Değerlendirme endokrin omurgalı Neural ağ işlevi çoklu elektrot dizileri kullanarak geliştirme bileşikler engellemeden etkilerinden

Bu deneysel protokolün genel amacı, bisfenoller gibi endokrin bozucu bileşiklerin, çok elektrotlu diziler üzerinde kurulan omurgalı nöronal ağlarının ağ oluşturma aktivitesi üzerindeki etkilerini test etmektir. Bu yöntem, gelişimsel nörobiyoloji ve çevresel toksikolojide, çevresel toksinlerin embriyonik beyindeki ağ aktivitesinin gelişimi üzerindeki etki mekanizması gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, ortalama ateşleme hızı, toplam sivri uç sayısı ve sivri uç genliği ve senkronizasyon gibi nöronal ağ parametreleri üzerindeki etkilerin artık incelenebilmesidir.

Önceki çalışmamız, EDC'lerin nöronal ağların doğrudan bir çıktısı olan kelime ve davranışı etkilediğini gösterdi ve protokolümüz şimdi EDC'lerin bu ağlar üzerindeki etkisini anlamayı amaçlıyor. Nöron kaplama gününde, negatif 20 santigrat derece dondurucudan bir hücre dışı matris şişesini çıkarın,% 70 etanol püskürtün ve% buzun üzerine yerleştirin. Hücre dışı matrisi buz üzerinde çözdüğünüzden emin olun.

ECM sıfır santigrat derecenin üzerinde polimerize olduğu için oda sıcaklığında çözdürmeyin. 2 mikrolitrelik alikota 25 mikrolitre soğuk nörobazal ortam ekleyerek hücre dışı matrisi %300'e seyreltmek için BSL100 davlumbazında çalışın. Ardından, elektrotlara dokunmamaya dikkat ederek çoklu elektrot dizisinin merkezine 100 mikrolitre %25 hücre dışı matris çözeltisi eklemek için bir P200 pipeti kullanın.

Yüzeyde ince bir film tabakası bırakarak ECM'yi hemen çıkarın. Çoklu elektrot dizisini kapatın ve nöronları kaplamaya hazır olana kadar doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Bir E7 yumurtasının dış kabuğunu %70 etanol ile sterilize ederek civciv nöron izolasyonuna başlayın.

Bu noktadan itibaren steril koşulları korumak önemlidir. Tüm aletlerin %70 etanol ile sterilize edildiğinden ve solüsyonların steril olduğundan emin olun. Diseksiyon başlığı kullanmak faydalıdır, ancak hızlı bir şekilde yapılırsa diseksiyonlar için kesinlikle gerekli değildir.

Daha sonra embriyoyu alıp başını kestikten sonra, göz çevresini kesin ve göz kürelerini çıkarın. Ardından, ventral tarafta bir kesi yapmak için Dumont numaralı beş ince forseps ve yaylı makas kullanın ve ön beyni ve optik tektumu ortaya çıkarmak için cildin dış katmanlarını çıkarın. Kabuk zarını dikkatlice soyun ve çıkarın.

Ön beyni HBSS içeren başka bir Petri kabına aktarın ve yaylı makasla yaklaşık iki milimetrelik küçük parçalar halinde kesin. Ön beyin parçalarını 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarmak için steril bir transfer pipeti kullanın. Ön beyin parçaları santrifüj tüpünün dibine battıktan sonra, mümkün olduğunca fazla HBSS'yi çıkarın.

Daha sonra, bir mililitre önceden ısıtılmış,% 0.5 tripsin EDTA ekleyin ve 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Doku parçalarını rahatsız etmeden tripsini dikkatlice çıkarmak için bir Pasteur pipeti kullanın. Bir mililitre nörobazal ortam ekleyin ve doku parçalarının dibe çökmesine izin verin.

Ortamı çıkardıktan ve yıkamayı tekrarladıktan sonra, iki mililitre nörobazal ortam ekleyin ve daha fazla doku parçası görülmeyene kadar hafifçe ezin. Yeniden askıya alınan hücreleri nörobazal ortam ile bir ila 10 oranında seyreltin. Tripan mavisi boya ve bir hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın.

Saydıktan sonra, ayrışmış hücreleri milimetre kare başına 2.200 hücre yoğunluğunda ECM kaplı, çok elektrotlu diziler üzerine yerleştirin. Ertesi gün, tedavi edilen çok elektrotlu dizilere nörobazal ortamda 10 mikromolar BPA ekleyin. Edinme gününde, kültür ortamını taze nörobazal ortamla değiştirin ve dizileri kayıttan önce en az iki saat CO2 inkübatörüne geri koyun.

Kayıt yazılımını başlatın ve sıcaklık simgesine tıklayarak çoklu elektrot dizisinin sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayın. Sol pencere panelinde akışları seçerek ve muse simgesini sağ tıklatarak alım parametrelerini ayarlayın. Ardından, işleme ve ani yükselme dedektörü ekle'yi seçin ve açılır pencerede Tamam'a tıklayın.

STD'nin ani dedektör altısı, dosya adının altında görünecektir. Ardından, ani yükselme algılayıcısına sağ tıklayın, işleme ve patlama algılayıcısı ekle'yi seçin ve açılır pencerede Tamam'a tıklayın. Patlama dedektörü ISI, ilham perisi simgesinin altında görünecektir.

Ardından, patlama algılayıcısına sağ tıklayın, işleme ve sinir istatistikleri derleyicisi ekle'yi seçin. Açılan pencerede, dosya başlığının, toplu kuyu istatistiklerinin ve senkronizasyonun seçili olduğundan emin olun, Tamam'a tıklayın. İstatistik derleyicisi aşağıda görünecektir. Ekranın alt kısmında bulunan saat simgesine tıklayın ve ayarlar bölümündeki bilgileri her 5.1 dakikada bir kayıt yapacak ve beş dakika boyunca kayıt yapacak şekilde değiştirin.

Bu hemen başlatılacak ve bir kez yürütülecektir. Çoklu elektrot dizisini inkübatörden aldıktan sonra, kayıt ünitesine yerleştirin ve yerine kilitleyin. Zamanlanmış kayıt bölümünde kaydı başlat'a tıklayarak ağ etkinliğini kaydetmeye başlayın.

Tipik olarak, beş dakikalık bir kayıt süresi yeterlidir, ancak 10 dakikaya kadar daha uzun kayıtlar elde edilebilir. Kayıttan sonra, çoklu elektrot dizisini inkübatöre geri koyun. BPA ile tedavi edilen E7 civciv ön beyin kültürlerinde ortalama sivri uç sayısı, kontrol kültürlerine kıyasla önemli ölçüde daha düşüktür.

BPA ile tedavi edilen E7 civciv ön beyin kültürlerinde ortalama senkronizasyon indeksi, kontrol kültürlerine kıyasla anlamlı derecede düşüktür. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa üç saatten daha kısa sürede yapılabilir. Bu prosedürü denerken, spike aktivitesini kaydederken bile her zaman steril koşulları korumayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, antiepileptikler ve antidepresanlar gibi potansiyel ilaçların ağ aktivitesi üzerindeki etkisi, etki mekanizmalarını anlamaya yönelik bir adım olarak değerlendirilebilir. Birçok EDC'nin gelişim sırasında beyin üzerinde ince etkileri vardır ve bu etkiler kendilerini davranış değişiklikleri olarak gösterir. Davranış, temel alınan ağ etkinliğinin doğrudan bir çıktısıdır.

Protokolümüz, bu bileşiklerin ağ aktivitesi üzerindeki etkilerini incelemeyi amaçlamaktadır.