Name: Canlı Drosophila yumurtalık dokusu içinde folikül kök hücre soyundan Imaging hücre içi pH için yöntemleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Öğrenin canlı Drosophila yumurtalık dokusunda folikül kök hücrelerinin hücre içi pH değerlerini ölçme yöntemini. Bu teknik, kök hücre davranışları ve gelişimsel biyoloji alanında pH dinamiklerini incelemek için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bryne Ulmschneider Protokolü ve Diane Barber telkin üstünde el yazması için katkılarından dolayı teşekkür ediyoruz. Bu eser sağlık grant GM116384 T.G. Nystul ve D.L. Kuaför için Ulusal Enstitüsü tarafından finanse edildi.

Not: pHi FSC Silsilesi içinde ölçmek için Floresans yoğunluklarını, pHluorin mCherry FSCs, PFC ve folikül hücreleri fizyolojik koşullar için oranını hesaplamak ve pHi değerleri standart oranları dönüştürmek her hücre için kalibrasyon eğrileri 7 yazın. İlk, canlı görüntüleme deneyler Floresans yoğunluklarını pHluorin ve mCherry germaria NaHCO 3 fizyolojik şartlarda 1 , taklit eden, içeren bir arabelleğe disseke ölçmek için gerçekleştirilir 7. sonraki, standart eğrileri na + pHluorin ve mCherry floresan yoğunluklarını ölçerek oluşturulur-ücretsiz, K + arabellek ionophore nigericin içeren iki farklı pH değerine ayarlanmış 6.5 ve 7,5. Nigericin huzurunda, pHi pHi ekstrasellüler pH eşleştirilecek neden plazma zarı arasında tampon pH ile Sakinleştiği. Son olarak, standart eğrileri pHluorin mCherry oranları tahmini pHi değerlere dönüştürmek için kullanılır.
 1. duruşma öncesi: önce hazırlık ölçme pHi In Vivo Not: pHi vivo ölçmek için mCherry::pHluorin transgene faiz hücre türü ifade edilebilir. Aşağıda transgenik pHluorin üretmek için ortak bazı yollar FSC lineage sinekler vardır. MCherry::pHluorin klonlar üretiliyor FSC klon ön kenarında bulunan FSCs tanımlamak için özellikle yararlıdır. Doku belirli mCherry::pHluorin ifade tüm doku pHi ölçmek için yararlıdır ve aynı zamanda bir RNAi veya transgene ifade ile birleştirirken daha uygundur.
<ol><li>MCherry::pHluorin etiketli-FSC transgenik pHluorin nesil uçar <ol><li>mCherry::pHluorin FSC klonlar, yapmak klonlar <ol><li>çapraz UAS-mCherry::pHluorin 1 bir Act-Gal4 fiske vurmak için hisse senedi veya diğer hisse senedi ile Flp/FRT indüklenebilir Gal4.</li>
			<li>Heatshock indüklenebilir klonlar, heatshock yapmak eclosion bir 37 ° C su banyosunda dört kez yaklaşık 12 her h. 1 h için boş şişeleri içinde yetişkin F1s 2 gün sonrası</li>
			<li>Uçar normal büyüme ve oogenesis en büyük oranda bu dönemde emin olmak için taze ıslak Maya sağlayarak korumak (yaklaşık eşit parçaya kuru baker &#39; s Maya ve su) günlük için en az 6 gün sonra klon indüksiyon.</li>
		</ol></li> <li>Doku belirli mCherry::pHluorin ifade</li> <li>çapraz UAS-mCherry::pHluorin 1 folikül hücre belirli bir sürücü için y 1 w *; P {GawB} 10930/CyO (Bloomington kimliği: 7023).</li>
		<li>3 gün sonra eclosing, sinekler başlatmak toplamak ve en az 24 saat önce diseksiyon için ıslak Maya içeren şişeleri yerleştirebilirsiniz.</li>
	</ol></li> <li>Çözümleri yapma Not: tampon pH ve çözünen konsantrasyonlarda zamanla değişebilir çünkü aşağıdaki arabellekleri deneme günü hazırlamak önemlidir.
	<ol><li>Hazırla bikarbonat, nigericin ve diseksiyon arabellekleri. Bileşenleri sırada listelenen precipitates (Tablo 1, Tablo 2 ve Tablo 3 bakın) oluşumunu önlemek için eklemek.</li>
	</ol></li></ol> 2. Deneme: FSC Lineage pHi ölçme Not: diseksiyon, montaj ve canlı görüntüleme bikarbonat tampon ve iki nigericin tampon koşulları için adımları iki kez yapılması gerekebilir: mikroskop belirlemek için bir kez ayarları ve ikinci kez deneysel veri toplamak için. 2.2 aşağıda daha fazla bilgi için bkz:.
<ol><li>Diseksiyon ve montaj Not: Bu adımı gerçekleştirmek için gereken malzemeler için bakınız şekil 1 ve Tablo malzemeler için. 3D yazdırılan montaj salonları için 3D yazıcı dosyaları ek dosya 1 ve ek dosya 2 sağlanır.
	<ol><li>Diseksiyonu: <ol><li>hazırla montaj Odaları ince bir kaplama vakum yağ 3D düz tarafına uygulayarak yazdırılan montaj odası. Coverslip montaj odasına imzalamaya 22 x 40 mM coverslip o tarafa yerleştirin.</li>
		</ol></li> <li>Yumurtalık kadın yetişkin sinekler 500 µL diseksiyon arabelleği (bikarbonat veya nigericin tampon, Tablo 3) üzerinden incelemek <ol><li>3-4 sinekler CO 2 gaz kullanarak anestezi ve transfer uçar CO ile derin bir sinek yastık üzerine 2 gaz.</li>
			<li>İmzalat bir sinek kadar forseps ve yer diseksiyon medya içine almak.</li>
			<li>Bir forcep, sinek göğüs, yumurtalık maruz kadar onun karın ucunda çekiştirmeye süre çimdik.</li>
			<li>Yumurtalıklar diğer organlara üzerinden ayırma sonra ayrı 22 1/2 şırınga iğneleri kullanarak ovarioles tease. Dikkatle ayrı kas kılıf yumurtalık ve ovarioles kümesinden ayrı tek tek ovarioles. Kas kılıf yalıtmak için etkili bir teknik ovarioles küme ön tarafında yerde tutun ve aşağı doğru tek ovarioles uzunluğu boyunca inme bir şırınga iğnesi kullanmaktır.</li>
			<li>Böylece tam nigericin diseksiyon ortam pH ile equilibrate hücrelerinin pHi için yeterli zaman montaj adıma geçmeden önce tam olarak 10 dk diseksiyon medyada disseke yumurtalık kuluçkaya. 
			Not: kas kılıf ovarioles kaldırıldığından emin olmak. Kas kılıf kullanarak tek tek hücreleri tanımlamak zordur Floresans sinyal azaltmak Concanavilin-A ve canlı görüntüleme sırasında kendiliğinden taşımak ovarioles neden olabilir.</li>
		</ol></li> <li>Montaj <ol><li>diseksiyon medya cam coverslip üzerine küçük bir damla içinde montaj odası yerleştirin.</li>
			<li>Transfer ayrılmış forseps kullanarak ovarioles.</li>
			<li>Önceki sahne yumurta chambers ile ilişkili germaria dan sonraki sahne yumurta odaları ayrı ve disseke germaria diseksiyon medya bırakma Merkezi'nde yerleştirilir emin olmak deneyin.</li>
			<li>Yuvarlak bir 12 mm coverslip ters tarafı için tırnak cilası iki küçük damla ekleyin ve yaklaşık 10 için kurutma s.</li>
			Öyle ki tırnak cilası ile o tarafı aşağı bakıyor olmalıdır ve diseksiyon medya rehber <li>yer yuvarlak coverslip üstünde belgili tanımlık damla diseksiyon medya içeren germaria ayrılmış. Oje dümdüz ve germaria pozisyonda güvenli kenarlı parçalarda bastırın. Çünkü o yerde güvenli olarak daha az coverslip yüzey üzerinde smear büyük tırnak cilası kullanmanızı öneririz.</li>
			<li>Montaj odası ek diseksiyon medya ile doldurun. Concanavalin-A boya içeren belirli bir arabellek durum-ebilmek var olmak kullanılmış-odası doldurmak için. 
			Not: Harcanan toplam zaman anatomi ve montaj 15dk aşmaması gerekir. Bu doku hasarı etkilerini en aza indirmek önemlidir ve hücre ölüm.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Canlı görüntüleme: Not: Bu adımda, önce bikarbonat durumu ve uygun mikroskop ayarları belirlemek için iki nigericin koşul görüntüleri toplamak; mikroskop ayarları gerektiği gibi ayarlayın ve görüntüler için deneysel veri toplamak. Confocal mikroskop görüntüleme yeteneğine sahip 3 kanallarında kullanın: GFP (475 uyarma/509 emisyon), mCherry (575 uyarma/610 emisyon) ve far-red (633 uyarma/647 emisyon). 
	Not: Kümesi mikroskop ayarları: toplanan görüntülerin piksel yoğunluklarda yoğunluk değerleri her resim kümesindeki sinyalinin ne çok düşük ne de doymuş olduğunu önemlidir bu yüzden Phi, tahminleri belirlemek için sayılabilir. Bir görüntü yakalanan yoğunluklarını dizi görüntü bit derinliği tarafından tanımlanır. Birçok durumda, 8 bitlik görüntüler varsayılan olarak oluşturulur, ancak daha geniş bir dinamik alan var 16-bit görüntüleri veri alma öneririz. Crosstalk floresan kanallar arasında en aza indirilir, böylece emisyon spektrum toplanan ayarları ayarlanması gereken bu yüzden her fluorophore değil üst üste emin olmak önemlidir. Bu ayarları sınamak için GFP için uyarma spektrumu kullanılarak bir örnek görüntü almak ve mCherry ve tersi için emisyon spektrumda toplamak. Eğer ayarları düzgün ayarlanabilir olması, her iki durumda da hiçbir sinyal olmalı. Böylece tüm üç görüntü kümeleri içinde sinyal piksel yoğunluklarda resim dosyasının dinamik aralığı içinde mikroskop (Yani, bir lazer tarama voltaj ayarları confocal, lazer güç ve iğne deliği boyutu) ayarlarını. Bizim deneyler için gerektiği gibi gerilim kazancı her deneme için optimize ederken 1.024 × 1024 biçimdeki 16-bit görüntüleri elde etmek için 40 x amacı ile confocal mikroskobu tarama beyaz bir ışık lazer kullanılır. Örneğin, bir deneyde, GFP, mCherry, gerilim kazancını ayarlayın ve %37.8, %72.9 ve %260, far-red anılan sıraya göre.
	<ol><li>Görüntü ovarioles nigericin diseksiyon tampon pH 6,5 ve öyle ki pHluorin ve mCherry görüntülerin piksel yoğunluklarda düşüktür ama kameranın algılama sınırları aşağıda ayarlarını.</li>
		<li>Ovarioles içinde nigericin diseksiyon tampon pH 7.5 başka bir set görüntü ve yüksek, ama değil doymuş pHluorin ve mCherry görüntülerin piksel yoğunluklarda vardır öyle ki ayarlarını.</li>
		<li>Görüntü yumurtalık bikarbonat diseksiyon tampon ve pHluorin ve mCherry görüntülerin piksel yoğunluklarda seçtiğiniz ayarlarla doymuş değil emin olun. Piksel doymuş, ayarları gerektiği gibi ayarlayın. 
		Not: ayar parametreleri farklı olabilir mikroskop kullanılan tam mikroskop kurulumu temel alınarak ve her deneme için optimize edilmiş olması gerekir. Mikroskop ayarlarını ayarladıktan sonra bunları deneme geri kalanı için değiştirmeyin. Ayarları kontrol ve deneysel koşullar arasında tutarlı olması gerekir. Bizim ilk pHi deneylerde, 2 ve 3 nokta nigericin kalibrasyon eğrileri oluşturulan ve iki yöntemden herhangi birini kullanarak hesaplanan pHi arasında anlamlı bir fark bulunamadı. Ancak, genel olarak, daha fazla puan kalibrasyon eğrisi içinde ek doğruluğunu geliştirmek için beklenir. Bu nedenle, eğrileri ile puan kaç deneysel koşullar belirli bir kümesi için gerektiğini belirlemek için farklı sayı üreten önerilir.</li>
	</ol></li> <li>Veri toplama: <ol><li>montaj ve bikarbonat ve nigericin arabellek koşullarda örneklerinin Imaging diseksiyon, gerçekleştirmek. Bir el örnekleri Imaging diseksiyon ve montaj, en uzun süreyi geçirdikten sonra Floresans yoğunluk ölçümleri canlı, sağlıklı doku yapılır emin olmak için 45 dk geçmemelidir.</li>
		<li>Her koşul için en az 5 germaria için görüntüleri elde.</li>
	</ol></li></ol> 3. Sonrası deneme: Görüntü analizi <ol><li>ölçü Floresans yoğunluklarını FSCs, PFC, ve folikül hücre <ol><li>arka plan çıkarma: <ol><li>Açık işlenmemiş FIJI Albümdeki her kanalda bir ayrı pencere (ile şekil 4 c).</li>
			<li>Sinyal olmadan görüntünün bir parçasını pHluorin kanal penceresinde bir bölge (ROI) ilgi çizmek için Dikdörtgen aracını kullanın.</li>
			<li>İsteğe bağlı adım: eşik alt sınırı ayarlayabilir, böylece arka plan aşağıda yoğunluk değerlerine sahip pikseller hariç ve eşik üst sınırını maksimuma ayarlayın. Eşik bu şekilde ayarladığınızda, sinyal olmadan görüntünün alanlarını çoğunlukla mavi ve açıkça görülebilir ( şekil 4A) sinyaldir.</li>
			<li>Ortalama Floresans şiddeti ROI ölçmek. Eşik adım 3'te ayarlarsanız, kontrol ettiğinizden emin olun &#34; Eşik sınırı &#34; ölçümleri ayarla iletişim kutusundaki.</li>
			<li>Ölçülen arka plan yoğunluğu her kanal ve süreç içinde bulunan çıkarma işlevini kullanarak görüntü dilim çıkarma &#8594; matematik menü.</li>
			<li>Yinele adımları 3.1.1.2-6 adım 3.1.1.2, mCherry kanal penceresinde, hariç için yeni bir dikdörtgen Dikdörtgen aracıyla çizim yerine, geri yükleme seçimi işlevini kullanın, Düzenle buldum &#8594; aynı olan bir dikdörtgen eklemek için seçim menüsü boyutları ve konumu görüntüde.</li>
		</ol></li> <li>FSCs tanımlamak, PFC ve folikül hücreleri: <ol><li>FSCs, PFC ve folikül hücre morfolojisi ve hücre sınırları ( Şekil 2) bulmak için kullanarak Concanavalin-A boyama konumuna göre tanımlama.</li>
			<li>FSCs bölge 2a/2b sınır germarium kenarında bulunan ince üçgen hücrelerdir. Eğer mCherry::pHluorin bir FSC klon ifade, FSC klon ön çoğu hücre da belirlenebilir.</li>
			<li>PFC hücreler düzensiz şekilli bölge 2B, hemen bitişiğinde ve aşağı FSCs.</li>
			<li>Folikül hücrelerdir germ hücreli kist bölge 3 çevreleyen kare veya sütunlar halinde hücre.</li>
		</ol></li> <li>Floresan yoğunluğu oranları elde etmek <ol><li>, faiz hücrenin bulunduğu yüksek floresan yoğunluğu mCherry kanalda bir veya birden çok dilim seçin ve Concanavalin-A, far-red kanalda gördüm bir boyama foc olduğundan emin olun Seçili dilim içimizde.</li>
			<li>Her FSC ve pHluorin ve mCherry tüm ortalama Floresans yoğunluğunu dilimler ölçümleri için seçilen ölçü ROI çizmek.</li>
			<li>PHluorin kanal ortalama Floresans yoğunluğunu pHluorin mCherry floresan için oranını hesaplamak için mCherry kanal ortalama Floresans yoğunluğunu tarafından bölmek.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Özellik türet pHi değer verir ve pseudocolored görüntüler oluşturmak <ol><li>özellik türet pHi değerleri <ol><li>her durumda, yumurtalık aynı genotip sinekler üzerinden kullanarak doğrusal regresyon eğrisi oluşturulmalıdır deneysel her ikisi için ve kontrol koşulları. İki nigericin tampon koşulları ( şekil 3) verilerini kullanarak her hücre türü için bir doğrusal regresyon eğrisi oluşturur. Excel'de, bu grafikte veri çizme ve doğrusal bir eğilim çizgisi ekleme yapılabilir. Alternatif olarak, bakın:</li> <li>eğim ve y kesme noktası doğrusal regresyon eğrisi hesaplanan nigericin koşulları ve doğrunun denklemi kullanım (y = mx + b) pHluorin mCherry oranı değerlere dönüştürmek için hesaplanan bikarbonat örneklerinden pH değerleri durumuna. Bu denklemdeki b için eğim formu (y-kesişim noktası) yerine, içinde oranı değeri x için koymak ve y. için çözmek</li>
		</ol></li> <li>FIJI oranı değerleri yansıtan bir pseudocolored görüntü oluşturmak.
		<ol><li>Takip yukarıdaki yordamı için arka plan çıkarma (Adım 3.1.1 ve şekil 4).</li>
			<li>İşlem menüsünden bulunan görüntü hesaplama işlevini kullanarak mCherry kanal pHluorin kanaldan bölün. Emin olun &#34; Oluştur yeni pencere &#34; ve &#34; 32-bit (float) sonucu &#34; onay kutuları işaretli. Arama tablosu (LUT) değiştirmek, termal veya LUT seçtiğiniz görüntü menüsü altında bulundu. şekil 4 uygun diğer seçenekler için bkz:.</li>
			<li>Ayarlayın parlaklık ve kontrast iletişim kutusunda (görüntü &#8594; ayarla &#8594; Parlaklık/Kontrast),'ı tıklatın &#34; ayarla &#34; düğmesi. Küme asgari görüntülenen değeri 0 olarak ve en fazla değer esir alma en iyi bir oranı için görüntülenen veri, genellikle 1.0-2.0 ( şekil 5).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+H%2B+efflux+is+sufficient+to+induce+dysplasia+and+necessary+for+viability+with+oncogene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression.</a> eLife. 03270, (2015).</li>
<li>Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+intracellular+pH+is+necessary+for+adult+epithelial+and+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Increased intracellular pH is necessary for adult epithelial and embryonic stem cell differentiation.</a> J. Cell Biol. 215 (3), 345-355 (2016).</li>
<li>Han, J., Burgess, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Indicators+for+Intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+reviews%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Indicators for Intracellular pH.</a> Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).</li>
<li>Koivusalo, M., Welch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amiloride+inhibits+macropinocytosis+by+lowering+submembranous+pH+and+preventing+Rac1+and+Cdc42+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling.</a> J. Cell Biol. 188 (4), 547-563 (2010).</li>
<li>Choi, C. -H., Webb, B. A., Chimenti, M. S., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+sensing+by+FAK-His58+regulates+focal+adhesion+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">pH sensing by FAK-His58 regulates focal adhesion remodeling.</a> J. Cell Biology. 202 (6), 849-859 (2013).</li>
<li>Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+pH-indicators+reveal+activity-dependent+cytosolic+acidification+of+Drosophila+motor+nerve+termini+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo.</a> J. Phys. 591 (7), 1691-1706 (2013).</li>
<li>Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+imaging+of+pH+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ratiometric imaging of pH probes.</a> Methods in Cell Biol. 123, 429-448 (2014).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Kirilly, D., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+ovary%3A+an+active+stem+cell+community%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+research%22%5BJournal%5D)">The Drosophila ovary: an active stem cell community.</a> Cell research. 17 (1), 15-25 (2007).</li>
<li>Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+of+epithelial+stem+cells+and+their+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+interdisciplinary+reviews.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila models of epithelial stem cells and their niches.</a> Wiley interdisciplinary reviews. Dev. Biol. 1 (3), 447-457 (2012).</li>
<li>Losick, V. P., Morris, L. X., Fox, D. T., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+stem+cell+niches%3A+a+decade+of+discovery+suggests+a+unified+view+of+stem+cell+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila stem cell niches: a decade of discovery suggests a unified view of stem cell regulation.</a> Dev. Cell. 21 (1), 159-171 (2011).</li>
<li>Pocha, S. M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+single+and+collective+cell+migrations+in+Drosophila%3A+themes+and+variations%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev.+of+Gen%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations.</a> Ann Rev. of Gen. 48, 295-318 (2014).</li>
<li>St Johnston, D., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+polarity+in+eggs+and+epithelia%3A+parallels+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell polarity in eggs and epithelia: parallels and diversity.</a> Cell. 141 (5), 757-774 (2010).</li>
<li>Castanieto, A., Johnston, M. J., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+signaling+promotes+self-renewal+through+the+establishment+of+cell+polarity+in+Drosophila+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">EGFR signaling promotes self-renewal through the establishment of cell polarity in Drosophila follicle stem cells.</a> eLife. 3, (2014).</li>
<li>Margolis, J., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+behavior+of+epithelial+stem+cells+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification and behavior of epithelial stem cells in the Drosophila ovary.</a> Development. 121 (11), 3797-3807 (1995).</li>
<li>Nystul, T. G., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epithelial+niche+in+the+Drosophila+ovary+undergoes+long-range+stem+cell+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">An epithelial niche in the Drosophila ovary undergoes long-range stem cell replacement.</a> Cell stem cell. 1 (3), 277-285 (2007).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neuro%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in neuro. 24 (5), 251-254 (2001).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, biz FSC Silsilesi içinde wildtype doku hücrelerinin pHi ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı geliştirilmiştir ve ilk pHi Drosophila yumurtalık dokusu içinde çalışmaya başlamasından bu yana son beş yılda rafine. Bu süre içinde protokol başarıyla birden fazla müfettişler laboratuarımızın içinde ve en az dört farklı iplik disk ve mikroskoplar tarama lazer tarafından kullanılmıştır. PHi artar FSC lineage hücrelerinde folikül hücre durumuna pFC için kök hücreden ayırt gibi birden çok bu ...

Son yıllarda yapılan çalışmalarda bir rol pHi değişimler için hücresel farklılaşma displazi vivo içinde1,ve2sırasında ortaya koydu. Bu çalışmalar bir aşamasından geçiş hücreleri olarak değişir ama bu o pHi son derece tutarlı farklılaşma, aynı tür aynı aşamada hücrelerde bulunur. Bazı durumlarda, pHi değişimler kısmen engelleme farklılaşma, pHi değişikliği sadece bir hücre kader değişimler sonucu değil ama bunun yerine belki de pH duyarlı düzenleyici etkisi ile hücre kaderi değiştirmek tanıtmak için yardımcı olur düşündüren bozan proteinler veya kimyasal reaksiyonlar farklılaşması için gerekli. Gelecekteki çalışmalar pHi dynamics vivo içindebirçok farklı rolleri içine daha fazla fikir ortaya potansiyeline sahip. Ancak, doğru ölçümler Phi pHi sırasında farklılaşma vivo içinde eğitim zorluklardan biri almaktır. Diğer şekil-in hücresel morfoloji ve gen ekspresyonu, değişiklikler gibi farklılaşma pHi bir değişken kimyasal özelliği sabit ve standart yöntemlerle permeabilized hücrelere korunmaz hücre benzemez. Buna ek olarak, pHi istikrarlı streslisin hücrelerdeki veya deneysel manipülasyon sonucu ölen olmayabilir. Böylece, pHi ölçerken hücreleri canlı ve mümkün olduğu kadar sağlıklı tutmak önemlidir. Birkaç hayati boya iş hücre kültür3ama birçok pHi ölçme durumlarda için onlar iyi ki uygun değildir çünkü onların doku derin veya eşit nüfuz değil in vivo çalışmalar için kullanılabilir doğru ölçümler sağlamak yeterli .
Zavallı boya penetrasyon sorunu aşmak için biz ve diğerleri genetik olarak kodlanmış bir sonda, özellikle hücreye ifade mCherry::pHluorin4,5,6,7, kullanmıştır faiz ve içinde görüntülü canlı doku türleri. pHluorin olduğunu GFP bir değişken ile daha yüksek bir pKa (~ 7.0 vs ~ 4.0) bu kıvrımlar daha kolay daha yüksek pH; Bu yüzden pHluorin moleküllerinin hücredeki bir popülasyondan yayılan toplam floresan yoğunluğu pHi8artan ile artar. Önemlisi, Floresans pHi değerleri normal sitozolik aralıkta doğrusal. Buna karşılık, mCherry floresan (pKa ~ 4.5) sitozolik aralığındaki pH değişimlerine duyarsız. Bu iki gazetecilere kovalent bir tek chimeric protein, böylece her zaman eşit miktarlarda mevcut tek açık okuma çerçevesi tarafından kodlanmış olarak birbirine bağlı. Bu nedenle, pHluorin için mCherry floresan yoğunluğu oranı her hücrede sonda konsantrasyon için normalleştirilmiş Phi bir ölçüm sağlar. Oranları tahminleri pHi değerleri bilinen pH değerine equilibrated dokulara gelen pHluorin mCherry oranları elde ederek oluşturulan standart bir eğri kullanarak dönüştürülebilir.
Burada, Drosophila yumurtalık içinde epitel FSC soyundan pHi ölçmek için mCherry::pHluorin kullanma yöntemleri açıklanmaktadır. Bu iyi karakterize doku epitel biyoloji, kök hücre kendini yenileme ve farklılaşma9,10,11, toplu hücre göç12 gibi birçok farklı yönleri model oluşturmak için kullanılan , geliştirme ve bakım hücre polarite13,14. Folikül epitel doku ön kenarında germarium15,16adı verilen bir yapısında bulunan iki FSCs tarafından üretilmektedir. Sırasında düzenli olarak yetişkinlik kendini yenilemek ve döl, niş yeniden girebilir ve bir FSC olmak veya üç farklı folikül hücre türden birine ayırt prefollicle hücreleri (PFC) denilen üretmek için bu hücreleri Böl: kutup hücreleri, SAP hücreler, veya Ana gövde folikül hücreleri. Biz daha önce wildtype dokusunda pHi farklılaşma yaklaşık FSCs yılında 6,8 PFC, 7.0 pHi üzerinden 7,3 folikül hücreleri2için erken aşamalarında giderek artar gösterdi ki. Bu artış bir ubiquitously ifade sodyum/proton değiştirici, DNhe2, RNAi nakavt tarafından engelleme ciddi pFC farklılaşma bozar, pHi DNhe2 overexpression tarafından artan ise hafif bir aşırı farklılaşma neden olur fenotip. Bu bulgular pHi stabil erken FSC lineage korunur ve deneysel olarak olabilir artırılması veya azaltılması vivo içindegöstermektedir. Yöntem tanımlamak burada pHi wildtype doku ya da mutant dokular, RNAi nakavt veya faiz ve Mitotik klonları bir Gal4 kullanarak overexpression da dahil olmak üzere çeşitli formları ölçmek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Fly Stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UAS-mCherry::p Hluorin[1]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y1 w*; P{GawB}10930/CyO</td><td>Bloomington Stok Merkezi</td><td>7023</td><td></td></tr><tr><td>Act-Gal4 flipout hisse senedi</td><td>Bloomington Stok Merkezi</td><td>4409</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Tampon hazırlama için kimyasallar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3911</td><td></td></tr><tr><td>glikoz</td><td>Mallinckrodt</td><td>4912</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>HCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-9272</td><td></td></tr><tr><td>NMDG +</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>M-2004</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7088</td><td>KHPO4 pH 7.4</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP362</td><td>KHPO4 pH 7.4</td></tr><tr><td>Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Konjuge</td><td>Thermo Fisher Yapmak İçin Kullanın Scientific</td><td>C21421</td><td>0.25 mg / ml seyreltme</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N1495</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Diseksiyon ve montaj aletleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 Dumont Inox forseps (Boyut 5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9473431</td><td></td></tr><tr><td>2 adet 23 gauge şırınga iğnesi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z192457</td><td></td></tr><tr><td>9 kuyulu cam diseksiyon kabı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-748B</td><td></td></tr><tr><td>Vakumlu Gres</td><td>Dow Corning</td><td>1018817</td><td></td></tr><tr><td>22 X 40 mM cam lameller</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12545C</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak Cam Layerler, 12mm çap, 0.13-0.16mm kalınlık</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>26023</td><td></td></tr><tr><td>3-D montaj odası 3-D yazıcı</td> için <td>özel olarak üretilmiştir.stl</td><td></td> <td>ve .ipt dosyaları ek dosyalar olarak dahildir</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Diğer ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH metre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-620-183A</td><td>Model: Accumet AB15</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Olympus Corporation</td><td>0H11436</td><td>Model: SZ2-ST</td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>SP5 veya SP8 lazer taramalı konfokal mikroskop 40 kez; 1.3 sayısal açıklığa sahip objektif</td></tr></tbody></table>

canlı drosophila yumurtalık dokusu içinde folikül kök hücre soyundan imaging hücre içi ph için yöntemleri

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Hücre içi pH (pHi) değişimler, metabolizma, yayılmasını önleme ve farklılaşma da dahil olmak üzere birçok hücresel fonksiyonların yönetmelikte önemli rol oynarlar. Genellikle, pHi dynamics ölçme ve deneysel olarak pHi değiştirmeye mükellef bulunmaktadır kültürlü hücrelerdeki belirlenir. Ancak, son gelişme metodolojileri ve yeni araçlar pHi dynamics bozulmamış, canlı doku içinde çalışmaya mümkün kıldı. Drosophila araştırma için bir önemli gelişme pHi Biyoalgılayıcı taşıyan bir transgenik satır nesil oldu mCherry::pHluorin. Burada, biz düzenli olarak görüntüleme canlı Drosophila ovarioles için epitel folikül kök hücre (FSC) soy mCherry::pHluorin transgenik vahşi türü satırlarındaki pHi ölçmek için kullandığımız bir protokol tanımlamak; Ancak, yöntem tanımlamak burada kanat diskler ve göz epitel de dahil olmak üzere diğer dokular için kolayca adapte edilebilir. Biz FSC soy mCherry::pHluorin ifade etmek için teknikleri yumurtalık dokusu canlı görüntüleme ve edinme ve pHi değerler elde etmek için görüntüleri analiz sırasında korumak açıklar.

Burada birkaç adımdan oluşur folikül epitel pHi ölçme işlemi anlatmıştık. İlk olarak, yumurtalık anatomi ve montaj için araçlarını kullanarak uygun genotip (şekil 1) sinekler disseke. Ovarioles sonra kantitatif floresan mikroskopi kullanarak yansıma ve görüntüleri Phi ölçümler elde etmek için analiz edilir. Her görüntü için faiz hücre türde bölüm 3.1 (Şekil 2) açıklandığı gibi tanımlanır. Floresans yoğunluklarını GFP ve mCherry k...

Hücre içi pH bir epitel kök hücre soydan canlı Drosophila yumurtalık dokusu içinde görüntüleme için bir protokol sağlar. Transgenik sinekler bir pH Biyoalgılayıcı, mCherry::pHluorin, görüntü kantitatif floresan Imaging'i kullanma Biyoalgılayıcı ifade oluşturmak, standart eğriler oluşturmak ve pH değerleri Floresans yoğunluk değerleri dönüştürmek için yöntemleri açıklanmaktadır.

Canlı Drosophila yumurtalık dokusu içinde folikül kök hücre soyundan Imaging hücre içi pH için yöntemleri

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Bu prosedürün genel amacı, canlı ekilen Drosophila yumurtalık dokusu içindeki folikül hücrelerinin hücre içi pH'ını ölçmektir. Bu yöntem, hücre içi pH'daki değişikliklerin sülfat kararlarına nasıl katkıda bulunduğu gibi kök hücre ve gelişim biyolojisindeki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, canlı, sağlam doku içindeki pH'ı doğru bir şekilde ölçmeyi mümkün kılmasıdır.Deneye başlamak için, 3D baskılı bir montaj odasının daha düz tarafına ince bir vakumlu gres tabakası uygulayarak montaj odalarını hazırlayın. Kapak kızağını montaj haznesine sızdırmaz hale getirmek için düz tarafı 22 x 40 milimetrelik bir kapak kızağına yerleştirin. Daha sonra, yumurtalıkları dişi yetişkin sineklerden 500 mikrolitre diseksiyon tamponunda inceleyin.CO2 gazı kullanarak üç ila dört sineği uyuşturun ve sinekleri bir sinek pedine aktarın. Bir sinek seçmek için forseps kullanın ve onu diseksiyon ortamına yerleştirin. Yumurtalıkları açığa çıkana kadar karnının ucunu çekerken sineğin göğüs kafesini bir çift forseps ile sıkıştırın.Tam olarak 10 dakikalık bir zamanlayıcı ayarlayın. Yumurtalıkları diğer organlardan ayırdıktan sonra, 22 buçuk gauge şırınga iğnesi kullanarak

methods-for-imaging-intracellular-ph-follicle-stem-cell-lineage-live

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Bireysel hazırlanması Drosophila</emCanlı Görüntüleme için> Yumurta Chambers

Bireyin GFP etiketli proteinlerin ya autofluorescent yapıların canlı görüntüleme için bir...

GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Oosit

Orta-geç Drosophila köklerinin Aşama özgü izolasyon çeşitli amaçlar için yararlıdır. Bu tür foliküllerin gelişmesi in vitro tahliller ve canlı görüntüleme ile bağlanmak üzere genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonlara olanak sağlar kültür gelişir. Buna ek olarak, bu tür folikül mRNA ve protein izole gibi moleküler genetik araştırmaları için kullanılabilir.

Of Utility Sahne özgü Orta-geç<em&gt; Drosophila</em&gt; Folikül İzolasyon

Bu kağıdı doğrudan puparium aracılığıyla görüntü hücre davranışı hızlı bir tarama konfokal mikroskop kullanımını gösterir. Sağlam pupa davayı bırakarak, bu yöntem doğrudan çalışma zordur Drosophila bir gelişme aşamasında gözlem ve dinamik hücre süreçlerinin ölçülmesini sağlar.

Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Bu protokolde açıklanan dik görüntüleme yöntemi, gelişmekte olan bir Drosophila melanogaster yumurtasının kutuplarının ayrıntılı olarak görüntülenmesine olanak sağlar.  Bu uçtan bakış, foliküler epitelde çoklu hücre tiplerinin düzenlemelerine ve morfolojilerine yeni bir bakış açısı sağlar.

Dik Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Odaları

Drosophila'da, oosit çekirdeği oogenez sırasında mikrotübül bağımlı göçe uğrar. Burada, yumurta odaları ex-vivo üzerinde canlı görüntüleme yaparak göçü takip etmek için geliştirilen bir protokolü açıklıyoruz. Prosedürümüz, iplik disk konfokal mikroskopi kullanarak çok konumlu 3D hızlandırılmış filmler elde etmek için yumurta odalarını 12 saat boyunca canlı tutar.

Drosophila Oosyte'de Nükleer Göç

Bodrum zarı, gelişim sırasında doku ve organ morfogenezi için gereklidir. Bu yapının uygun şekilde yerleştirilmesine yol açan mekanizmaları daha iyi anlamak için, sunulan protokol, konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak epitel hücrelerinde bazal membran proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu görselleştirmek ve karakterize etmek için yöntemleri açıklamaktadır.

Drosophila Oogenezi Sırasında Polarize Hücre İçi Kaçakçılığın ve Bazalton Membran Proteinlerinin Sekresyonunun Konfokal ve Süper Rezolüsyonlu Görüntülenmesi

Burada, Drosophila yumurtalık nişindeki germ hattı kök hücrelerinin (GSC'ler) asimetrik bölünmesinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Spektrozom proteini Par-1'in yeşil floresan proteini (GFP) füzyonunu her yerde ifade eden bir transgenik çizgi kullanıyoruz.

Kadın Drosophila melanogaster Germline Kök Hücre Nişlerinin Genişletilmiş Canlı Görüntülenmesi

Öğrenin canlı Drosophila yumurtalık dokusunda folikül kök hücrelerinin hücre içi pH değerlerini ölçme yöntemini. Bu teknik, kök hücre davranışları ve gelişimsel biyoloji alanında pH dinamiklerini incelemek için değerli bir araç sunar.

Canlı Drosophila yumurtalık dokusu içinde folikül kök hücre soyundan Imaging hücre içi pH için yöntemleri

Daha fazla video keşfet