Sistein Thiols rekombinant proteinler Vitro siteye özgü Glikozilasyon için hedefleme

Bu prosedürün genel amacı, doğal olarak glikosile edilmiş bölgelerde bölgeye yönlendirilmiş mutajenez yoluyla proteinlerdeki sistein kalıntılarını dahil etmek ve glikozilasyonun etkinliğini ve yapısal etkilerini değerlendirmek için in vitro glikoz bağlanması ve değerlendirme yaklaşımlarını kullanmaktır. Bu yöntem, Yapısal Biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin, protein glikozilasyonunun yapısal sonuçları nelerdir ve bu modifikasyonlar, fonksiyonun altında yatan mekanizmaları nasıl etkiler? Bu tekniğin temel avantajları, glikozilasyonu incelemek veya işlemek için kolayca uyarlanabilmesidir.

Oldukça verimlidir ve hem yapı bozulmaları hem de verimlilik hızlı bir şekilde değerlendirilebilir. Bu tekniğin etkileri, hastalıkların tedavisine doğru uzanır, çünkü değişen glikozilasyon paternleri çeşitli kanserler ve nörodejeneratif bozukluklarla ilişkilendirilmiştir. Bu yöntem, doğal olarak glikosile edilmiş proteinlerin etkileri hakkında fikir verebilse de, glikozilasyon modellerinin nasıl değiştirileceği konusunda çok ihtiyaç duyulan bilgileri de sağlayabilir, bu hastalık yelpazesine katkıda bulunabilir.

Ekspresyon vektöründe tek bir sistein mutasyonu eklemek için iki ayrı PCR reaksiyon tüpü hazırlayın. İlk tüpte, ileri mutajenik astarı ekleyin ve ikinci tüpte, ters mutajenik astarı ekleyin. Her iki tüpe de son bir 1X PCR tamponu konsantrasyonu ekleyin.

Ardından, iki ayrı PCR reaksiyon tüpü için beş döngülü bir program oluşturun. Beşinci döngünün sonunda 72 santigrat derecede yedi buçuk dakikalık bir uzatma süresi ekleyin. Beş döngü tamamlandıktan sonra, iki ayrı PCR reaksiyonunu tek bir tüpte karıştırın, tüpü yaklaşık üç saniye santrifüjleyin ve aynı PCR koşullarını takiben 20 döngü daha tekrarlayın.

Daha sonra, numunenin 15 mikrolitresini 40 dakika boyunca 120 Volt'ta% 1 DNA agaroz jeli üzerinde çalıştırın. Daha sonra jeli mililitre etidyum bromür başına 0.5 miligram içeren suya batırın ve oda sıcaklığında 30 dakika çalkalayın. Ardından, şablonun UV ışığı altında 302 nanometre dalga boyunda amplifikasyonunu onaylayın.

Bundan sonra, kalan 25 mikrolitre PCR reaksiyon karışımına 0,5 mikrolitre DPN1 kısıtlama enzimi ekleyin. Metillenmiş şablon DNA'yı sindirmek için karışımı 37 santigrat derecede iki buçuk saat inkübe edin. Daha sonra, sindirilmiş karışımdan yaklaşık beş ila 10 mikrolitreyi 100 mikrolitre ısı şokuna yetkin E.coli hücrelerine ekleyin ve 60 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Daha sonra, hücre-DNA karışımını kuru bir ısı bloğu üzerinde 45 saniye boyunca 42 santigrat derecede ısı şoku uygulayın. Ardından, karışımı hemen buz üzerinde üç dakika inkübe edin. Daha sonra, hücrelere 900 mikrolitre LB suyu ekleyin ve süspansiyonu steril 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.

90 dakika boyunca 190 rpm'de sürekli çalkalayarak 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, santrifüjlenmiş hücre peletini antibiyotik takviyeli agar plakalarına yayın. Plakaları 16 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, plakadan tek bir koloniyi aseptik olarak beş mililitre antibiyotik takviyeli LB ortamına aşılayın. Ardından, kültürü sürekli çalkalama ile gece boyunca 37 santigrat derecede büyütün. Sistein kalıntısı mutasyona uğramış plazmiti ısı şoku tedavisi yoluyla E.coli hücrelerine dönüştürün, ardından kültürü gece boyunca antibiyotik takviyeli LB ortamında büyütün.

Ertesi gün, kanamisin takviyeli LB agar plakalarına doğrudan 150 mikrolitre hücre süspansiyonu yayın ve plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübasyon için tutun. Ertesi gün, tek bir koloniyi bir Erlenmeyer şişesinde 20 mililitre LB ortamında aseptik olarak aktarın ve 37 santigrat derecede gece boyunca inkübasyon için bırakın. Ertesi gün, gece boyunca kültürü 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Daha sonra, gece boyunca sıvı kültürü 15 dakika boyunca 2.400 kez G'de santrifüjleyerek hücreleri peletleyin. Daha sonra, hücre peletine 10 mililitre M9 minimal ortamı ekleyin ve ardından hücresel karışımı kanamisin içeren bir litre M9 ortamında askıya alın. M9 sıvı kültürünü, 600 nanometredeki optik yoğunluk yaklaşık 0,6 ila 0,8'e ulaşana kadar yaklaşık 190 rpm'de sürekli çalkalama ile 37 santigrat derecede büyütmeye devam edin.

Ardından, protein ekspresyonunu indüklemek için M9 kültürüne 200 mikromolar IPTG ekleyin ve kültürün gece boyunca büyümesine izin verin. Ertesi gün, bakteri hücrelerini 30 dakika boyunca dört santigrat derecede yaklaşık 10.000 kez G'de santrifüjleyerek gece kültüründen peletleyin. 10 mililitrelik motorlu transfer pipeti kullanarak, donmuş bakteri hücresi peletini yaklaşık 40 mililitre homojenizasyon tamponunda homojenize edin.

Daha sonra homojenatı bir hibridizasyon fırınında sabit dönüşle 90 dakika inkübe edin. Çözünür protein fraksiyonunu çözünmeyen peletten ayırmak için karışımı yaklaşık 15.000 kez G'de sekiz santigrat derecede 40 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatana hacimce %50 hacimce nikel nitrilotriasetik asit agaroz boncuk bulamacı ekleyin ve oda sıcaklığında 90 dakika boyunca hibridizasyon fırınında ters çevirerek inkübe edin.

Daha sonra, nikele bağlı hekzahishidin etiketli protein içeren agaroz boncuklarını toplamak için bir yerçekimi akışı protein saflaştırma sütunu kullanın. Son olarak, toplanan agaroz boncuklarını üç kez yıkayın. Proteinleri iki mililitrelik fraksiyonlardan oluşan bir dizi halinde elute edin.

Daha sonra, ayrıştırılmış fraksiyonlarda saflaştırılmış hekzahishidin etiketli proteini bir Coomassie mavisi lekeli SDS-PAGE jeli çalıştırarak onaylayın. Ayrıştırılmış protein fraksiyonlarını 3.500 dalton moleküler ağırlıklı bir kesme ile bir diyaliz membranına toplayın ve manyetik karıştırma ile gece boyunca dört santigrat derecede yeniden katlama tamponunda inkübe edin. Daha sonra, diyaliz membranında toplanan proteine miligram protein başına yaklaşık bir ünite trombin ekleyin ve tekrar dört santigrat derecede bir gün inkübe edin.

Ertesi gün, proteini diyaliz torbasından çıkarın ve 10.000 dalton moleküler ağırlık kesimine sahip bir ultrafiltrasyon santrifüj yoğunlaştırıcı kullanarak yaklaşık on kat konsantre edin. Daha sonra, protein konsantresini sodyum klorür içermeyen yeniden katlama tamponu içinde yaklaşık 20 kat yeniden seyreltin. Proteini saflaştırmak için, aynı sodyum klorür içermeyen tampon ile dengelenmiş önceden paketlenmiş bir anyon değişim kolonuna yükleyin.

Proteinleri, yeniden katlama tamponu içeren bir molar sodyum klorür sıfır ila% 60 gradyanında ayırmaya başlayın. Toplanan protein fraksiyonlarını bir diyaliz torbasına aktarın. Proteini, optimal molar sodyum klorür konsantrasyonu ile deneysel yeniden katlama tamponuna değiştirmek için gece boyunca dört santigrat derecede bir diyaliz adımı gerçekleştirin.

İlk olarak, proteinin glikosilasyonu için 1.5 mililitre yaklaşık 60 mikromolar proteini bir litre modifikasyon tamponuna diyaliz edin. 24 saat sonra, dört santigrat derecede, modifiye edilmiş proteini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve DMSO'da çözündürülmüş glikoz-5-MTS'yi iki milimolar nihai konsantrasyona ekleyin. Numuneyi karanlıkta ortam sıcaklığında bir saat inkübe ederken her 10 dakikada bir mikrosantrifüj tüpüne hafifçe vurun.

İnkübasyondan sonra, proteini son deneysel tampona yeniden değiştirmek için dört santigrat derecede diyaliz yapın. Elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi kullanarak proteinin doğru kütlesini ölçün. Son olarak, modifikasyon verimliliğini hesaplamak ve proteindeki glikosile cys kalıntılarının yapısal değişikliklerini belirlemek için NMR çözeltisini kullanın.

Bu temsili %1 DNA agaroz jelinde başarılı bir mutasyonel PCR amplifiye şablon DNA gösterilmiştir. DNA merdiveni ve PCR ile amplifiye edilmemiş eşdeğer miktarda şablon DNA, jelde kontrol olarak kullanılır. Yüksek yoğunluklu etidyum bromür boyamaya sahip en üst bant, istenen boyutta güçlendirilmiş şablonu gösterir.

Daha sonra, protein bir anyon değişim sütunu kullanılarak saflaştırıldı. Kromatogram, mavi renkte 280 nanometrede gözlemlenen bir elüsyon profilini gösterir ve kırmızı ile gösterilen bir sodyum klorür gradyanına karşı elüsyon gösteren üç tepe gösterir ve 0.6 molar kadar artan konsantrasyona sahiptir. Alt panel, protein fraksiyonlarının Coomassie mavisi lekeli SDS-PAGE jelini gösterir.

Sistein kalıntılarının glikozilasyonu, elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi ile belirlendi. Kromatogram, sistein kalıntısının glikosilasyonundan önce ve sonra modifiye edilmemiş ve modifiye edilmiş proteinin kütlelerini gösterir. Doğrulama için, glikosile proteinin hem modifikasyonlarını hem de yapısal bozulmalarını gösteren, kalıntı spesifik amid kimyasal kaymalarının HSQC spektral kaplamasını gösteren NMR çözeltisi gerçekleştirildi.

Ustalaştığında, mutajenezden NMR değerlendirmesine kadar tüm aşamalar, primer sentezi, DNA dizilimi ve kütle spektroskopisi hizmetleri için bekleme süresi hariç yaklaşık 12 günde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, temel hat kontrol ölçümleri olarak tiyol modifikasyonunun yokluğunda sistein mutasyonlarının yapısal ve biyofiziksel etkilerini değerlendirmeyi hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, altta yatan protein fonksiyonlarının biyofiziksel özelliklerinin glikozilasyondan nasıl etkilendiğini ortaya koymak için stabilite, ikincil yapı, iyon bağlanması, protein-protein etkileşim değerlendirmeleri gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, kalsiyum sinyalizasyonu alanındaki araştırmacıların, asparagin 131 ve asparagin 171'in rollerini ve mağaza tarafından işletilen kalsiyum girişi ile ilişkili stromal etkileşim molekülü bir kalsiyum sinyalindeki glikosilasyonun bireysel ve kümülatif olarak değerlendirilmesinin yolunu açtı.