Birincil insan T lenfositler tarafından ataç-Seq genom genelinde erişilebilir Kromatin eşleme

Transpozaz kullanan bu yüksek verimli yöntemin genel amacı, insan genomundaki erişilebilir kromatin bölgelerini tanımlamaktır. Bu yöntem, düzenleyici unsurların genom çapındaki konumları gibi epigenomik alanlardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajları, sağlam olması, nispeten kısa olması ve DNase-seq veya FAIRE-seq gibi diğer kromatin erişilebilirliğini ölçme yöntemlerine göre daha az başlangıç malzemesi gerektirmesidir.

Bu yöntem, insan T lenfositlerinin düzenleyici manzarası hakkında fikir verebilse de, diğer insan birincil hücreleri, kanser hücreleri, insan klinik örnekleri, diğer memelilerden ve organizmalardan alınan hücreler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. 10 milyon insan PBMC'sinin bir mililitrelik bir alikotunu çözün ve 10 mililitre takviye RPMI ortamı içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Onlar, hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 G'de santrifüjleyin.

Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve hücreleri 15 mililitre takviye RPMI ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri bir T-75 kültür şişesine aktarın ve gece boyunca nemlendirme ile inkübe edin. Ertesi gün, yüzen hücreleri steril 25 mililitrelik bir pipetle 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Ardından, tripan mavisi dışlamasını kullanarak canlı hücreleri sayın. Daha sonra, CD4 pozitif hücrelerini, bir mikroboncuk ayırma sütunu kullanarak 10 milyon canlı, yapışmayan PBMC'den izole edin. Hücreler izole edildikten sonra, metin protokolüne göre Th1 ve Th2 polarizasyon koşullarında T hücrelerini plakalayın ve aktive edin ve ardından çekirdeklerini izole edin.

Olmak için taze lizis tamponu hazırlayın ve buz üzerinde soğuk tutun. Ayrıca, transpozisyon reaksiyonuna hazırlanırken, bir termal çalkalayıcıyı 37 santigrat dereceye ısıtın. Daha sonra, yarım milyon T hücresini 1.5 mililitrelik mikrotüplere yükleyin ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 Gs'de döndürün.

Daha sonra, hücreleri bir mililitre soğuk PBS ile yıkayın ve sıkma döngüsünü tekrarlayın, ancak şimdi hücreleri bir mililitre soğuk lizis tamponunda askıya alın. Çekirdeklerin çok fazla bozulmasını önlemek için hücreleri nazik pipetleme ile karıştırın. Ardından, hücrelerin parçalanmasını gözlemlemek için hızlı bir şekilde 10 mikrolitrelik alikotlar alın.

Hücreleri soğuk tuttuğunuzdan ve hızlı çalıştığınızdan emin olun. Beş dakika içinde transpozisyon reaksiyonuna devam edin. Başlamak için, 100.000 çekirdeği 1.5 mililitrelik bir mikrotüpe aktarın ve numuneyi soğuk bir santrifüjde 10 dakika boyunca 500 Gs'de döndürün.

Ardından, süpernatanı yavaşça çıkarın. Ardından, transpozisyon reaksiyonu bileşenlerini çekirdeğe ekleyin. Ardından, çekirdekleri hafif pipetleme ile yeniden süspanse edin ve transpozisyon reaksiyonunu tamamlamak için çekirdekleri termal çalkalayıcı üzerinde 500 RMP'de 30 dakika inkübe edin.

Ardından, bir DNA temizleme adımı gerçekleştirin ve DNA parçalarını 20 mikrolitre Tris hidroklorür içinde elüte edin. Ardından, ATAC sıralama kitaplıklarının ilk amplifikasyonunu yapmak için bir PCR kullanın. Ardından, kantitatif PCR ile son amplifikasyon için gereken optimal ek döngü sayısını değerlendirin.

Ölçülen sonuçlardan, ATAC dizileme kitaplıklarının son PCR amplifikasyonu için gereken döngü sayısını belirleyin. Ardından, son amplifikasyonu gerçekleştirin. Optimal boyutta bir DNA kütüphanesi parçası oluşturmak, yeni nesil dizilemeyi iyileştirebilir.

İlk olarak, manyetik boncukları oda sıcaklığına ısıtın ve nükleaz içermeyen suda taze% 70 etanol hazırlayın. Daha sonra, ATAC dizileme kitaplıklarına 100 mikrolitrelik bir hacme kadar nükleaz içermeyen su ekleyin. Ardından, 50 mikrolitre yeniden askıya alınmış DNA bağlayıcı manyetik boncuk ekleyin.

Boncukları DNA'ya en az 10 kez pipetleyin ve beş dakika bekleyin. Tüp duvarına veya kapağına herhangi bir damla boncuk yapışırsa, tüpü kısa bir süre döndürün. Şimdi, numuneyi iki dakika boyunca mıknatısın yanına yerleştirin ve ardından süpernatanı yeni bir mikrotüpe aktarın.

Koleksiyonun hacmini ölçün ve %70'lik bir manyetik boncuk süspansiyonu ekleyin. Boncukları daha önce olduğu gibi karıştırın ve devam etmeden önce beş dakika kuluçkaya yatırın. Ardından, mıknatısı iki dakika boyunca kullanarak boncukları ayırın ve şimdi süpernatanı atın.

Hala mıknatısa karşıyken, boncuklara 200 mikrolitre% 70 etanol ekleyin. 30 saniye bekleyin, ardından etanolü atın ve etanol yıkamasını bir kez daha tekrarlayın. Kalan etanolü tamamen çıkararak ve boncukların mıknatıs üzerinde beş dakika kurumaya bırakarak yıkamaları bitirin.

Gerekirse, tüpü kısaca döndürün ve 10 mikrolitrelik bir pipetle görünür etanolü aspire edin. Şimdi, tüpü mıknatıstan çıkarın ve 22 mikrolitre Tris hidroklorür ekleyin. İki dakika sonra, tüpü manyetik standa geri koyun ve çözeltinin berraklaşmasına izin verin.

Daha sonra hazırlanan kütüphaneyi içeren 20 mikrolitre elüat toplayın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. Bu protokol, tipik olarak mikrolitre başına üç ila 20 nanogram olan bir ATAC sıralama kitaplığı üretir. DNA bütünlük analizi için bir sistem üzerinde çalıştırıldığında, merdiven benzeri bir görünüme sahiptirler.

Diğerlerinin yanı sıra, bir diğer önemli kalite kontrolü, pozitif kontrollerin zenginleştirilmesidir. Negatif kontrollere göre, primer çifti üç en az 25 kat, primer çifti dört en az 75 kat zenginleştirilmelidir. İlk 10 milyon okumadan sonra, örnek FastQC Rapor dosyasındaki tüm önemli parametreleri geçerse ve tepe çağrısından 1.000 ila 2.000 tepe noktası elde edilirse, kitaplık 30 milyondan fazla okuma için daha derin bir şekilde sıralanabilir.

Kalite standartlarını karşılayan kütüphanelerden, okumaların yalnızca %altı ila %20'si mitokondriyal genomla eşleşir. Kalan benzersiz okumalar, referans insan genomuyla eşleşir ve yedi ila %12'si ATAC dizileme zirveleri içindedir. Bu videoyu izledikten sonra, ATAC-seq kütüphanelerinin nasıl yapılacağını, rasyon diziliminin nasıl gönderileceğini ve sağlanacağını ve elde edilen verilerin nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Bir kez ustalaştıktan sonra, ATAC-seq kitaplığı hazırlığı bir veya iki iş günü içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, belki de önce bir çekirdek izolasyon adımında hücre sayısı ve lizis tamponunun bileşimi gibi bazı adımları optimize etmeniz gerekeceğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, incelenen örneklerdeki açık kromatin bölgelerine hangi transkripsiyon faktörünün bağlandığı gibi ek soruları yanıtlamak için kromatin immünopresipitasyonu gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.