Nesil bir gen kesintiye Streptococcus mutans çoğunlukla zorlanma olmadan Gen Klonlama

Bu prosedürün genel amacı, iki aşamalı bir füzyon PCR ve elektroporasyon kullanarak hedeflenen gen bozulmuş Streptococcus mutans suşları oluşturmaktır. Bu yöntem, ilgilenilen bir genin nasıl çalıştığı gibi mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, PCR dışında herhangi bir enzimatik reaksiyona ihtiyaç duyulmaması ve elektroporasyon için yetkin hücre hazırlığının oldukça basit olmasıdır. Bu yöntem Streptococcus mutans gen parçalanma tekniği hakkında bilgi sağlayabilse de, Staphylococcus aureus gibi diğer mikrobiyal türlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, ikinci PCR için iç içe geçmiş primerlerin etkinliğine aşina olmadıkları için mücadele edeceklerdir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir araştırma eğitmeni olan Doktor Ayako Okada olacaktır. Bu işleme başlamak için, S.mutans UA159'u bir beyin, kalp infüzyonu veya BHI agar plakası üzerine çizgi halinde dökün ve plakayı anaerobik koşullar altında gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, tek bir koloniyi seçmek için sterilize edilmiş bir kürdan kullanın ve onu beş mililitre BHI suyuna aşılayın. S.mutans kültürünü anaerobik koşullar altında gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, kültürü 15 dakika boyunca 2000 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini beş mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. 15 dakika boyunca 2000 kez G'de tekrar santrifüjleyin. Elde edilen hücre peletini 200 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Boncuk çırpma tabanlı bir genomik DNA ekstraksiyon kiti kullanarak süspansiyondan genomik DNA'yı çıkarın. İlk olarak, hücre süspansiyonunu cam boncuklar içeren iki mililitrelik bir numune tüpüne aktarın. Daha sonra hücre süspansiyonuna 750 mikrolitre lizis çözeltisi ekleyin. Tüpleri sıkıca kapatın ve boncuk çırpma bozma aparatının tüp tutucusuna simetrik olarak yerleştirin. Beş dakika boyunca maksimum hızda işlem yapın. Boncukla dövülmüş numuneleri bir dakika boyunca 10.000 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı iki mililitrelik bir toplama tüpündeki bir döndürme kolonuna aktarın ve bir dakika boyunca 7000 kez G'de santrifüjleyin. Süzüntüye 1200 mikrolitre DNA bağlayıcı tampon ekleyin ve karışımın 800 mikrolitresini iki mililitrelik bir toplama tüpündeki döndürme kolonuna aktarın. Bir dakika boyunca 10.000 kez G'de santrifüjleyin. Akışı atın. Kolon matrisini yıkamak ve bir dakika boyunca 10.000 kez G santrifüjlemek için sıkma kolonuna 200 mikrolitre ön yıkama tamponu ekleyin. Akışı atın, kolon matrisini yıkamak için spin kolonuna 500 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve tekrar santrifüjleyin. Her bir döndürme kolonunu yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve kolon matrisine 100 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin. Genomik DNA'yı elüte etmek için 30 saniye boyunca 10.000 kez G'de santrifüjleyin. Bir spektrofotometre kullanarak 260 nanometre ve 280 nanometrede absorbansı ölçerek DNA konsantrasyonunu ve saflığını tahmin edin. İlk PCR, PCR şablonları olarak S.mutans vahşi tip genomu ve sentetik streptomisin direnç geni kullanılarak gerçekleştirilir. Sırasıyla, glikosiltransferaz C veya gtfC geninin yukarı akış yan bölgesi, gtfC geninin aşağı akış yan bölgesi ve spektinomisin direnç genini amplifiye etmek için üç set primer kullanılır. Her PCR ürününü %1'lik bir agaroz jel üzerinde fraksiyonlayın. İlk PCR'den itibaren her ürünün boyutu yaklaşık bir KB olmalıdır. Karşılık gelen bantları çıkarmak ve her bir amplifiye edilmiş DNA ürününü metin protokolünde belirtildiği gibi saflaştırmak için bir jel bant kesici kullanın. Bir sonraki adım, ikinci PCR'yi gerçekleştirmek için yaklaşık olarak eşit üç molar fragmanı PCR şablonları olarak kullanmaktır. Bu fragmanlar, bozulma yapısını üretmek için uygun primerler kullanılarak büyütülür ve eklenir. Bu prosedürün başarısı, bozulma yapısının ikinci PCR ile amplifikasyonuna bağlı olduğundan, ikinci PCR ürününün elektroforez ile doğrulanması önemlidir. Üretilen amplikonun tahmin edilen bant boyutuna sahip olduğunu doğrulamak için PCR reaksiyon karışımının 1/10'unu %0.8'lik bir agaroz jel üzerine yükleyin. Bu örnekte, iç içe primerler çok daha iyi amplifikasyon sağladı. Kalan PCR karışımını yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve toplam hacmi 100 mikrolitreye ayarlamak için 55 mikrolitre ultra saf su ekleyin. 1/10 hacim üç molar sodyum asetat pH 5.2, ardından 2.5 hacim% 100 etanol ekleyin ve karıştırın. Eksi 80 santigrat derecede 30 dakika dondurun. 20 dakika boyunca dört santigrat derecede 15.000 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjleme tamamlandığında, tüpün altındaki peleti kontrol edin. Süpernatanı atın. Peleti bir mililitre% 70 etanol ile yıkayın ve beş dakika boyunca dört santigrat derecede 15.000 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti yaklaşık 30 dakika havayla kurutun. Son olarak, peleti 10 mikrolitre ultra saf su ile çözün. Yetkin S.mutans UA159 hücreleri daha önce eksi 80 santigrat derecede 50 mikrolitrelik alikotlar olarak hazırlanmış ve saklanmıştır. Karışımı, elektrotlar arasında 0,2 santimetre mesafe olan elektroporasyon küvetlerine ekleyin. Elektroporasyon aparatının Staphylococcus aureus modunu kullanarak elektroporasyon gerçekleştirin. Elektroporasyondan hemen sonra, hücreleri 500 mikrolitre BHI suyu içinde süspanse edin ve spektinomisin içeren BHI agar plakalarına 50 mikrolitre süspansiyon ekleyin. Plakaları 37'de iki ila altı gün kuluçkaya yatırın