Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, streptococcus pneumoniae'den elde edilen bir karbonhidrat substrat bağlayıcı proteinin biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonudur. Bu yöntem, tampon stabilite profillerinin, oligomerizasyon durumlarının ve atomik yapıların tanımlanması gibi substrat bağlayıcı proteinin öğretim çalışmalarına yardımcı olmak için temel verilerin sağlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedürün avantajları, substrat bağlayıcı proteinler için kristalizasyon ve yapı çözeltisinin başarı oranını sağlam ve basit bir şekilde artırabilecek veriler sağlamasıdır.

İlk olarak, pH aralığı 4.0 ila 9.5 arasında ve sodyum klorür konsantrasyonları sıfır ila 0.5 molar arasında değişen 48 tampon çözeltisi hazırlayın. Her çözeltiden 40 mikrolitreyi 96 oyuklu bir plakaya dağıtın. Seçilen substrat bağlayıcı proteinin saflaştırılmış bir çözeltisini elde edin.

Mililitre başına bir ila iki miligramlık bir konsantrasyon için her bir oyuğa beş mikrolitre SBP çözeltisi ekleyin. Daha sonra her bir oyuğa 20 kez konsantre floresan lekesinden beş mikrolitre ekleyin. Çözeltileri yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.

Plakayı şeffaf yapışkan film ile kapatın. Plakayı oda sıcaklığında 112 kez G'de iki dakika santrifüjleyin. Gerçek zamanlı bir PCR sistemini, 10 saniyelik bir tutma süresiyle dakikada üç derece hızında dört santigrat dereceden 99 santigrat dereceye çıkacak şekilde yapılandırın.

Sistemi her yarım derecede bir floresan okumaları alacak şekilde ayarlayın. Floresan filtre ayarını yapın. ve örnekleri atayın.

Deneyi çalıştırın ve en yüksek erime sıcaklığına sahip tampon durumunu belirleyin. Daha sonra, hacimce% 2.5 gliserol ve 0.5 milimolar TCEP konsantrasyonu içeren seçilen pH ve sodyum klorür konsantrasyonuna sahip bir tampon hazırlayın. Saflaştırılmış SBP'yi, çok açılı ışık saçılımına sahip analitik boyut dışlama kromatografisi ile karakterize edin.

Kristalleşme için uygun olan en kararlı türleri belirleyin ve bu türlerin saf fraksiyonlarını elde etmek için hazırlık SEC'yi kullanın. Kristalizasyon için en uygun protein konsantrasyonunu belirlemek için ön kristalizasyon testleri yapın. İstenen ticari kristalizasyon çözeltilerini optik 96 kuyulu bir oturma damla plakasının çözelti rezervuarlarına dağıtmak için bir kristalizasyon robotik sistemi kullanın.

Daha sonra sistemi, her kristalizasyon damlasına 100 nanolitre protein çözeltisi dağıtmak için kullanın. Her kristalizasyon çözeltisinin 100 nanolitresini rezervuar kuyularından ilgili kuyu damlalarına aktarın. Plakayı optik yapışkan film ile kapatın.

İki hafta boyunca her bir ila iki günde bir ve daha sonra haftada bir kez kristal oluşumunu ve büyümesini değerlendirmek için bir mikroskop veya otomatik görüntüleme sistemi kullanın. Yeterince büyük ve iyi şekillendirilmiş kristaller oluştuğunda, kriyoprotektan olarak hizmet etmek için hacimce %25 ek gliserol içeren bir kristalizasyon çözeltisi partisi hazırlayın. Ardından, bir köpük dewar'ı sıvı nitrojenle doldurun.

Emici bir numune muhafazasını sıvı nitrojenin içine daldırın ve muhafazanın soğumasını bekleyin. Ardından filmi, ilgi kristali içeren bir damlanın üzerine kesin. 0.5 mikrolitre kriyoprotektanı, damlaya yakın bir kapak sürgüsüne veya varsa aynı durumdaki boş bırakma haznesine bırakın.

Manyetik bir çubuğa, SPINE standart tabanına monte edilmiş bir kriyoloop'u takın. İlgilenilen kristali kriyoprotektan damlasına aktarmak için kriyo döngüsünü kullanın. Ardından, kristali kriyoprotektan suya batırılmış unipuck numune muhafazasının ilk boş konumuna aktarmak için kriyoloop'u kullanın.

Ek kristaller elde etmek için bu işlemi tekrarlayın. İlgilenilen tüm kristaller numune muhafazasına yüklendikten sonra, çözülmüş taban plakasını muhafazaya yerleştirmek için disk çubuğunu kullanın. Sıvı nitrojen içindeki unipuck'ı ışın hattına taşıyın.

Çözünmeyi ışın hattı numune değiştirici dewar'a yüklemek ve numune muhafazasını çıkarmak için kriyo maşası ve bir disk dewar yükleme aleti kullanın. Ardından, numuneyi yüklemek ve otomatik olarak x-ray ışınında ortalamak için beamline yazılımında numuneyi seçin. Bir x-ışını floresan spektrumu edinin ve anormal bir kırınım deneyinde kullanılabilecek herhangi bir elementi tanımlayın.

Bir x-ışını absorpsiyon kenarı enerji taraması gerçekleştirerek anormal kırınım verilerini toplamak için en uygun dalga boyunu belirleyin. Ardından, kristal birim hücre parametrelerini, simetriyi ve kırınım sınırını otomatik olarak belirlemek için standart salınım modunda 45 derecelik aralıklarla üç x-ışını kırınım modeli elde edin. Önerilen veri toplama parametrelerini ışın hattı yazılımına aktarın ve uygun şekilde tek veya çok dalga boylu anormal bir kırınım deneyi çalıştırın.

Substrat bağlayıcı protein SP0092'nin çeşitli tuz tamponlarındaki stabilitesi, optimal tampon çözeltisini belirlemek için değerlendirildi. En yüksek erime sıcaklıkları, pH'ı 6.5 olan tamponlar ve sıfır ila 0.2 molar arasında değişen sodyum klorür konsantrasyonları için bulundu. Prosedür için pH değeri 6.5 ve sodyum klorür konsantrasyonu 0.2 molar olan bir tampon seçildi.

SP0092'nin çeşitli oligomerizasyon durumları tanımlandı ve SEC-MALS ile ayrıldı. Farklı protein konsantrasyonlarında SEC profilinin analizi, artan protein konsantrasyonunun oligomerizasyonu tetiklediğini gösterdi, bu da daha büyük oligomerlerin yüksek konsantrasyonlarda daha kararlı olduğunu düşündürdü. Bununla tutarlı olarak, büyük oligomerler kristalleşme denemelerinde kristaller üretirken, monomer üretmedi.

Hem doğal hem de selenometiyonin etiketli SP0092 kristallerinin X-ışını floresansı, her iki formda da proteine bağlı çinkoyu gösterdi. Anormal sinyal, gelen x-ışını dalga boyunun çinko veya selenyumun x-ışını absorpsiyon kenarlarına ayarlanmasıyla maksimize edildi. Daha sonra tam bir anormal veri seti elde edildi ve anormal bir sinyalin varlığıyla tetiklenen otomatik analiz, protein yapılarının ilk haritalarını oluşturdu.

Bu ilk haritalara yerleştirilen modeller daha sonra nihai modelleri üretmek için rafine edildi ve doğrulandı. Bu videoyu izledikten sonra, bir substrat bağlayıcı proteinin veya herhangi bir potansiyel protein hedefinin kapsamlı bir yapısal karakterizasyonunun nasıl tamamlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu tekniğin etkileri, bu protein sınıfı için inhibitörlerin yapıya dayalı tasarımı için temel bilgiler sağladığından, mirokok hastalığı için yeni terapötiklerin geliştirilmesine doğru uzanır.

Bu yöntemler aynı zamanda diğer organizmalardan substrat bağlayıcı proteinlere de uygulanabilir ve potansiyel olarak herhangi bir protein türü için kullanılabilirler.