Vitro ve In Vivo insan hücreleri, C. Elegansve fareler Mitophagy tespiti

Bu deneylerin genel amacı, insan hücrelerinde, C.elegans'ta ve farelerde mitofaji seviyelerini değerlendirmektir. Mitofaji, nöro-dejenerasyon, metabolik hastalıklar ve yaşlanmanın kavşağında çok önemli bir kavram haline gelmiştir ve burada sunulan metodolojilere ve bunların gelecekteki kullanımına ilişkin içgörü, bu önemli alanda ilerlemeler kaydedilmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin başlıca avantajları, mitofajiyi sağlam ve verimli bir şekilde tespit etmesi ve mitofajinin hem in vitro hem de in vivo olarak saptanmasını sağlamasıdır.

Burada sunulan bu teknik, araştırmacıların yeni içgörüler geliştirmelerine ve mitokondriyal bir disfonksiyon olduğunu bildiğimiz Alzheimer ve Parkinson da dahil olmak üzere nöro-üretken hastalıklara karşı tedavi için yeni stratejiler geliştirmelerine yardımcı olacaktır. Bu yöntem, mitofajinin moleküler mekanizmaları hakkında bilgi sağlamanın yanı sıra, mitofaj indükleyicilerinin taranması yoluyla yeni ilaç adaylarının keşfedilmesine yol açabilir. Bu yöntemlerin görsel gösterimleri kritiktir, çünkü mitofaji seviyeleri hem C.elegans hem de farelerde deney koşullarındaki değişikliklere çok duyarlıdır.

35 milimetre cam tabanlı bir mikro kuyu kabına, 10 milimetre mikro kuyuya 300.000 ila bir milyon hücre tohumlayın, böylece hücreler ertesi gün% 70 birleşmeye ulaşır. Hücreleri tam hücre kültürü ortamında tutun ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir inkübatörde inkübe edin. Ertesi gün, 15 mikrolitre DNA transfeksiyon reaktifini, üreticinin protokolüne göre 150 mikrolitre serum serbest ortam ile seyreltin.

Ayrıca, mito-Keima plazmit DNA'sının iki ila beş mikrogramını 150 mikrolitre serum içermeyen ortamla seyreltin. Seyreltilmiş mito-Keima plazmidini seyreltilmiş DNA transfeksiyon reaktifine ekleyin ve karışımı 10 saniye boyunca girdaplayın. Daha sonra karışımı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Daha sonra, DNA transfeksiyon reaktif karışımını hücrelere damla damla ekleyin, çözeltiyi karıştırmak için plakaları beş ila 10 saniye hafifçe sallayın. Bu noktada, hücreleri tekrar inkübatöre yerleştirin ve 24 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, ortamı taze tam hücre kültürü ortamına değiştirin ve ardından transfekte edilmiş hücreleri 24 saat daha inkübe edin.

Konfokal mikroskopi kullanarak transfekte edilmiş hücreleri görüntüleyin. Her kuyucukta toplam 100 ila 200 hücreyi belgelemek için 40 kat büyütme altında 20 alanı rastgele görüntüleyin. Birinci gün, vücut duvarı kas hücrelerinde hem DCT-1 GFP hem de DSRed LGG-1 eksprese eden transgenik hayvanların L4 larvalarını toplayın ve bunları bir OP50 tohumlu nematod büyüme ortamı plakasına yerleştirin.

En az üç plaka kullanarak her 3,5 santimetrelik plakaya beş ila 10 solucan yerleştirin. Bittiğinde nematodları 20 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, beşinci günde, 15 ila 20 L4 transgenik larva seçerek ve bunları taze OP50 tohumlu plakalara aktararak nematodları senkronize edin.

Her deney koşulu için en az beş plaka kullanın. Yedinci günde, araç plakalarının bir kısmını ilgilenilen ilaçları etkileyen mitofaji için ve bazılarını pozitif kontrol olarak kullanmak üzere hazırlayın. Daha sonra, plakalar üzerindeki mitofajiyi indükleyen bileşiklerin bakteriler tarafından metabolize edilmemesini sağlamak için E.coli tohumlu plakaları santimetre kare başına 222 mikrowatt yoğunlukta 15 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın.

Şimdi, 10 mikrolitrelik ilgilenilen bileşiği ekilen plakaların üstüne ekleyin ve negatif kontrol olarak araç plakalarına eşdeğer miktarda bileşik araç ekleyin. Mitofaji indüksiyonunun pozitif kontrolü için, bir mitokondriyal toksik madde olan paraquat ekleyin. Solüsyon tüm yüzeyi kaplayana kadar plakaları hafifçe döndürün ve plakaların kapakları kapalıyken oda sıcaklığında en az bir saat kurumasını bekleyin.

Kuruduktan sonra, 10 ila 20 iki günlük yetişkin transgenik hayvanları plakalara aktarın. Onları iki gün boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin. Dokuzuncu günde,% 2 agaroz pedleri hazırlayın ve ped başına M9'da bir damla 20 milimolar levamisol ekleyin.

Transgenik hayvanları M9 levamisol damlasına yerleştirerek görüntüleme için hareketsiz hale getirin. Ardından, damlanın üstüne nazikçe bir kapak fişi yerleştirin. Numuneyi konfokal bir mikroskop sahnesine yerleştirin ve 63 kat büyütme altında Z-yığını görüntüleri alarak tek vücut duvarı kas hücrelerini görüntüleyin.

Dokuyu hızla soğutmak için taze, izole edilmiş bir mito-Keima fare karaciğerini soğutulmuş metal bir plakaya, buz üzerine yerleştirin. Mito-Keima proteininden gelen sinyal buz üzerinde bir saate kadar sabit kaldığından, dokuyu mümkün olduğunca çabuk işlerken orada tutun. Daha sonra, karaciğer örneğini kaldırmak için bir çift kavisli forseps kullanın ve beş mililitre buz gibi soğuk PBS ile durulayın.

Son olarak, iki ardışık uyarma ile konfokal mikroskopi kullanarak doku kesitlerini görüntüleyin. Burada sunulan prosedür kullanılarak, insan HeLa hücreleri mito-Keima plazmidi ile transfekte edildi. Sağlıklı hücreler, az sayıda mitofaji insidansı ile iyi organize edilmiş bir mitokondriyal ağ gösterdi.

Bununla birlikte, bir mitokondriyal birleştirici FCCP ile ön işleme tabi tutulan hücreler, mitofaji insidansında derin bir artış göstermiştir. Mitofaji ayrıca LAMP2 ve COXII'nin birlikte lokalizasyonu kullanılarak ölçüldü. C.elegans'ta mitofajinin in vivo tespiti için, vücut duvarı kas hücrelerinde MT rosella eksprese eden transgenik nematodlar sekiz milimolar parakuat ile tedavi edildi.

pH'a duyarlı floresan oranındaki bir azalma ile gösterilen mitofaji indüksiyon seviyesinin, parakuat ile muamele edilen nematodlarda önemli ölçüde azaldığı bulundu. Ek olarak, DCT-1 kaynaşmış GPF ve DSRed kaynaşmış LGG-1 arasındaki yüksek sayıda ko-lokalizasyon olayı, oksidatif strese yanıt olarak mitofaji stimülasyonunu gösterir. Son olarak, bu görüntüler bir mito-Keima faresinin karaciğerinden ve beyinciğinden gelen mito-Keima sinyallerini temsil eder.

Dokuların soğuk tutulması ve mümkün olduğunca çabuk görüntülenmesi gerekir, ancak uygun şekilde hazırlandığında, normal ve patofizyolojik koşullarda mitofaji hakkında bilgi sağlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin kullanımı, nöro-dejenerasyon ve mitokondri biyolojisi alanındaki araştırmacıların, kültürlenmiş hücreler, solucanlar veya C.elegans ve fare modelleri dahil olmak üzere farklı model sistemlerinde mitokondriyal işlevleri keşfetmelerinin yollarını açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, hem C.elegans'ta hem de farelerde mitofaji seviyelerinin kantitatif değerlendirmesinde kullanılacak birden fazla yöntemi kavramanız gerekir.