Name: Nesil bir gen kesintiye Streptococcus mutans çoğunlukla zorlanma olmadan Gen Klonlama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Öğrenin, Streptococcus mutans'ta iki aşamalı füzyon PCR ve elektroporasyon kullanarak hızlı ve maliyet etkin gen kesintisi yöntemini. Bu teknik mikrobiyolojide genetik araştırmaları hızlandırır ve diğer bakteri türlerine uyarlanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser bilim promosyon [Grant sayıları 16 K 15860-m. ve 15 K 15777 N.H. için] Japonya Derneği tarafından desteklenmiştir.

1. Astar tasarım <ol><li>2-adım fusion PCR ve gene bozulma doğrulanması için astar hazırlayın. 
	Not: Tablo 1 bu protokol için kullanılan astar dizileri gösterir. şekil 1 bir şematik S. mutans çoğunlukla Δ gtfC oluşturmak için kullanılan 2-adım füzyon PCR yöntemi gösterir.
	<ol><li>Tasarım astar genom Spektinomisin-direnç gen (spc r) 7 ile hedef bölgede değiştirilmesi için. Bu iletişim kuralı gtfC gen tüm kodlayıcı bölge spc r ile yerini alır.</li>
		<li>Dahil 15 üsleri spc r alt ve üst ucuna tamamlayıcı saat 5'te &#39; up-ters bölgelerinde ve astarlar, sırasıyla aşağı-ileri. Benzer şekilde, dahil 15 üsleri tamamlayıcı gtfC ters yönde kanat bölgelerinde alt sonuna ve gtfC akış aşağı kanat bölgelerinde üst sonu saat 5'te &#39; bölgelerinde spc r-ileri ve spc r -astar, sırasıyla ters ( şekil 1A). 
		Not: Up-geri, aşağı-ileri, spc r - ileri ve spc r - dizilerini ters astar bozulma yapı birleşme siteye bağlı olarak otomatik olarak belirlenir.</li>
		<li>Tasarım oluşturan için yukarı-ileri ve aşağı-geri astar &#62; 1 kb upstream ve downstream sırasıyla gtfC gene, bölgelerinde kanat. Yukarı-ileri erime sıcaklık (T m) ayarlayın ve astar astar, up-ters ve aşağı-ileri erime sıcaklığı uygun olarak sırasıyla aşağı-ters ( şekil 1A). 
		Not: T m belirlemek için aşağıdaki formül bakın: T m (° C) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * NG) - 5, nerede * N temsil eder (A, T, C veya G) belirtilen kimlikle astar nükleotit sayısı.</li>
		<li>Tasarım 2 nd PCR ( şekil 1B) için iç içe geçmiş astar (N_up-ileri ve N_up-geri). 
		Not: her ne kadar en dıştaki astar çifti (yukarı-ileri ve aşağı-geri) 2 nd için PCR astar kullanılabilir, iç içe geçmiş astar (N_up-ileri ve N_up-geri) Bu protokol için dizayn edilmiştir. İç içe geçmiş astar için 2 nd PCR, Temsilcisi sonuçları ayrıntılı olarak sık sık gerekli.</li>
		<li>Tasarım astar spc r için belirli. Astar koloni PCR için ekran gtfC bozulma için kullanılır.</li>
		<li>Tasarım astar gtfC doğrulanması için kesinti. 
		Not: Bu primerler kullanılarak güçlendirilmiş PCR ürünleri gtfC veya spc r ve yukarı veya aşağı gtfC bölgelerinde kanat arasındaki sınır apışıp kalmak. Astar kümeleri &#39; gtfC yukarı-ileri ve gtfC yukarı-ters &#39; ve &#39; gtfC aşağı-ileri ve gtfC aşağı-ters &#39; gtfC için özel ve &#39; gtfC yukarı-ileri ve spc r 2 -geriye doğru &#39; ve &#39; spc r 2-ileri ve gtfC aşağı-ters &#39; spc r için özel.</li>
	</ol></li></ol> 2. S. mutans çoğunlukla genomik DNA çıkarma <ol><li>çizgi stok S. mutan s UA159 bir beyin kalp infüzyon (BHI) agar plaka üzerine. Gecede 37 ° C'de anaerobik koşullarda plaka kuluçkaya.</li>
	<li>Steril bir kürdan kullanarak bir koloni up pick ve BHI suyu 5 mL aşılamak. S. mutan s kültür gecede 37 ° C'de anaerobik koşullarda kuluçkaya.</li>
	<li>Santrifüj bakteriyel hücre kültürü, 2.000 × g. 15 dakika Resuspend hücre Pelet fosfat tamponlu tuz (PBS) 5 mL.</li>
	<li>, 2.000 × g. 15 dakika santrifüj Resuspend hücre Pelet PBS 200 µL içinde.</li>
	<li>Üretici tarafından sağlanan yönergelere göre bir boncuk-dayak-temel genomik DNA ekstraksiyon kiti kullanarak süspansiyon gelen genomik DNA ayıklamak.
	<ol><li>2.0 mL örnek süspansiyon aktarmak tüp cam boncuk (kit ile birlikte) içeren. Hücre süspansiyon lizis çözüm (kit ile birlikte) 750 µL ekleyin.</li>
		<li>Sıkıca kap ve tüpler simetrik boncuk atan bozulma aparatı tüp sahibi yerleştirin. 5 min için maksimum hızda işlem. Santrifüj boncuk dayak örnekleri 10,000 × g., 1 dk. için Transfer süpernatant (kit ile birlikte) spin filtresi 2.0 mL toplama tüp ve 7.000 × g ., 1 dk santrifüj</li>
		<li>Ekle 1200 µL DNA bağlayıcı arabelleğe filtrate (kit ile birlikte). 2.0 mL toplama tüp ve 10.000 × g., 1 dk santrifüj (kit ile birlikte) spin sütun karışıma 800 µL transfer</li>
		<li>Akış-üzerinden atma spin sütun sütun matris yıkayın ve 10.000 × g. atma akışı aracılığıyla, 1 dk santrifüj kapasitesi, yıkama arabelleği (kit ile birlikte) 500 µL spin için eklemek için 200 µL ön yıkama arabelleği (kit ile birlikte) eklemek sütun sütun matris yıkayın ve 10.000 × g., 1 dk santrifüj kapasitesi</li>
		<li>Spin sütun yeni bir 1.5 mL microcentrifuge tüp içine yerleştirin ve 100 µL (kit ile birlikte) elüsyon arabelleği sütun matris ekleyin.</li>
		Genomik DNA elute için 10.000 × g <li>santrifüj 30 s. Saflık ve DNA toplama 260 Absorbans ölçerek tahmin etmeye nm ve 280 nmusing bir Spektrofotometre ve A 260 /A 280 oranı 1.8 büyük olduğundan emin olun.</li>
	</ol></li></ol> 3. PCR güçlendirme <ol><li>1 st S. mutan s WT genom ve sentetik spc r gen (bkz. Tablo 1) PCR şablon olarak kullanarak PCR gerçekleştir. Yükseltmek ters yönde kanat gtfC gen bölgesinin, gtfC gen ve astar olarak başına ( şekil 1A yukarıda), açıklanan üç kümesi kullanarak spc r gen aşağı akım kanat bölgesi Tablo 2 ve Tablo 3. 
	Not: PCR astar, reaktifler ve amplifikasyon döngüleri Tablo 1, Tablo 2 ve Tablo 3, sırasıyla özetlenir.</li>
	<li>% 1'özel jel her PCR ürünü fractionate ve jel bant kesici kullanarak karşılık gelen grup tüketim.</li>
	<li>Her bir spin sütun ve silika jel zar bazlı ayıklama kit kullanarak jelleri güçlendirilmiş DNA üründen arındırmak.
	<ol><li>Transfer temiz bir microcentrifuge jel dilimlere tüp ve arabellek (kit ile birlikte) bağlama 500 µL ile karıştırın. Jel dilimleri tamamen çözünene kadar 55 ° C 15 dakika karisimin kuluçkaya.</li>
		<li>(Kit ile birlikte) spin sütun (kit ile birlikte) bir koleksiyon tüp içine koyun, spin sütuna örnek yüklemek ve santrifüj kapasitesi 30 için 11.000 × g s. Akış-üzerinden atmak, Silis membran yıkama ve 30 için santrifüj kapasitesi için Spin sütun yıkama (kit ile birlikte) arabelleği 600 µL eklemek 11.000 × g s.</li>
		<li>Akışı aracılığıyla ve silis membran kurumaya 11.000 × g de 2 dk santrifüj atın.</li>
		<li>Spin sütun yeni bir 1.5 mL microcentrifuge tüp içine yerleştirin, 50 µL ekleyin elüsyon arabellek (kit ile birlikte) ve 2 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya</li>
		Güçlendirilmiş DNA elute için <li>11.000, 2 dk santrifüj × g. Saflık ve DNA toplama 260 Absorbans ölçerek tahmin etmeye nm ve 280 nmusing bir Spektrofotometre ve A 260 /A 280 oranı 1.8 büyük olduğundan emin olun.</li>
	</ol></li> <li>Gerçekleştir 2 nd 2-adım füzyon Tablo 2 başına PCR Şablonlar olarak üç yaklaşık ekimolar parçaları kullanarak PCR PCR ve Tablo 3. 
	Not: Bu parçaları AMPLİFİKATÖRLÜ ve iç içe geçmiş primerler kullanılarak spliced &#39; N_up-ileri ve N_down geri &#39; veya en dıştaki astar &#39; yukarı-ileri ve aşağı-geri &#39; ( şekil 1B). PCR astar, reaktifler ve amplifikasyon döngüleri özetlenir Tablo 1, Tablo 2 ve Tablo 3, sırasıyla.</li>
	<li>Yük-onda % 0,8 özel jel PCR reaksiyon karışımı (5 µL) ve uygun amplicon ( şekil 1 c) nesil onaylamak için beklenen Grup boyutu ile güçlendirilmiş grup boyutunu karşılaştırın.</li>
	<li>Etanol yağış arıtma olmadan tarafından kalan son PCR ürünü konsantre.
	<ol><li>Ekleyin 55 µL ultra saf su 100 µL.Add için toplam ses seviyesini ayarlamak için kalan PCR karışımı için % 100 etanol (250 µL) 2.5 birimler tarafından takip 3 M sodyum asetat (10 µL), pH 5.2, onda biri hacmi. Mix ve 30 dk-80 az için donma ° C.</li>
		<li>, 15.000 × g 4 ° C'de 20 dk santrifüj tüp alt Pelet denetlemek ve süpernatant atın. Pelet % 70 etanol, santrifüj, 15.000 × g 4 ° C'de 5 min için 1 mL ile yıkayın ve süpernatant atın. Pelet için yaklaşık 30 dakika kuruması ve ultra saf su 10 µL ile çözülür.</li>
	</ol></li></ol> 4. Yetkili hücre hazırlık ve hücre dönüşüm <ol><li>çizgi stok S. mutan s UA159 BHI agar plaka üzerine. Gecede 37 ° C'de anaerobik koşullarda plaka kuluçkaya.</li>
	<li>Steril bir kürdan kullanarak bir koloni up pick ve BHI suyu 5 mL aşılamak. S. mutan s kültür gecede 37 ° C'de anaerobik koşullarda kuluçkaya.</li>
	<li>BHI suyu 50 mL 2 mL mutan S. s kültür aktarmak ve 6-8 h 37 ° c ile 600 optik bir yoğunluk için kuluçkaya nm 0,2-0,4 anaerobik koşullarda (OD 600).</li>
	<li>Hücreleri 2.000 × g 4 ° c de 15 dakika santrifüj kapasitesi, süpernatant atmak ve hücreleri iki kez 40 mL % 10 gliserol 40 mL tarafından takip buz gibi su ile yıka. 
	Not: Sonraki adım kalan maddeler etkiler.</li>
	Hücre Pelet % 10 gliserol içinde bağlılık azalır gibi <li>süpernatant dikkatle Pasteur pipet ile Aspire edin. 1 mL taze % 10 gliserol hücrelerde resuspend, süspansiyon 50 µL her 1.5 mL microcentrifuge tüp içine dağıtmak ve depolamak kullanmadan sadece kadar-80 ° C'de.</li>
	<li>Buz gibi yetkili hücreleri 50 µL aliquot madde 3 te yukarıda bozulma yapı 5 µL ile karıştırın. Elektroporasyon cuvettes (0.2 cm mesafe elektrot arasındaki ile) karışımı ekleyin. Staphylococcus aureus modu istihdam (1,8 kV, 600 Ω, 10 µF, 1 darbe) elektroporasyon cihazları için electroporate.</li>
	<li>BHI suyu 500 µL hücrelerde hemen elektroporasyon sonra askıya alma ve süspansiyon 50 µL Spektinomisin içeren BHI agar plakaları ekleyin. 
	Not: Ekstra kuluçka süresi sonra adım gerekli değildir. Ancak, 1-2 h için kuluçka elektroporasyon sonra dönüşüm verimliliği artırabilir.</li>
	<li>2-6 gün anaerobik koşullarda 37 ° C'de plaka kuluçkaya. 
	Not: S. mutans çoğunlukla Δ gtfB yukarıda açıklandığı gibi inşa edilmiştir. Tüm kodlayıcı bölge gtfB gen eritromisin direnç gene 8 S. mutans çoğunlukla Δ'yerine olur gtfB. Her S. mutans çoğunlukla zorlanma BHI suyu anaerobik koşullarda 37 ° C'de içinde kültürlü.</li>
</ol> 5. Gene bozulma ve depolama doğrulama <ol><li>Pick rastgele kolonileri ve onları koloni PCR Tablo 2 ve Tablo 3 göre gerçekleştirmek için PCR karışımı içine aşılamak. PCR astar, reaktifler ve amplifikasyon döngüleri özetlenir Tablo 1, Tablo 2 ve Tablo 3, sırasıyla.</li>
	<li>PCR reaksiyon karışımı spc r onaylamak için % 1'özel jel üzerinde yük-belirli DNA band.</li>
	<li>Steril bir kürdan ve alt kültür hücreleri BHI Spektinomisin içeren 10 ml kullanarak pozitif koloni anaerobik koşullarda 37 ° C'de 2 gün suyu alın.</li>
	<li>S. mutans çoğunlukla Δ nesil doğrulamak gtfC.
	<ol><li>Hücre süspansiyon eşit bölün. Yukarıda açıklanan hücreleri genomik DNA ayıklamak (2.3 adımlar. için 2.5.5.). GtfC bozulma (Tablo 1) Tablo 2 ve Tablo 3 başına doğrulanması için primerler kullanılarak PCR şablon olarak PCR genomik DNA ile gerçekleştirmek. 
		Not: PCR astar, reaktifler ve amplifikasyon döngüleri Tablo 1, Tablo 2 ve Tablo 3, sırasıyla özetlenir.</li>
		<li>PCR karışımı bir % 2 özel jel üzerinde yük ve uygun amplicon . nesil onaylamak için beklenen Grup boyutu ile güçlendirilmiş grup boyutunu karşılaştırın</li>
		<li>4'te kalan hücre süspansiyon için 2.000 × g de 15 dk santrifüj kapasitesi ° C. Resuspend hücre Pelet PBS 5 mL.</li>
		<li>2.000 × g 4 de 15 dakika santrifüj ° C. hücre cips 1,5 mL % 25 gliserol içeren BHI suyu ve mağaza-80 ° Cor -20 ° c Resuspend</li>
	</ol></li></ol> 6. Fenotipik analizi <ol><li>çizgi her S. mutan s zorlanma BHI agar plaka üzerine. Gecede 37 ° C'de anaerobik koşullarda plaka kuluçkaya.</li>
	<li>Steril bir kürdan kullanarak bir koloni kadar almak ve 2 mL BHI suyu ile veya olmadan uygun antibiyotik içine aşılamak. Gecede anaerobik koşullarda 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>2 mL cam tüp bebek antibiyotik olmadan %1 veya % 5 Sükroz içeren BHI suyu içine gecede kültür süspansiyon 20 µL aşılamak; 37 ° C anaerobik koşullarda eğimli bir konumda bir gecede test tüpünde hücrelerle kültür.</li>
	<li>Girdap cam test tüpleri için 10 s ve kültür süspansiyonlar dikkatle boşaltmak. Test tüpleri üç kez distile su ile yıkayın. 1 mL % Coomassie parlak mavi (CBB biyofilmler leke) tüp duvara ve 1 dk. için kuluçkaya 0,25 ekleyin</li>
	<li>Boyama çözüm dikkatle boşaltmak test tüpleri üç kez distile su ile yıkayıp kurulayın test tüpleri.</li>
	<li>Renk yoğunluğu ve uzantısı CBB lekeli-görsel olarak fenotipik analizde biyofilm şekillendirme yeteneği belirlemek için biyofilm değerlendirmek.</li>
</ol>

<ol><li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes%3A+gene+splicing+by+overlap+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li>
<li>Kuwayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-mediated+generation+of+a+gene+disruption+construct+without+the+use+of+DNA+ligase+and+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors.</a> Nucleic Acids Res. 30 (2), E2(2002).</li>
<li>Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digalactosyldiacylglycerol+is+required+for+stabilization+of+the+oxygen-evolving+complex+in+photosystem+II%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II.</a> Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).</li>
<li>Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+Streptococcus+mutans+glucosyltransferase+gene+coding+for+insoluble+glucan+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis.</a> Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).</li>
<li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutans+gtfC+gene%2C+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li>
<li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD%289%29+determinant+from+Enterococcus+faecalis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li>
<li>Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cloning+vector+able+to+replicate+in+Escherichia+coli+and+Streptococcus+sanguis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis.</a> Gene. 19 (3), 345-353 (1982).</li>
<li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).</li>
<li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).</li>
<li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci%3A+application+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li>
<li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> J Vis Exp. (69), (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Mevcut protokolünde astar 1st PCR için yaklaşık 1 kb upstream ve downstream genom hedef bölgede bölgelerinde kanat yükseltmek için tasarlanmış olmalıdır. Homolog rekombinasyon verimliliğini artırmak gerekli uzun kanat böyle dizileridir.
Astar dizisi (up-geri, aşağı-ileri, spcr-ileri ve spcr-ters) Bu protokol için otomatik olarak bozulma yapı birleşme ücreti göre belirlenmiştir. Her astar 15 üsleri tamamlayıcı 2nd PCR şablon bölge 5'...

Gene işlev analiz genellikle bir vahşi tipi yük ve ilgi belirli bir gen getirilmiş bir yük arasında fenotipik bir karşılaştırma içerir. Bu gen-bozulma teknik gen işlevi analizleri takson, memeliler için bakterilerden geniş bir alanda kullanılmıştır. Gen alt üst baskı üretimi için gerekli bir gen-bozulma yapıdır; Bu deoksiribonükleik asit (DNA) yapı akış yukarı ve aşağı akım hedef gen bölgelerinde kanat erimiş antibiyotik direnci marker gen oluşur ve homolog rekombinasyon ile genom içine dahil edilmiştir. Gen kesintiye zorlanma antibiyotik içeren seçmeli medya kullanarak izole olabilir. Gen kesintiye zorlanma yapımı için kullanılan geleneksel yöntem Polimeraz zincir tepkimesi (PCR), gen ligasyonu içine uygun bir plazmid, hazım ile sınırlama tarafından hedef gen amplifikasyon gibi karmaşık adımlar gerektirir enzimler ve antibiyotik direnç marker gen eklemek için religation. Her adım başarısını bağlı olarak birkaç hafta için birkaç gün alarak zaman alıcı bir süreçtir. Buna ek olarak, tasarım kesintileri yapıları, hedef gen restriksiyon enzimi sitelerinde bağlıdır. Bu sorunları gidermek için DNA PCR tabanlı yapıştırma yöntemleri1,2 tasarım Dictyostelium discoideum3 ve Synechocystis sp. PCC68034 mutant gen bozulduğu için bildirilmiştir. Bu da çalışmanın, kesintiye uğraması yapımı için (2-adım füzyon PCR belirlenmiş) değiştirilmiş bir PCR tabanlı yöntemi kullanan bir nispeten hızlı, facile ve ucuz şekilde bir gen kesintiye streptokok yük oluşturmak için bir yöntem geliştirildi yapý ve elektroporasyon genetik dönüşüm.
PCR genomik DNA, antibiyotik direnci marker gen PCR şablon olarak ve dört çift uygun şekilde gerektirir 2-adım füzyon Oligonükleotid astar tasarlanmış. İlk adım (1st PCR), hedef gen, hedef 1-kb aşağı akım kanat bölge 1-kb ters yönde kanat bölge gen ve antibiyotik direnç marker gen PCR ile güçlendirilmiş. 5' bölgeleri ters astar ve amplifikasyon upstream ve downstream için ileri astar bölgeler, sırasıyla, kanat 15 üsleri marker gen sonuna kadar tamamlayıcı içerir. İleriye ve geriye doğru astar marker gen amplifikasyon için 5' bölgeleri aynı şekilde 15 üsleri hedef gen ters yönde kanat bölgesinin alt sonuna ve akış aşağı kanat hedef gen bölgesinin üst sonu için tamamlayıcı dahil, anılan sıraya göre. Bu nedenle, üç güçlendirilmiş parçaları üst üste gelen 30-baz çifti bölgesini fusion sitesinde içerir. İkinci adımda (2nd PCR), PCR 1st PCR Şablonlar olarak tarafından güçlendirilmiş üç parçaları kullanarak iç içe geçmiş PCR astar ile gerçekleştirilir. Şablonlar tamamlayıcı bölgelerinde Ayrıca 2nd PCR birbirine bağlıdır. Son olarak, yapı homolog rekombinasyon için vahşi tipi zorlanma için elektroporasyon tarafından tanıtıldı. Başarılı gene bozulma belirli primerler kullanılarak PCR tarafından doğrulanmadı. Yüksek sadakat DNA polimeraz kullanarak bozulma yapısı güçlendirilmiş, DNA ligasyonu veya DNA sindirim, gibi ek enzimatik reaksiyonları yapı oluşturmak gerekli değildir. Buna ek olarak, genom bir silinmiş veya korunmuş bölge esnek astar tasarım göre seçmiş olabilirsiniz.
Mevcut çalışma, Streptococcus mutans çoğunluklaglucosyltransferase kodlar, gtfC gen tüm kodlayıcı bölge silme hızlı, kolay gen bozulma yönteminde bir streptokok türleri göstermek için gerçekleştirildi. Ayrıca, bir gtfB-kesintiye zorlanma aynı şekilde oluşturulur. GtfC ve gtfB tarafından kodlanmış glucosyltransferases katkıda bulunmak için cariogenic diş biyofilm geliştirme5,6. Vahşi türü biyofilm oluşturmayan yetenekler (S. mutans çoğunlukla WT), gtfCsoy-kesintiye zorlanma (S. mutans çoğunlukla ΔgtfC) ve gtfB-kesintiye zorlanma (S. mutans çoğunlukla ΔgtfB) değerlendirildi fenotipik karşılaştırmalı analizler için. Bu iletişim kuralı gene bozulma için ek bir tür için bir iki adım yöntemi uygulanması genişletir ve çalışmalar gen fonksiyonunu kullanabilirsiniz takson daha geniş bir yelpazesi için değiştirilebilir.

<table><tbody><tr><td>Streptococus mutans</td><td>Laboratuvarda stok suşu.</td><td></td><td>Vahşi tip suş (Suş UA159)</td></tr><tr><td>Genomik DNA ekstraksiyon kiti</td><td>Zymo Research</td><td>D6005</td><td></td></tr><tr><td>Boncuk çırpma bozma aparatı</td><td>Taitec</td><td>GM-01</td><td></td></tr><tr><td>Sentetik</td><td>genler Eurofins Genomics</td><td>Özel sipariş</td><td>Spektinomisin ve eritromisin direnç geni</td></tr><tr><td>Termal döngüleyici</td><td>Astec</td><td>PC-708</td><td></td></tr><tr><td>PCR primerleri</td><td>Eurofins Genomics</td><td>Özel sipariş</td><td>35 baz uzunluğunda</td></tr><tr><td>DNA polimeraz</td><td>Takara</td><td>R045A</td><td>Yüksek kaliteli DNA polimeraz</td></tr><tr><td>Jel ekstraksiyon kiti</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91202</td><td>Agaroz jelden DNA ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>Jel bant kesici</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-830</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>Beckman Coulter</td><td>DU 800</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporatör</td><td>Bio-rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporasyon küveti</td><td>Bio-rad</td><td>1652086</td><td>0,2 cm boşluk</td></tr><tr><td>Anaeropack</td><td>Mitsubishi Gas Chemical</td><td>A-03</td><td>Anaerobik kültür sistemi</td></tr><tr><td>Beyin kalp infüzyon suyu</td><td>Becton, Dickinson</td><td>237500</td><td>Bakteri kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Spektinomisin</td><td>Wako</td><td>195-11531</td><td>Antibiyotikler</td></tr><tr><td>Eritromisin</td><td>Wako</td><td>057-07151</td><td>Antibiyotikler</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td>Biyofilm geliştirme için</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>Biyofilm boyama için</td></tr></tbody></table>

nesil bir gen kesintiye streptococcus mutans çoğunlukla zorlanma olmadan gen klonlama

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Tipik yöntemleri için belirli bir gen işlevini aydınlatma vahşi tipi zorlanma ve faiz gen getirilmiş bir yük karşılaştırmalı fenotipik analizlerini içerir. Uygun antibiyotik direnci marker gen içeren bir gen-bozulma DNA yapısı gen kesintiye suşları bakterilerde nesil için yararlıdır. Ancak, Gen Klonlama adımlar gerektirir, geleneksel inşaat yöntemleri karmaşık ve zaman alıcı protokolleri içerir. Burada, Streptococcus mutans çoğunlukla hedeflenen gene bozulma için nispeten facile, hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem açıklanmıştır. Yöntem 2-adım füzyon Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) bozulma yapý ve elektroporasyon genetik dönüşüm oluşturmak için kullanır. Bu yöntem does değil istemek dışında PCR, enzimatik reaksiyon ve ayrıca bozulma yapı tasarım açısından daha büyük esneklik sağlar. Elektroporasyon istihdam yetkili hücreleri hazırlanması kolaylaştırır ve dönüşüm verimliliği artırır. Mevcut yöntem gen kesintiye suşların çeşitli tür üretimi için adapte olabilir.

1st PCR, her ürün boyutunu gösteren Şekil 2 üzerinde % 1'özel jel gözlemlediği gibi yaklaşık 1 kb tahmini boyutu ile iyi anlaşma içinde yapıldı. Şekil 3 2nd PCR ürünlerinin Jel Elektroforez analizini gösterir. Şekil 4 S. mutans çoğunlukla kolonileri bozulma yapý ve koloni PCR ürünleri bir Jel Elektroforez analizi ile dönüştürülmüş gösterir. Amplicons bütün kolonilerden ...

Streptococcus mutans çoğunlukla gen kesintiye üretimi için facile, hızlı ve nispeten ucuz bir yöntem tarif suşları; Bu teknik gen kesintiye suşların çeşitli tür üretimi için adapte olabilir.

Nesil bir gen kesintiye Streptococcus mutans çoğunlukla zorlanma olmadan Gen Klonlama

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Bu prosedürün genel amacı, iki aşamalı bir füzyon PCR ve elektroporasyon kullanarak hedeflenen gen bozulmuş Streptococcus mutans suşları oluşturmaktır. Bu yöntem, ilgilenilen bir genin nasıl çalıştığı gibi mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, PCR dışında herhangi bir enzimatik reaksiyona ihtiyaç duyulmaması ve elektroporasyon için yetkin hücre hazırlığının oldukça basit olmasıdır. Bu yöntem Streptococcus mutans gen parçalanma tekniği hakkında bilgi sağlayabilse de, Staphylococcus aureus gibi diğer mikrobiyal türlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, ikinci PCR için iç içe geçmiş primerlerin etkinliğine aşina olmadıkları için mücadele edeceklerdir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir araştırma eğitmeni olan Doktor Ayako Okada olacaktır. Bu işleme başlamak için, S.mutans UA159'u bir beyin, kalp infüzyonu veya BHI agar plakası üzerine çizgi halinde dökün ve plakayı anaerobik koşullar altında gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, tek bir koloniyi seçmek için sterilize edilmiş bir kürdan kullanın ve onu beş mililitre BHI suyuna aşılayın. S.mutans kültürünü anaerobik koşullar altında gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, kültürü 15 dakika boyunca 2000 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini beş mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. 15 dakika boyunca 2000 kez G'de tekrar santrifüjleyin. Elde edilen hücre peletini 200 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Boncuk çırpma tabanlı bir genomik DNA ekstraksiyon kiti kullanarak süspansiyondan genomik DNA'yı çıkarın. İlk olarak, hücre süspansiyonunu cam boncuklar içeren iki mililitrelik bir numune tüpüne aktarın. Daha sonra hücre süspansiyonuna 750 mikrolitre lizis çözeltisi ekleyin. Tüpleri sıkıca kapatın ve boncuk çırpma bozma aparatının tüp tutucusuna simetrik olarak yerleştirin. Beş dakika boyunca maksimum hızda işlem yapın. Boncukla dövülmüş numuneleri bir dakika boyunca 10.000 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı iki mililitrelik bir toplama tüpündeki bir döndürme kolonuna aktarın ve bir dakika boyunca 7000 kez G'de santrifüjleyin. Süzüntüye 1200 mikrolitre DNA bağlayıcı tampon ekleyin ve karışımın 800 mikrolitresini iki mililitrelik bir toplama tüpündeki döndürme kolonuna aktarın. Bir dakika boyunca 10.000 kez G'de santrifüjleyin. Akışı atın. Kolon matrisini yıkamak ve bir dakika boyunca 10.000 kez G santrifüjlemek için sıkma kolonuna 200 mikrolitre ön yıkama tamponu ekleyin. Akışı atın, kolon matrisini yıkamak için spin kolonuna 500 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve tekrar santrifüjleyin. Her bir döndürme kolonunu yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve kolon matrisine 100 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin. Genomik DNA'yı elüte etmek için 30 saniye boyunca 10.000 kez G'de santrifüjleyin. Bir spektrofotometre kullanarak 260 nanometre ve 280 nanometrede absorbansı ölçerek DNA konsantrasyonunu ve saflığını tahmin edin. İlk PCR, PCR şablonları olarak S.mutans vahşi tip genomu ve sentetik streptomisin direnç geni kullanılarak gerçekleştirilir. Sırasıyla, glikosiltransferaz C veya gtfC geninin yukarı akış yan bölgesi, gtfC geninin aşağı akış yan bölgesi ve spektinomisin direnç genini amplifiye etmek için üç set primer kullanılır. Her PCR ürününü %1'lik bir agaroz jel üzerinde fraksiyonlayın. İlk PCR'den itibaren her ürünün boyutu yaklaşık bir KB olmalıdır. Karşılık gelen bantları çıkarmak ve her bir amplifiye edilmiş DNA ürününü metin protokolünde belirtildiği gibi saflaştırmak için bir jel bant kesici kullanın. Bir sonraki adım, ikinci PCR'yi gerçekleştirmek için yaklaşık olarak eşit üç molar fragmanı PCR şablonları olarak kullanmaktır. Bu fragmanlar, bozulma yapısını üretmek için uygun primerler kullanılarak büyütülür ve eklenir. Bu prosedürün başarısı, bozulma yapısının ikinci PCR ile amplifikasyonuna bağlı olduğundan, ikinci PCR ürününün elektroforez ile doğrulanması önemlidir. Üretilen amplikonun tahmin edilen bant boyutuna sahip olduğunu doğrulamak için PCR reaksiyon karışımının 1/10'unu %0.8'lik bir agaroz jel üzerine yükleyin. Bu örnekte, iç içe primerler çok daha iyi amplifikasyon sağladı. Kalan PCR karışımını yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve toplam hacmi 100 mikrolitreye ayarlamak için 55 mikrolitre ultra saf su ekleyin. 1/10 hacim üç molar sodyum asetat pH 5.2, ardından 2.5 hacim% 100 etanol ekleyin ve karıştırın. Eksi 80 santigrat derecede 30 dakika dondurun. 20 dakika boyunca dört santigrat derecede 15.000 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjleme tamamlandığında, tüpün altındaki peleti kontrol edin. Süpernatanı atın. Peleti bir mililitre% 70 etanol ile yıkayın ve beş dakika boyunca dört santigrat derecede 15.000 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti yaklaşık 30 dakika havayla kurutun. Son olarak, peleti 10 mikrolitre ultra saf su ile çözün. Yetkin S.mutans UA159 hücreleri daha önce eksi 80 santigrat derecede 50 mikrolitrelik alikotlar olarak hazırlanmış ve saklanmıştır. Karışımı, elektrotlar arasında 0,2 santimetre mesafe olan elektroporasyon küvetlerine ekleyin. Elektroporasyon aparatının Staphylococcus aureus modunu kullanarak elektroporasyon gerçekleştirin. Elektroporasyondan hemen sonra, hücreleri 500 mikrolitre BHI suyu içinde süspanse edin ve spektinomisin içeren BHI agar plakalarına 50 mikrolitre süspansiyon ekleyin. Plakaları 37'de iki ila altı gün kuluçkaya yatırın

generation-gene-disrupted-streptococcus-mutans-strain-without-gene

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Sistematik, büyük ölçekli sentetik gen (bir gen ya da gen-epistasis) etkileşim ekranlar genetik ve fazlalık yolu çapraz konuşma keşfetmek için kullanılabilir. Burada, yüksek-throughput kantitatif sentetik genetik dizi tarama teknolojisi tarif eSGA biz epistatik ilişkileri durulaştırmada ve genetik etkileşim ağları keşfetmek için geliştirilen...

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Verimli bir genom tek gen mutasyonu yöntemi kullanılarak...

Genom çapında Gen Delesyonlar içinde<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Yüksek Verimli PCR ile

Kaynak: Lea-Smith, D.J., ve diğerleri. Model Siyanobakteriyel Türlerde İşaretli ve İşaretsiz Mutantların Üretimi. J. Vis. Uzm. (2016)Video, siyanobakterilerde antibiyotik işaretli mutantlar üretmek için bir yöntem göstermektedir. Protokol, siyanobakterilerin kültürlenmesiyle başlar, ardından yüzey pililerini koruyan santrifüjleme ve yıkama adımları gelir. Daha sonra homolog dizilerle çevrili bir antibiyotik direnç geni taşıyan bir plazmit eklenir. İnkübasyon sırasında, plazmit pili yoluyla...

Homolog Rekombinasyon Yoluyla Siyanobakterilerde Antibiyotik İşaretli Mutantların Üretilmesi

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the phage-mediated transfer of donor DNA carrying an excisable antibiotic resistance cassette into Escherichia coli. The integrated cassette replaces the target gene via homologous recombination, resulting in a stable gene deletion.

Generating Gene Deletions in E. coli via Phage-Mediated Transfer of an Excisable Antibiotic Cassette

Enterobacter sp. YSU glukoz az tuz ortamında büyür. Oksotroflan rastgele bir konakçı genom içine kendisini ekleyen bir transposome ile dönüştürülmesiyle oluşturulur. Mutantlar minimal orta karmaşık ortamdan replika plaka tarafından bulundu. Kesilen gen, kurtarma ve dizileme ile tespit edilir.

Üretilmesi Enterobacter Sp. YSU oksotroflan transpozon mutajenezi kullanarak,

Siyanobakterilere çoklu genomik değişikliklerin sokulması, endüstriyel ve temel araştırma amaçları için suşların geliştirilmesinde önemli bir araçtır. Model siyanobakteri türü Synechocystis sp. PCC6803'da işaretlenmemiş mutantlar ve Synechococcus sp. PCC7002'da işaretli mutantlar üretmek için bir sistem tarif ediyoruz.

Model siyanobakteri Türlerinde İşaretli ve belirtisiz Mutants Üretimi

Burada bir protokol antibiyotik direnç-kaset silme yapıları silme mutantlar diğer E. coli suşları yapmak için bir temel olarak önceden var olan kullanım için mevcut. Böyle silme mutasyonlar seferber ve büyük bir alıcı yük P1 bakteriyofaj iletim kullanarak odağı karşılık gelen eklenmiş.

Escherichia coli Excisable antibiyotik direnci kasetleri ile P1 iletim tarafından üreten gen silme

Burada açıklanan Streptococcus mutansbir gen ürün saflaştırma için basit bir yöntemdir. Bu teknik proteinlerin saflaştırılmasında, özellikle membran proteinlerinde ve yüksek moleküler kütle proteinlerinde avantajlı olabilir ve diğer çeşitli bakteri türleri ile birlikte kullanılabilir.

Streptococcus mutans'larda Yüksek Moleküler Kütle Proteininin Saflaştırılması

Burada, abd gıda ve ilaç İdaresi (FDA) onaylı Escherichia coli ticari uygulamalar için karşılaştırıldığında Pseudomonas aeruginosa genetik olarak değiştirilmiş suşlarının zayıflamasını değerlendirmek için enfeksiyon fare modelibasit ve tekrarlanabilir bir protokol açıklar.

Pseudomonas aeruginosa In-Frame Gen Silme Mutantlar Üretimi ve Enfeksiyon Basit Bir Fare Modelinde Virülans Zayıflama sıiçin Test

Burada tanımlanan floksed kaset allelic değişim mutagenezi, FLAEM kullanarak Chlamydia trachomatis hedefli, markerless gen delemesi için bir yöntemdir.

Klamidya trachomatis Floxed Kaset Allelic Exchange Mutagene tarafından Markerless Gen Deletion

Burada, Aeromonas'ın boş mutantlarının spesifik glikoziltransferazlarda veya glikoziltransferazlar içeren bölgelerde yapımını, motilitesi testlerini ve flagella saflaştırmasını, kodlanmış enzimlerinin bir glikanın biyosentezindeki katılımını ve işlevini ve bu glikanın bakteriyel patogenezdeki rolünü tanımlamaktayız.

Bakteriyel Glikoziltransferazların Bakteriyel Motilitedeki Rolünü Aydınlatmak için Boş Mutantların Üretilmesi

Öğrenin, Streptococcus mutans'ta iki aşamalı füzyon PCR ve elektroporasyon kullanarak hızlı ve maliyet etkin gen kesintisi yöntemini. Bu teknik mikrobiyolojide genetik araştırmaları hızlandırır ve diğer bakteri türlerine uyarlanabilir.

Nesil bir gen kesintiye Streptococcus mutans çoğunlukla zorlanma olmadan Gen Klonlama

Daha fazla video keşfet