşıyın.Çözünmeyi ışın hattı numune değiştirici dewar'a yüklemek ve numune muhafazasını çıkarmak için kriyo maşası ve bir disk dewar yükleme aleti kullanın. Ardından, numuneyi yüklemek ve otomatik olarak x-ray ışınında ortalamak için beamline yazılımında numuneyi seçin. Bir x-ışını floresan spektrumu edinin ve anormal bir kırınım deneyinde kullanılabilecek herhangi bir elementi tanımlayın.Bir x-ışını absorpsiyon kenarı enerji taraması gerçekleştirerek anormal kırınım verilerini toplamak için en uygun dalga boyunu belirleyin. Ardından, kristal birim hücre parametrelerini, simetriyi ve kırınım sınırını otomatik olarak belirlemek için standart salınım modunda 45 derecelik aralıklarla üç x-ışını kırınım modeli elde edin. Önerilen veri toplama parametrelerini ışın hattı yazılımına aktarın ve uygun şekilde tek veya çok dalga boylu anormal bir kırınım deneyi çalıştırın.Substrat bağlayıcı protein SP0092'nin çeşitli tuz tamponlarındaki stabilitesi, optimal tampon çözeltisini belirlemek için değerlendirildi. En yüksek erime sıcaklıkları, pH'ı 6.5 olan tamponlar ve sıfır ila 0.2 molar arasında değişen sodyum klorür konsantrasyonları için bulundu. Prosedür için pH değeri 6.5 ve sodyum klorür konsantrasyonu 0.2 molar olan bir tampon seçildi.SP0092'nin çeşitli oligomerizasyon durumları tanımlandı ve SEC-MALS ile ayrıldı. Farklı protein konsantrasyonlarında SEC profilinin analizi, artan protein konsantrasyonunun oligomerizasyonu tetiklediğini gösterdi, bu da daha büyük oligomerlerin yüksek konsantrasyonlarda daha kararlı olduğunu düşündürdü. Bununla tutarlı olarak, büyük oligomerler kristalleşme denemelerinde kristaller üretirken, monomer üretmedi.Hem doğal hem de selenometiyonin etiketli SP0092 kristallerinin X-ışını floresansı, her iki formda da proteine bağlı çinkoyu gösterdi. Anormal sinyal, gelen x-ışını dalga boyunun çinko veya selenyumun x-ışını absorpsiyon kenarlarına ayarlanmasıyla maksimize edildi. Daha sonra tam bir anormal veri seti elde edildi ve anormal bir sinyalin varlığıyla tetiklenen otomatik analiz, protein yapılarının ilk haritalarını oluşturdu.Bu ilk haritalara yerleştirilen modeller daha sonra nihai modelleri üretmek için rafine edildi ve doğrulandı. Bu videoyu izledikten sonra, bir substrat bağlayıcı proteinin veya herhangi bir potansiyel protein hedefinin kapsamlı bir yapısal karakterizasyonunun nasıl tamamlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu tekniğin etkileri, bu protein sınıfı için inhibitörlerin yapıya dayalı tasarımı için temel bilgiler sağladığından, mirokok hastalığı için yeni terapötiklerin geliştirilmesine doğru uzanır.Bu yöntemler aynı zamanda diğer organizmalardan substrat bağlayıcı proteinlere de uygulanabilir ve potansiyel olarak herhangi bir protein türü için kullanılabilirler.

biochemical-structural-characterization-carbohydrate-transport

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) gerçek zamanlı biyomoleküler etkileşimlerini tespit etmek için bir etiket içermeyen bir yöntemdir. Burada, bir membran proteini için bir protokol: tekniğin artılarını ve eksilerini tartışırken reseptör etkileşimi deney, tarif edilmektedir.

Membran Protein Gerçek zamanlı ölçümler: Reseptör Etkileşimleri Yüzey Plazmon Rezonans Kullanma (SPR)

Küçük ölçekte mikrobiyal ekzopolisakkaritlerin tanımlanması ve karakterizasyonu için otomatikleştirilmiş modüler yüksek verimli bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, yeni izole edilen bakteri suşlarının veya tüm suş koleksiyonlarının hızlı bir şekilde taranmasını sağlamak için salgılanan polisakkaritlerin toplam miktarını ayrıntılı bir karbonhidrat parmak izi ile analiz etmek için hızlı bir ön seçimi birleştirir.

Otomatik Modüler Yüksek Verimli Ekzopolisakkarit Tarama Platformu Oldukça hassas Karbonhidrat Parmak İzi Analizi ile birleştiğinde

Biz glikoproteinlerin biyofiziksel ve yapısal karakterizasyonu için yaklaşımlar ile immünglobulin kat biolayer Interferometry, izotermal titrasyon Kalorimetre ve x-ışını kristalografisi tarafından mevcut.

X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

Burada sunulan protokol, bölünmüş lusiferaz kompleman testinin en son varyantını kullanarak, canlı memeli hücrelerinde sitoplazmik olarak maruz kalan N- ve / veya C-termini ile Golgi-yerleşik tip III membran proteinleri arasındaki heterolog etkileşimlerin oluşumunu göstermeyi amaçlamaktadır.

Golgi-Resident Tip III Membran Proteinleri tarafından oluşturulan Heterolog Komplekslerin Bölünmüş Luciferaz Komplemantasyon Testi Kullanılarak Gösterilmesi

Bu makalede, Saccharomyces cerevisiae'de aşırı ifade edilen Candida albicans ABC (ATP bağlayıcı kaset) protein Cdr1'in karakterizasyonu için küçük ölçekli bir plazma membran izolasyon protokolü sunulmaktadır. Cdr1 ile etiket arasında 16 kalıntılı bağlayıcı bulunan proteaz-bölünebilir C-terminal mGFPHis çift etiket, Cdr1'in saflaştırılmasını ve deterjan taramasını kolaylaştırmak için tasarlanmıştır.

Candida albicans Cdr1-mGFPHis Analizi için Küçük Ölçekli Plazma Membran Hazırlama

Açık arama, daha önce bilinmeyen glikan bileşimleriyle süslenmiş glikopeptidlerin tanımlanmasını sağlar. Bu makalede, Acinetobacter baumannii'yi model olarak kullanan bakteriyel örnekler için açık arama ve müteakip glikan odaklı glikopeptid aramaları yapmak için kolaylaştırılmış bir yaklaşım sunulmuştur.

Acinetobacter baumannii O-bağlantılı Glikopeptitlerlerin Tanımlanması için Açık Arama Tabanlı Yaklaşımların Uygulanması

Mevcut protokol, HA, S glikoproteini, ilgili hibrid tip glikanlar ve yüksek mannoz oligosakkaritlerine CV-N bağlanmasını incelemek için SPR bağlanma testleri için yeni araçları açıklamaktadır. SPR, bu glikanlara dimerik veya monomerik CV-N'yi bağlamak için KD'yi belirlemek için kullanılır.

Yüzey Plazmon Rezonansı ile Antiviral Ajanların Mühendisliği

Bu yöntem, glukan fosfataz ve amilopektinin bağlanma afinitesini ölçmek için lektin bazlı in vitro sedimantasyon testini tanımlar. Bu ko-sedimantasyon testi, glukan fosfataz substrat bağlanmasını ölçmek için güvenilirdir ve çeşitli çözünür glukan substratlarına uygulanabilir.

Glukan Fosfatazların Substrat Bağlanmasını Ölçmek için Konkanavalin A Bazlı Sedimantasyon Testi

Son çalışmalar, insan bağırsak mikrobiyota enzimlerinin C-glikozitleri metabolize etmedeki rolünü vurgulamaktadır. Burada, bu C-glikozit metabolize edici enzimlerin yapısal ve enzimatik reaksiyon zincirlerini sistematik olarak karakterize etmek için analitik kimya tekniklerini (LC-MS/MS ve NMR) yapısal biyoloji yaklaşımlarıyla entegre eden kapsamlı bir metodoloji sunuyoruz.

İnsan Bağırsak Mikrobiyotasında C-Glikozit Metabolik Enzimlerinin Karakterizasyonu için Yapısal Biyoloji ve Analitik Kimya Yaklaşımları

Protein tasarımı, amino asit dizilerinin inşasını ve fonksiyonel varyantlar oluşturmak için belirli motiflerin dahil edilmesini içerir. Bu yaklaşım, antibiyotiğe dirençli patojenlerle savaşmak için antimikrobiyal peptitlerin (AMP'ler) geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Bu makale, çeşitli biyoinformatik araçları kullanılarak protein yapımı için bir prosedür sunmaktadır.

Proteinlerin De Novo ve In Silico Tasarımı için I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, HADDOCK sunucusu ve HEX loria uygulaması

Bu NMR tabanlı protokol, siyanovirin-N ve D-mannoz kullanarak zayıf protein-glikan etkileşimlerini araştırır. Ligand ve protein tarafından tespit edilen yöntemleri birleştirerek, bağlanma bölgelerini haritalandırır, allosterik etkileri tespit eder ve karşılaşma komplekslerini tanımlar. Yaklaşım, glikana özgü teşhis ve tanıma mekanizmaları için değerli yapısal ve dinamik bilgiler sunarak numune hazırlama ve veri analizini ana hatlarıyla belirtir.

Protein-Glikan Etkileşimlerini Keşfetmek: Nükleer Manyetik Rezonanstaki Gelişmeler

Öğrenin Streptococcus pneumoniae'den SP0092 karbonhidrat substrat bağlayıcı proteininin biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonunu. Bu yöntem, kristalleşme başarısını artırmak için tampon stabilite profilleri ve oligomerizasyon durumlarını belirlemenize yardımcı olur.

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet