Name: Vitro ve In Vivo insan hücreleri, C. Elegansve fareler Mitophagy tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Öğrenin, insan hücreleri, C. elegans ve farelerde mitofajiyi in vitro ve in vivo tespit etme yöntemlerini. Bu teknikler, nörodejeneratif hastalıklara karşı yeni tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz doktor Atsushi Miyawaki ve Dr Richard J. Youle mt-Keima plazmid paylaştığınız için teşekkür ederiz ve mt-Keima Hela hücreleri entegre. Raghavendra A. Shamanna ve Dr Deborah L. Croteau el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Bu araştırma Intramural araştırma programı NIH (VAB) tarafından desteklenen, yaşlanma, hem de 2014-2015 Ulusal Enstitüsü ve 2016-2017 NIA Intra-laboratuvar (EFF, VAB) verin. EFF HELSE SOR-OST RHF tarafından desteklenen (Proje No: 2017056) ve Norveç Araştırma Konseyi (Proje No: 262175).
YAZAR KATKILARI:
EFF el yazması tasarlanmış ve taslak hazır; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH ve ED kağıdın farklı bölümlerini yazdı; NT, JP, HN ve VAB el yazması gözden geçirilmiş ve uzmanlık sağlanan.

<ol><li>Fang, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+DNA+damage+signalling+to+mitochondria+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).</li>
<li>Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+the+mitochondrial+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protecting the mitochondrial powerhouse.</a> Trends Cell Biol. 25 (3), 158-170 (2015).</li>
<li>Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/molecular-cell/pdf/S1097-2765(16)00081-2.pdf">The Mitochondrial Basis of Aging.</a> Mol Cell. 61 (5), 654-666 (2016).</li>
<li>Shadel, G. S., Horvath, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+signaling+in+organismal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis.</a> Cell. 163 (3), 560-569 (2015).</li>
<li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+during+ageing+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans.</a> Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).</li>
<li>Lazarou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+kinase+PINK1+recruits+autophagy+receptors+to+induce+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy.</a> Nature. 524 (7565), 309-314 (2015).</li>
<li>Kerr, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+and+Alzheimer%27s+Disease%3A+Cellular+and+Molecular+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+neurosci%22%5BJournal%5D)">Mitophagy and Alzheimer's Disease: Cellular and Molecular Mechanisms.</a> Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).</li>
<li>Fivenson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+in+neurodegeneration+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Mitophagy in neurodegeneration and aging.</a> Neurochem Int. , (2017).</li>
<li>Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compromised+autophagy+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Compromised autophagy and neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 16 (6), 345-357 (2015).</li>
<li>Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22240478">Mechanisms of autophagosome biogenesis.</a> Curr Biol. 22 (1), R29-R34 (2012).</li>
<li>Kerr, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+and+Alzheimer%27s+disease%3A+cellular+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+neurosci%22%5BJournal%5D)">Mitophagy and Alzheimer's disease: cellular and molecular mechanisms.</a> Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).</li>
<li>Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+autophagic+activity+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of autophagic activity in mammalian cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 15, Unit 15 16(2012).</li>
<li>Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+quantitative+technique+for+detecting+autophagic+events+based+on+lysosomal+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery.</a> Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26549682">Measuring In Vivo Mitophagy.</a> Mol Cell. 60 (4), 685-696 (2015).</li>
<li>Fang, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+mitophagy+in+XPA+via+PARP-1+hyperactivation+and+NAD%28%2B%29%2FSIRT1+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction.</a> Cell. 157 (4), 882-896 (2014).</li>
<li>Diot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+quantitative+assay+of+mitophagy%3A+Combining+high+content+fluorescence+microscopy+and+mitochondrial+DNA+load+to+quantify+mitophagy+and+identify+novel+pharmacological+tools+against+pathogenic+heteroplasmic+mtDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA.</a> Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).</li>
<li>Schiavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-Starvation-Induced+Mitophagy+Mediates+Lifespan+Extension+upon+Mitochondrial+Stress+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans.</a> Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).</li>
<li>Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosella%3A+a+fluorescent+pH-biosensor+for+reporting+vacuolar+turnover+of+cytosol+and+organelles+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast.</a> Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).</li>
<li>Sargsyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+parallel+measurements+of+macroautophagy+and+mitophagy+in+mammalian+cells+using+a+single+fluorescent+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor.</a> Sci Rep. 5, 12397(2015).</li>
<li>Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltun%2C+ZF+%22WormAtlas%22">WormAtlas</a>. , (2009).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J Vis Exp. (47), e2293(2011).</li>
<li>Palikaras, K., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Mitophagy+Monitoring+in+Caenorhabditis+elegans+to+Determine+Mitochondrial+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis.</a> Bio Protoc. 7 (7), e2215(2017).</li>
<li>Palikaras, K., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+Mitochondrial+Selective+Autophagy+in+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-based+imaging+method+to+measure+in+vitro+and+in+vivo+mitophagy+using+mt-Keima%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima.</a> Nat Protoc. 12 (8), 1576-1587 (2017).</li>
<li>Eiyama, A., Okamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+Mitophagy+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assays for Mitophagy in Yeast.</a> Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).</li>
<li>McWilliams, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mito-QC+illuminates+mitophagy+and+mitochondrial+architecture+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo.</a> J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).</li>
</ol>

Bohr laboratuvar CRADA düzenlemeler ChromaDex ve GlaxoSmithKline ile vardır.

Mitophagy doğru ölçüm teknik olarak talep ediyor. Burada, biz mitophagy her iki nitel algılama ve miktar mitophagy düzeylerinin en yaygın laboratuvar deneysel modeller için izin birkaç güçlü teknikleri sundu.
Yinelenebilir verisini almak için en az üç biyolojik tekrarlar deneysel bir tasarımla gereklidir. Tüm araştırmacılar deneme ve analiz dahil deney grubu kimliklere kör olmalı. Ayrıca, alanları görüntüleme rastgele resim alma sırasında seçilmelidir. Hücre kültürü ve C. elegans çalı...

Mitophagy mitokondrial bakımı için önemlidir. Mitokondri birden çok hücre sinyal yolları kesişir ve evrensel alt hücre organelleri hücresel enerji üretimi, hücre metabolizması ve kalsiyum homeostazı1,2,3, sorumlu olan 4. mitokondri sürekli deneyimi zorluklar Reaktif oksijen türleri (ROS) ve mitokondriyal toxicants gibi endojen ve eksojen kaynaklardan sırasıyla hangi kurşun "yaşlı" ve işlevsel olmayan mitokondri üretimi için. Hasarlı mitokondri birikimi zararlı ROS miktarını artırarak sırasında ATP üretim verimliliğini azaltır ve yaşa bağlı hastalıklar gibi metabolik hastalıklar, reklam, bağlı ve PD1,5,6 . Mitokondri indüklenen hücresel fonksiyon bozukluğu önlemek için özellikle zarar mitokondri tanımak ve verimli bir şekilde bir hücresel süreç boyunca kaldırmak için hücreleri ihtiyaç mitokondrial autophagy (mitophagy) olarak adlandırdığı. Bu mitophagy sağlık önemi gösterdi ve hastalığı mitophagy algılamak doğru ve verimli yöntemleri ihtiyacını göstermektedir vitro ve içinde vivo.
Mitophagy pek çok protein ve protein kompleksleri5,7,8içeren çok adımlı bir işlemdir. Kısacası, hasarlı bir mitokondri ilk tanınan ve plazma zarı, endoplazmik retikulum, Golgi kompleksi, çekirdeği veya mitokondri kendisi9,10gerçekleşebilir bir çift membraned phagophore tarafından yuttu. Küresel phagophore uzar ve sonunda içinde mitokondriyal autophagosome (mitophagosome) oluşturan mitokondri mühürler. Mitophagosome sonra bozulması, hasarlı mitokondri bozulmuş ve geri dönüşümlü7,8olduğu bir autolysosome oluşturan lysosome ile birleştirir. Büyük autophagic proteinler de mitophagy içinde yer alan içerir: Autophagy ilgili 7 (ATG7) ve Beclin1 (inisiyasyon), Microtubule-Associated Protein 1A/1B-hafif zincir 3 (LC3-II) (LGG-1 C. elegans) ve p62 (phagophore bileşenleri), ve ilişkili lizozomal membran glikoprotein 2 (LAMP2)6,7. Ayrıca, birkaç temel proteinler PTEN kaynaklı sözde kinaz 1 (pembe-1), Parkin1, nükleer nokta Protein 52 kDa (NDP52), optineurin, BCL2 etkileşim Protein 3 gibi (NIX/BNIP3L) (DCT-1, C. elegans') de dahil olmak üzere mitophagy için benzersiz diğerleri arasında5,6,11.
Autophagy seviyelerinde değişiklikleri algılamak için kullanılan genel yöntem tarafından LC3-II/LC3-ı veya LC3-II/aktin oranıdır. Ancak, bu oran artışı artan bir inisiyasyon veya mitophagosome lysosome12Engelli bir füzyonu yansıtıyor olabilir gibi bu yöntem nonspesifik,. Colocalization bir autophagy işaretleyici (örneğin, LC3) ve mitokondriyal bir protein (örneğin, translokaz, dış mitokondri zar 20 (TOMM20, hangi proteasomes tarafından bozulmuş)) arasında değerlendirmek için başka bir yöntemdir. Ancak, bu yalnızca toplam mitophagy seviyelerinde değişiklik gösterebilir ve adım (lar) ayırt edemez hangi tıkanıklık oluşur. Bu mitophagosomes birikimi neden paralel olarak lizozomal inhibitörleri (örneğin, E64d + Pepstatin A, olarak adlandırdığı EP) kullanarak açıklık. Mitophagosomes temel, sayısı ve tedavi EP ile aşağıdaki mitophagosomes sayısı arasındaki farkı mitophagy belirtebilirsiniz. Bu sınırlamalar roman mitophagy algılama teknikleri geliştirilmesi isteniyor. Mitophagy insan hastalıkların geniş bir spektrumda artan alaka içinde görüş-in, biz araştırmacılar için yararlı olabilir birkaç sağlam mitophagy algılama teknikleri mevcut. Vitro ve in vivo teknikler kapak ve mitophagy değişiklikleri doğrulamak için bir çok teknik birleştirerek öneririz.

<table><tbody><tr><td>mt-Keima fare</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000 DNA transfeksiyon reaktifi</td><td>Thermofisher</td><td>#11668027</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM ortamı (Gibco)</td><td>Thermofisher</td><td>#31985062</td><td>serumsuz ortam</td></tr><tr><td>mtKemia plazmidi: pCHAC-mt-mKeima</td><td>addgene</td><td>#72342</td><td></td></tr><tr><td>COXII antikoru (fare)</td><td>abcam</td><td>#ab110258</td><td></td></tr><tr><td>LAMP2 antikoru (tavşan)</td><td>NOVUS</td><td></td><td></td></tr>#CD107b <tr><td>568 nm dalga boyuna sahip keçi-anti-tavşan (RFP)</td><td>Thermofisher</td><td>#Z25306</td><td>Alexa Fluor 568 boya</td></tr><tr><td>keçi-anti-fare, dalga boyu 488 nm yeşil floresan proteini (GFP)</td><td>Thermofisher</td><td>#Z25002</td><td>Alexa Fluor 488 boyası</td>,</tr><tr>DAPI <td>Invitrogen</td> <td>ile altın antifadesini uzatır</td><td>#P36931</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>SIGMA Corning Costar</td><td>#CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>4 oyuklu oda kaydırağı</td><td>ŞOFÖR, Nunc Lab-Tek#</td><td>171080</td><td></td></tr><tr><td>Nunc F 96 kuyulu plaka</td><td>Thermofisher</td><td>#152038</td><td></td></tr><tr><td>LC3B antikor tavşanı</td><td>NOVUS</td><td>#NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>DNA antikoru</td><td>Progen Biotechnik</td><td>#anti-DNA fare monoklonal, AC-30-10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher</td><td>#D1306</td> DAPI IN Hücre analizörü (floresan okuyucu) <td>ile antifade montaj ortamı</td></tr><tr><td>GE</td> <td>Healthcare Life Sciences</td><td>#IN Hücre analizörü 2200</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE-2000e konfokal mikroskop</td><td>Nikon</td><td>#TE-2000e</td><td></td></tr><tr><td>Kolokalizasyon yazılımı</td><td>Volocity</td><td>#Volocity 6.3</td><td>alternatif Zeiss ZEN 2012 yazılımı</td></tr><tr><td>İÇİNDE Hücre Araştırmacı Yazılımı</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri</td> <td>#28408974</td><td></td></tr><tr><td>hücre kültürü ortamı</td><td>Thermofisher#DMEM</td><td>&ndash; Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı</td> Penisilin-Streptomisin <td></td></tr><tr><td>(10.000 U/mL)</td><td>Thermofisher</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#12003C-1000ML</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü İnkübatörü</td><td>Thermofisher</td><td>#Thermo Forma 3110 CO2 Su Ceketli İnkübatör</td><td></td></tr><tr><td>epifloresan mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axio Görüntüleyici Z2</td></tr><tr><td>kamera</td><td>Olympus</td><td></td><td>Olympus DP71</td></tr><tr><td>konfokal mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axio Observer Z1</td></tr><tr><td>konfokal yazılım</td><td>Zeiss</td><td></td><td>ZEN 2012</td></tr><tr><td>görüntü analiz yazılımı</td><td>Image J</td><td>kolokalizasyon analizi, vb</td><td></td></tr> <tr><td>https://imagej.nih.gov/ij/ istatistiksel analiz yazılımı</td><td>GraphPad Software Inc., San Diego, ABD</td><td></td><td>Solucan seçimi yapmak için GraphPad Prism yazılım paketi</td></tr><tr><td>malzemesi</td><td>Surepure Chemetals</td> <td># 4655</td><td>Seçim 30 gauge %90 platin %10 iridyum telden yapılmıştır</td></tr><tr><td>IR: N2; Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella]</td><td>Tavernarakis Nektarios'a</td><td></td> malzeme araştırması <td>Transgenik hayvanları 20 derecede koruyun; C</td></tr><tr><td>IR: N2; Örn[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1]</td><td>Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pmyo-3 TOMM-20::Rosella</td><td>Tavernarakis Nektarios'a</td><td></td><td></td>malzeme sorgulaması</tr><tr><td>pdct-1 DCT-1::GFP</td><td>Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pmyo-3 DsRed:: LGG-1</td><td>Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td></td>Paraquat çözeltisine malzeme sorgulaması</tr><tr><td>M9 tamponunun</td><td>hazırlanması</td> için ek verilere bakın M9-levamisol tamponunun hazırlanması <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>için ek verilere bakın</td></tr> Cam <tr><td></td><td></td> Mikroskobu Slaytları ve Lameller Fisher Scientific#B9992000 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi forseps</td><td>STERIS Hayvan Sağlığı</td><td>19 Parça Köpek Kısırlaştırma Paketi Ekonomi</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi makas</td><td>STERIS Hayvan Sağlığı</td><td>19 Parça Köpek Kısırlaştırma Paketi Ekonomi</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Thermofisher</td><td>#AM9625</td><td>10x PBS'nin ddH2O çalkalayıcı kullanılarak 1x PBS'ye seyreltilmesi gerekir</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>#11-676-178</td><td>Thermo Scientific MaxQ HP Masaüstü Orbital Küçük Açık Hava Platform Çalkalayıcı Paketi %</td></tr><tr><td>2 agaroz ped</td><td>Hazırlık</td><td></td><td></td>için ek verilere bakın</tr><tr><td>Vibroslice bıçakları</td><td>Dünya hassas aletleri</td><td>#BLADES-2</td><td>tek kenarlı bıçak</td></tr><tr><td>metal plaka</td><td>MSC</td> <td># 78803988</td><td>0.012 inç kalınlık x 6 inç genişlik x 12 inç uzunlukta, 430 Paslanmaz Çelik Sac</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>deterjan</td></tr><tr><td>Metil violojen diklorür hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td># 856177</td><td></td></tr><tr><td>nematodlar için paraquat İnkübatörü</td> 20 ° C'yi korumak için <td>AQUALYTIC</td><td></td><td>İnkübatörü; C</td></tr><tr><td>Diseksiyon stereomikroskobu</td><td>Olympus</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver Z1</td><td>Nematodlar için (aşama 2)</td></tr><tr><td>epifloresan mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>AxioImager Z2</td><td>Nematodlar için (aşama 2)</td></tr><tr><td>UV çapraz bağlayıcı</td><td>Vilber Lourmat</td><td>BIO-LINK &ndash; BLX-E365</td><td>UV ışık kaynağı; 356 nm</td></tr></tbody></table>

vitro ve in vivo insan hücreleri, c. elegansve fareler mitophagy tespiti

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitokondri güçlüdür hücre vardır ve ATP şeklinde hücresel enerji üretmek. Biyolojik yaşlanma ve metabolik hastalıklar, erken yaşlanma sendromları ve nörodejeneratif hastalıklar Alzheimer hastalığı (Ah) ve Parkinson hastalığı (PD) gibi gibi bozukluklar çok çeşitli mitokondrial disfonksiyon katkıda bulunur. Mitokondrial Biyogenez ve işlevsel olmayan mitokondri mitophagy aracılığıyla verimli boşluk mitokondrial sağlık bakım bağlıdır. Doğru bir şekilde autophagy/mitophagy, özellikle hayvan modellerinde, algılamak için deneysel yöntemleri geliştirmek için zor oldu. Mitophagy moleküler mekanizmaları anlama yolunda son ilerleme roman mitophagy algılama teknikleri gelişimini sağlamıştır. Burada, mitophagy insan hücrelerinde Caenorhabditis elegans izlemek için çeşitli teknikler çok yönlü tanıtmak (örneğin, Rosella ve DCT-1 / LGG-1 suşları) ve fare (mt-Keima). Türler arası değerlendirme, dahil olmak üzere bu mitophagy algılama teknikleri bir arada mitophagy ölçümlerin doğruluğunu geliştirmek ve daha iyi sağlık ve hastalığında mitophagy rolünü anlamak için yol.

Mitophagy insan hücrelerinde tespiti:
Burada sunulan yordamını kullanarak insan HeLa hücreleri mt-Keima plazmid ile transfected. Sağlıklı hücreleri gösterdi iyi organize edilmiş bir mitokondri ağ (GFP, 488 nm) ile mitophagy birkaç olaylar (RFP, 561 nm). Ancak, hücreleri mitokondriyal uncoupler FCCP ile ön işleme (3 h için 30 µM) derin bir artış mitophagy insidansı (şekil 1A) sergilenmektedir. Mitophagy...

Mitophagy, takas zarar mitokondri, süreci mitokondrial homeostazı ve sağlık bakım için gereklidir. Bu makale en son mitophagy bazılarını algılama yöntemleri insan hücreleri, Caenorhabditis elegansve fareler sunar.

Vitro ve In Vivo insan hücreleri, C. Elegansve fareler Mitophagy tespiti

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Bu deneylerin genel amacı, insan hücrelerinde, C.elegans'ta ve farelerde mitofaji seviyelerini değerlendirmektir. Mitofaji, nöro-dejenerasyon, metabolik hastalıklar ve yaşlanmanın kavşağında çok önemli bir kavram haline gelmiştir ve burada sunulan metodolojilere ve bunların gelecekteki kullanımına ilişkin içgörü, bu önemli alanda ilerlemeler kaydedilmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin başlıca avantajları, mitofajiyi sağlam ve verimli bir şekilde tespit etmesi ve mitofajinin hem in vitro hem de in vivo olarak saptanmasını sağlamasıdır.Burada sunulan bu teknik, araştırmacıların yeni içgörüler geliştirmelerine ve mitokondriyal bir disfonksiyon olduğunu bildiğimiz Alzheimer ve Parkinson da dahil olmak üzere nöro-üretken hastalıklara karşı tedavi için yeni stratejiler geliştirmelerine yardımcı olacaktır. Bu yöntem, mitofajinin moleküler mekanizmaları hakkında bilgi sağlamanın yanı sıra, mitofaj indükleyicilerinin taranması yoluyla yeni ilaç adaylarının keşfedilmesine yol açabilir. Bu yöntemlerin görsel gösterimleri kritiktir, çünkü mitofaji seviyeleri hem C.elegans hem de farelerde deney koşullarındaki değişikliklere çok duyarlıdır.35 milimetre cam tabanlı bir mikro kuyu kabına, 10 milimetre mikro kuyuya 300.000 ila bir milyon hücre tohumlayın, böylece hücreler ertesi gün% 70 birleşmeye ulaşır. Hücreleri tam hücre kültürü ortamında tutun ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir inkübatörde inkübe edin. Ertesi gün, 15 mikrolitre DNA transfeksiyon reaktifini, üreticinin protokolüne göre 150 mikrolitre serum serbest ortam ile seyreltin.Ayrıca, mito-Keima plazmit DNA'sının iki ila beş mikrogramını 150 mikrolitre serum içermeyen ortamla seyreltin. Seyreltilmiş mito-Keima plazmidini seyreltilmiş DNA transfeksiyon reaktifine ekleyin ve karışımı 10 saniye boyunca girdaplayın. Daha sonra karışımı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.Daha sonra, DNA transfeksiyon reaktif karışımını hücrelere damla damla ekleyin, çözeltiyi karıştırmak için plakaları beş ila 10 saniye hafifçe sallayın. Bu noktada, hücreleri tekrar inkübatöre yerleştirin ve 24 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, ortamı taze tam hücre kültürü ortamına değiştirin ve ardından transfekte edilmiş hücreleri 24 saat daha inkübe edin.Konfokal mikroskopi kullanarak transfekte edilmiş hücreleri görüntüleyin. Her kuyucukta toplam 100 ila 200 hücreyi belgelemek için 40 kat büyütme altında 20 alanı rastgele görüntüleyin. Birinci gün, vücut duvarı kas hücrelerinde hem DCT-1 GFP hem de DSRed LGG-1 eksprese eden transgenik hayvanların L4 larvalarını toplayın ve bunları bir OP50 tohumlu nematod büyüme ortamı plakasına yerleştirin.En az üç plaka kullanarak her 3,5 santimetrelik plakaya beş ila 10 solucan yerleştirin. Bittiğinde nematodları 20 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, beşinci günde, 15 ila 20 L4 transgenik larva seçerek ve bunları taze OP50 tohumlu plakalara aktararak nematodları senkronize edin.Her deney koşulu için en az beş plaka kullanın. Yedinci günde, araç plakalarının bir kısmını ilgilenilen ilaçları etkileyen mitofaji için ve bazılarını pozitif kontrol olarak kullanmak üzere hazırlayın. Daha sonra, plakalar üzerindeki mitofajiyi indükleyen bileşiklerin bakteriler tarafından metabolize edilmemesini sağlamak için E.coli tohumlu plakaları santimetre kare başına 222 mikrowatt yoğunlukta 15 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın.Şimdi, 10 mikrolitrelik ilgilenilen bileşiği ekilen plakaların üstüne ekleyin ve negatif kontrol olarak araç plakalarına eşdeğer miktarda bileşik araç ekleyin. Mitofaji indüksiyonunun pozitif kontrolü için, bir mitokondriyal toksik madde olan paraquat ekleyin. Solüsyon tüm yüzeyi kaplayana kadar plakaları hafifçe döndürün ve plakaların kapakları kapalıyken oda sıcaklığında en az bir saat kurumasını bekleyin.Kuruduktan sonra, 10 ila 20 iki günlük yetişkin transgenik hayvanları plakalara aktarın. Onları iki gün boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin. Dokuzuncu günde,% 2 agaroz pedleri hazırlayın ve ped başına M9'da bir damla 20 milimolar levamisol ekleyin.Transgenik hayvanları M9 levamisol damlasına yerleştirerek görüntüleme için hareketsiz hale getirin. Ardından, damlanın üstüne nazikçe bir kapak fişi yerleştirin. Numuneyi konfokal bir mikroskop sahnesine yerleştirin ve 63 kat büyütme altında Z-yığını görüntüleri alarak tek vücut duvarı kas hücrelerini görüntüleyin.Dokuyu hızla soğutmak için taze, izole edilmiş bir mito-Keima fare karaciğerini soğutulmuş metal bir plakaya, buz üzerine yerleştirin. Mito-Keima proteininden gelen sinyal buz üzerinde bir saate kadar sabit kaldığından, dokuyu mümkün olduğunca çabuk işlerken orada tutun. Daha sonra, karaciğer örneğini kaldırmak için bir çift kavisli forseps kullanın ve beş mililitre buz gibi soğuk PBS ile durulayın.Son olarak, iki ardışık uyarma ile konfokal mikroskopi kullanarak doku kesitlerini görüntüleyin. Burada sunulan prosedür kullanılarak, insan HeLa hücreleri mito-Keima plazmidi ile transfekte edildi. Sağlıklı hücreler, az sayıda mitofaji insidansı ile iyi organize edilmiş bir mitokondriyal ağ gösterdi.Bununla birlikte, bir mitokondriyal birleştirici FCCP ile ön işleme tabi tutulan hücreler, mitofaji insidansında derin bir artış göstermiştir. Mitofaji ayrıca LAMP2 ve COXII'nin birlikte lokalizasyonu kullanılarak ölçüldü. C.elegans'ta mitofajinin in vivo tespiti için, vücut duvarı kas hücrelerinde MT rosella eksprese eden transgenik nematodlar sekiz milimolar parakuat ile tedavi edildi.pH'a duyarlı floresan oranındaki bir azalma ile gösterilen mitofaji indüksiyon seviyesinin, parakuat ile muamele edilen nematodlarda önemli ölçüde azaldığı bulundu. Ek olarak, DCT-1 kaynaşmış GPF ve DSRed kaynaşmış LGG-1 arasındaki yüksek sayıda ko-lokalizasyon olayı, oksidatif strese yanıt olarak mitofaji stimülasyonunu gösterir. Son olarak, bu görüntüler bir mito-Keima faresinin karaciğerinden ve beyinciğinden gelen mito-Keima sinyallerini temsil eder.Dokuların soğuk tutulması ve mümkün olduğunca çabuk görüntülenmesi gerekir, ancak uygun şekilde hazırlandığında, normal ve patofizyolojik koşullarda mitofaji hakkında bilgi sağlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin kullanımı, nöro-dejenerasyon ve mitokondri biyolojisi alanındaki araştırmacıların, kültürlenmiş hücreler, solucanlar veya C.elegans ve fare modelleri dahil olmak üzere farklı model sistemlerinde mitokondriyal işlevleri keşfetmelerinin yollarını açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, hem C.elegans'ta hem de farelerde mitofaji seviyelerinin kantitatif değerlendirmesinde kullanılacak birden fazla yöntemi kavramanız gerekir.

in-vitro-vivo-detection-mitophagy-human-cells-c-elegans

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu video, Caenorhabditis elegans'ta mitofajiyi incelemek için in vivo bir testi göstermektedir. Nematodları mitofajiyi indükleyen bir ilaca maruz bıraktıktan sonra, mitofaji oluşumu, hasarlı mitokondri üzerindeki bir mitofaji reseptörü olan DCT-1 ile otofagozomal membran proteini LGG-1 arasındaki ko-lokalizasyon ile değerlendirilir.

Transgenik Nematodlarda Mitofajiyi Tespit Etmek için İn Vivo Bir Test

Model organizma Caenorhabditis elegans'ta mitokondriyal inhibitörlerin etkilerinin in vivo tespiti ve potansiyel arttırıcı bileşiklerin tanımlanması için bir protokol tanımlanmıştır. Bu protokol, mitokondriyal fonksiyonu modüle eden bileşikler için ilaç kütüphanelerini taramak için kullanılabilir.

Bir taranabilir<em&gt; İn Vivo</em&gt; Transjenik biyolojik olarak ışık veren kullanarak Mitokondriyal Modülatörleri için tahlil<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Drosophila'nın dağıtılmış embriyonik hücrelerini kullanarak bir fagositoz tahlili burada tarif edilmektedir. Bu, in vivo fagositoz seviyelerini kolay ve kesin bir şekilde ölçmemize ve apoptotik hücrelerin fagositozu için gerekli olan yeni molekülleri belirlememize olanak tanır.

Apoptotik Hücreler İçin Fagositoz Testi Drosophila

Mitophagy, mitokondri, seçici bozulması mitokondrial homeostazı karıştığı ve çeşitli insan hastalıklarda deregüle. Ancak, mitophagy etkinliğini ölçmek için uygun deneysel yöntemleri çok sınırlıdır. Burada, biz hassas bir tahlil akış sitometresi kullanarak mitophagy etkinliğini ölçmek için sağlar.

Hassas ölçüm Mitophagy floresan muhabir akış sitometresi kullanarak pH bağımlı mt-Keima tarafından

Dinamik mikrotübüllerin floresan etiketli Uç bağlayıcı protein kullanılarak vivo olarak görüntülenmesi için bir protokol sunulmuştur. C. elegans'ınPosterior lateral mikrotübül (PLM) nöronunda dinamik mikrotübülleri etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıkladık.

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

Mitofaji'yi elektron mikroskobu, genetik sensörler ve immünofloresan yoluyla keşfetmek, pahalı ekipman, yetenekli personel ve önemli bir zaman yatırımı gerektirir. Burada, ticari bir floresan boya kitinin hem Caenorhabditis elegans hem de bir karaciğer kanseri hücre hattındaki mitopaji sürecini ölçmedeki etkinliğini gösteriyoruz.

Caenorhabditis elegans ve Memeli Hücrelerinde Mitopajinin Organele Özgü Boyalar Kullanılarak Saptanması

Bu protokol, pankreas β hücrelerinde mitofajinin kantitatif analizi için iki yöntemi özetlemektedir: birincisi, hücre geçirgen mitokondriye özgü boyaların bir kombinasyonu ve ikincisi, genetik olarak kodlanmış bir mitofaji raporlayıcısı. Bu iki teknik tamamlayıcıdır ve belirli ihtiyaçlara göre konuşlandırılabilir, bu da mitokondriyal kalite kontrolünün nicel olarak ele alınmasında esneklik ve kesinlik sağlar.

Pankreas β Hücrelerinde Mitofaji Akısını Sorgulamak İçin Tamamlayıcı Yaklaşımlar

Bu protokol, yaşlanma sırasında C. elegans'ın çoklu dokularında mitokondriyal morfolojiyi görüntülemek için standart bir yaklaşım sağlar.

Yaşlanma Sırasında C. elegans'ta Mitokondriyal Morfolojinin Görüntülenmesi ve Ölçülmesi

Insan retinoblastom farelerde tümörlerin yaymak için bir yöntem açıklanmıştır. Tümör hücreleri bağışıklık eksikliği olan farelerde gözlerinin içine doğrudan enjekte edilir. İkincil tümörlerin başarıyla doğrudan insan tümörleri ve kültürlü tumorspheres hasat hücreler kullanılarak kurulmuştur.

Bağışıklık Eksik Fare Kuruluş ve İnsan Retinoblastom Tümörler yayılımı

Biz burada insan epileptik kortikal doku çoklu elektrot dizisi kayıtları nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Interiktal ve iktal olayların epileptik doku rezeksiyonu, dilim hazırlık ve multi-elektrot dizisi kayıtları ayrıntılı olarak gösterilmiştir.

İnsan Epileptik Ameliyat sonrası Kortikal Doku Çok elektrot Dizi Kayıtlar

Öğrenin, insan hücreleri, C. elegans ve farelerde mitofajiyi in vitro ve in vivo tespit etme yöntemlerini. Bu teknikler, nörodejeneratif hastalıklara karşı yeni tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

Vitro ve In Vivo insan hücreleri, C. Elegansve fareler Mitophagy tespiti

Daha fazla video keşfet