Name: Vitro Fagositoz miyelin enkaz kemik iliği türevi makrofajlar tarafından (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Öğrenin kemik iliği kaynaklı makrofajların miyelin enkazını fagositozunu değerlendirme yöntemini. Bu protokol nörotravma araştırmalarında makrofaj yanıtlarını in vitro analiz etmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Glenn Sanger-Hodgson, medya uzmanı FSU Üniversite Tıp video prodüksiyon, düzenleme ve ses çalışmaları için teşekkür etmek istiyorum.
Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından (R01GM100474 ve R01GM072611) destek verdi.

Yöntemleri burada açıklanan ve Bölüm 2'de Florida Eyalet Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış olan ve ileri Kılavuzu bakım ve kullanım laboratuvar hayvanlarının, 8th edition için belirlenen kuralları izler . Bunda bu protokol için kullanılan tüm özel laboratuvar hayvan tesisi evde kadar kullanmak hayvanlardır. Vivo deneyler gerçekleştirilen öncesinde kurban oldu. Hayvan sayıları ortalama hücre ve miyelin koleksiyonları kullanımını en aza indirmek için bir kılavuz olarak kullanarak deneysel ihtiyacına göre.
Not: Bu iletişim kuralı kemik iliği türevi makrofajlar (BMDMs) (Bölüm 1), fluorescently etiketli beyin kaynaklı miyelin enkaz (Bölüm 2), miyelin enkaz fagositoz (Bölüm 3), analiz genel yordamı hazırlanması nesil açıklar ve Genel yordam miyelin enkaz lipid birikimi (Bölüm 4) çözümlenmesi için. Reaktif hazırlık, hücre hasat ve işleme, miyelin koleksiyonu ve etiketleme ve tahlil performans Laminer hava akımı Biyogüvenlik kabini tamamlanmalıdır.
1. birincil kemik iliği türevi makrofajlar nesil
<ol>
	<li>Hazırlık tam makrofaj kültür ortamının (CMCM) Not: kemik iliği nesilden makrofaj makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kullanımını gerektirir. Bu hazırlık L929 fare fibroblast şartına medya M-CSF kaynağı olarak kullanır.<ol>
		<li>L929 fare fibroblast şartına medya kodlamayla hücreleri tarafından 145 mm yemekleri ile 50 mL, yüksek glikoz (4500 mg/L L-glikoz) Dulbecco'nın modifiye kartal orta (% 5 yeni doğan buzağı serum (NCS) ve penisilin/streptomisin ile 7 gün boyunca takıma DMEM) oluşturun.</li>
		<li>Medya 3500 x g, 4 ° c'de 30 dakika 50 mL konik santrifüj tüpleri ve santrifüj kültürler toplamak</li>
		<li>Supernatants yeni bir 50 mL konik santrifüj tüpüne 0.2 µm şırınga filtre ile filtre. Klimalı ortam-80 ° C'de 6 aya kadar muhafaza edilebilir.</li>
		<li>DMEM yüksek glikoz için % 5 vol/vol NCS ekleyin, DMEM ve %1 %15 vol/vol L929 fare fibroblast şartına penisilin/streptomisin. Medya 4 ° C'de 2-3 ay boyunca saklanır. Kullanmadan önce 37 ° c sıcak.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Birincil kemik iliği hücreleri ve makrofaj indüksiyon koleksiyonu 
	Not: Bu iletişim kuralı bir fare kullanarak yaklaşık 20 milyon kemik iliği türevi makrofajlar (BMDMs) oluşturur.<ol>
		<li>8-10 hafta standart CO2 boğulma yönergeleri kullanarak eski fareler tarafından servikal yerinden çıkması takip için istediğiniz sayıyı ötenazi.</li>
		<li>% 70 (vol/vol) etanol: H2O kullanarak, kürk doyurarak hayvan sterilize.</li>
		<li>Karın küçük bir açılış kesmek ve dikkatli bir şekilde geri çekin temel doku ortaya çıkarmak için cilt. Periton boşluğuna delik değil için dikkat ediniz.</li>
		<li>Kalçada başlayıp ayak bileği her iki arka ayakları kaldırın. Yer 5-10 mL steril fosfat içeren 100 mm Petri kabına toplanan dokusuna arabelleğe alınmış serum (PBS) % 1'ile desteklenmiş penisilin/streptomisin. 
		Not: Otelde çeşitli hayvanlar işleme yemekleri doku bozulması sınırlamak için buz üzerinde tutmak emin olun.</li>
		<li>Kas ve bağ dokusu bir neşter kullanarak kemiğinden kaldırın. Sadece femur ve tibia kullanılan hücre koleksiyonu için fibula atılır.</li>
		<li>Toplanan kemik iliği boşluğuna her iki ucu bir neşter ile küçük bir bölümünden çıkararak maruz.</li>
		<li>25 g iğne kullanarak, CMCM ile kemik iliği boşluklar içine 50 mL konik santrifüj tüpü sifonu çek. Bir kez onlar yeterince temizlenen kemikleri beyaz görünür.</li>
		<li>Koleksiyon tamamlandığında, örnekleri oluşturulan bir tek hücre süspansiyon 30-90 s için bir 18 g iğne ile tahrik. 
		Not: Bir isteğe bağlı kırmızı kan hücresi (RBC) lizis adım bu noktada gerçekleştirilebilir. Son zamanlarda hücre içi demir içeriği miyelin enkaz makrofaj polarizasyon16üzerine etkilerini etkileyebilir sürülmüştür. RBC lizis adım olmasıyla ilgili bilgi için Trouplin ve arkbakın. 17.</li>
		<li>Süspansiyon 70 µm steril hücre süzgeç aracılığıyla yeni bir 50 mL konik santrifüj tüpüne filtre.</li>
		<li>Tohum hücrelerini eşit olarak 15-20 mL CMCM içeren 145 mm hücre kültür yemekleri toplanan. Yaklaşık üç kültür yemekleri feda fare başına kullanın. Kültürler 37 ° c, % 5 CO2kuluçkaya.</li>
		<li>72 saat yapışık olmayan hücreleri kaldırmak için bir kez steril PBS ile plakalar yıkadıktan sonra 15-20 mL ekleyin taze CMCM. Kültürler için 37 ° c, % 5 CO2ek bir 4 gün kuluçkaya. Toplam kültürünün 7 gün sonra başlangıçta izole kemik iliği hematopoetik hücreler olgun BMDMs (şekil 1) olacaktır.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. nesil Fluorescently etiketli beyin kaynaklı miyelin enkaz
Not: Tüm reaktifler 4 ° C'de 1 ay boyunca saklanır.
<ol>
	<li>Miyelin enkaz toplama reaktifler hazırlanması
	<ol>
		<li>Tris· hazırlamak CL arabellek çözüm.<ol>
			<li>800 mL distile deiyonize H2O (ddiH2O) eklemek 1 M Tris· 20 mL CL, pH 7,45 (20 mM son konsantrasyonu) ve 20 mL 100 mm Na2EDTA (2 mM son konsantrasyonu).</li>
			<li>PH 7,45 için ayarlayın. DdiH2O. filtre solution'ı 0.2 µm filtrasyon ünitesi ile 1000 ml ses düzeyini ayarlayın.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>1 M Sükroz çözüm hazırlamak.<ol>
			<li>Tris· 100 mL için CL arabellek çözüm, 68.46 g Sükroz ekleyin. Tris· ile 200 mL için ses düzeyini ayarlama CL arabellek çözüm. 0.2 µm filtrasyon ünitesi ile çözüme filtre.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Tris· 1 M Çözümle sulandrarak 200 mL 0.32 M Sükroz çözeltisi hazırlamak CL arabellek çözüm 0.83:0.16 (vol/vol).</li>
		<li>Tris· 1 M Çözümle sulandrarak 150 mL 0,83 M Sükroz çözeltisi hazırlamak CL arabellek çözüm 0.83:0.16 (vol/vol).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Beyin elde edilen ham miyelin enkaz topluluğu 
	Not: Burada açıklanan koleksiyonu ham miyelin enkaz yalıtım için yöntemidir.<ol>
		<li>10-12 fareler 8-10 hafta-in yaş servikal çıkığı tarafından izlenen standart CO2 boğulma yönergeleri uygulayarak ötenazi.</li>
		<li>Beyni incelemek ve 10 mL 0.32 M Sükroz çözeltisi içeren bir 100 mm tabak koyun.</li></ol></li></ol>Buz üzerinde çanak tutmak.
		<li>Beyin içine kesilmiş steril Cerrahi makas kullanarak boyutu yaklaşık3 5 mm parçaları.</li>
		<li>50 mL konik santrifüj tüpü doku transferi ve yaklaşık 30 mL 0.32 M Sükroz çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>Düzgün bir çözüm elde kadar steril bir el döner homogenizer ile homojenize.</li>
		<li>Homojenize beyin son hacmiyle 0.32 M Sükroz çözüm ile 90 mL seyreltik.</li>
		<li>Altı 38,5-mL ince duvarlı polipropilen ultracentrifuge tüpler için 20 mL 0,83 M Sükroz çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>Yavaşça homojenize beyin çözüm iki kat karıştırmak için değil dikkat çekici 0,83 M Sükroz çözüm en üstüne ekleyin.</li>
		<li>Her tüpün 0.32 M Sükroz çözüm ile denge.</li>
		<li>Uygun bir kullanarak 4° C'de 45 dk için 100.000 x g, santrifüj ultracentrifuge rotor ön soğutmalı. Rotor hızlanma ve yavaşlama miyelin enkaz kaybını azaltmak için en düşük değerlerine geri ayarlayın.</li>
		<li>Miyelin enkaz iki Sükroz yoğunlukları arabiriminden toplamak. 
		Not: enkaz tüp merkezine doğru beyaz bir grup olarak görünmelidir.</li>
		<li>Ham miyelin enkaz bir 50 mL konik santrifüj tüpüne birleştirmek ve yaklaşık 35 ml Tris· kullanarak ses seviyesini CL arabellek çözüm.</li>
		<li>30-60 s için steril bir el döner homogenizer ile ham miyelin enkaz lunaparkçı.</li>
		<li>Süspansiyon 6 temiz ultracentrifuge tüpleri ve Tris· uygun bir hacmi ile denge arasında eşit olarak bölmek CL arabellek çözüm.</li>
		<li>Uygun bir kullanarak 4° C'de 45 dk için 100.000 x g, santrifüj ultracentrifuge rotor ön soğutmalı. Rotor hızlanma ve yavaşlama maksimum değerlerine döndürecek.</li>
		<li>Katı beyaz granül şimdi görünür olacak gibi süpernatant atmak ve granül 10-15 mL Tris· yeniden askıya alma CL arabellek çözüm.</li>
		<li>Süspansiyon 2 temiz ultracentrifuge tüpler ve Tris· uygun bir hacmi ile denge arasında eşit olarak bölmek CL arabellek çözüm.</li>
		<li>Santrifüj tekrar 100.000 x g için uygun bir kullanarak 4 ° C'de 45 dk de ultracentrifuge rotor ön soğutmalı. Rotor hızlanma ve yavaşlama maksimum değerlerine döndürecek.</li>
		<li>Süpernatant atın ve 5-6 mL steril PBS granül resuspend ve süspansiyon önceden ağırlığını 1.5 mL mikro-santrifüj tüpleri uygun sayıda arasında bölün.</li>
		<li>4 ° C'de 10 dakika için 22.000 x g, santrifüj</li>
		<li>Süpernatant atın ve miyelin enkaz parçaları ağırlığını belirlemek.</li>
		<li>Granül, yeniden 100 mg/mL nihai bir konsantrasyon için PBS içinde askıya alma. 
		Not: on kadar twelve beyin da 10-15 mL 100 mg/mL miyelin enkaz üretmek için yeterlidir. Miyelin enkaz-80 ° C'de deposu için 6 ay olabilir.</li>
	
	
	<li>Miyelin enkaz floresan etiketleme
	<ol>
		<li>50 µM carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) çözüm kullanımdan hemen önce hazırlayın.<ol>
			<li>Steril PBS kullanarak, 5 mM stok çözeltisi % 100 Dimetil sülfoksit (DMSO) 50 µM son çalışma konsantrasyon için hazırlanan CFSE oranında seyreltin.</li>
			<li>Çözüm 0.2 µm şırınga filtre ile filtre.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>100 mg/mL miyelin enkaz istenilen miktarda çözülme ve steril 29 g iğne ile yeniden askıya alma. 
		Not: miyelin enkaz buz gibi o çözüm resuspension kullanmadan önce gerektiren kadar neden olur.</li>
		<li>Miyelin enkaz önceden ağırlığını 1.5 mL mikro-santrifüj tüpü aktarın.</li>
		<li>4° C'de 10 dakika 14,800 x g, santrifüj Süpernatant atmak.</li>
		<li>CFSE çözüm pelleted 100 µL miyelin enkaz başına 200 µL miyelin enkaz resuspend.</li>
		<li>Oda sıcaklığında ışıktan korunan (RT) 30 dk için kuluçkaya.</li>
		<li>4 ° C'de 10 dakika 14,800 x g, santrifüj Süpernatant atmak.</li>
		<li>Pelet yıkama arabellek 600-800 µL içinde resuspend (0.2 µm filtre sterilize PBS 100 mM glisin).</li>
		<li>4 ° C'de 10 dakika 14,800 x g, santrifüj Süpernatant atmak.</li>
		<li>Adımları 2.3.8-2.3.9 iki kez daha tekrarlayın.</li>
		<li>Son yıkama sonra miyelin enkaz Pelet ağırlığını belirlemek ve 100 mg/mL steril PBS ile yeniden askıya alabiliriz. Not: Etiketli miyelin enkaz 6 aya kadar-80 ° C'de deposu olabilir.</li>
	</ol>
	</li>

3. miyelin enkaz fagositoz tahlil
Not: Fagositoz fluorescently etiketli miyelin enkaz gözlemlemek için temel yöntem aşağıdadır. Diğer tedaviler ve deneysel koşullar ek araştırmacı tarafından optimize edilmiş olması gerekir.
<ol>
	<li>Tedavi plakaları hazırlanması
	<ol>
		<li>Her 145 mm plaka için olgun BMDMs Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (dPBS) (pH 7,4) 5-6 mL 10 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) kullanarak bir 15 mL konik santrifüj tüpüne toplamak. 
		Not: Hücreleri18etkinleştirme durumunu değiştirebilir tripsin kullanmayın.</li>
		<li>Önceden ısıtılmış CMCM eşit bir hacmi kendine hakim hücre her tüp için ekleyin.</li>
		<li>8 dk. 20 ° C'de için 180 x g, santrifüj Süpernatant atmak.</li>
		<li>Hücreleri CMCM ve sayısı alanındaki yeniden askıya alma.</li>
		<li>24-şey hücre kültür plaka her şey için CMCM 1 mL 1 x 105 hücreleri ekleyin.</li>
		<li>37 ° c, % 5 CO2 24 h için kuluçkaya.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Miyelin enkaz tedavi ve analiz
	<ol>
		<li>Miyelin enkaz için her şey (son konsantrasyonu 1 mg/mL) olarak 100 mg/mL CFSE 10 µL etiketli ekleyin.</li>
		<li>1-3 saat 37 ° c, % 5 CO2kuluçkaya.</li>
		<li>Plaka sigara yuttu miyelin enkaz kaldırmak için 3 kez steril PBS ile yıkayın.</li>
		<li>400 µL % 4 paraformaldehyde, her şey için ekleyin. 30 dk RT. az için kuluçkaya</li>
		<li>Plaka 2 kez steril PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Höchst 33258 çözüm 400 µL her şey için ekleyin. Işıktan korunan RT, 5 min için kuluçkaya.</li>
		<li>Tabak 2 kez steril PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Fluoro-jel 200 µL Tris arabelleği ile photobleaching azaltmak için her şey için ekleyin.</li>
		<li>Görüntü hücre ters bir epi-floresan yetenekli mikroskop kullanarak. 
		Not: CFSE uyarma ve emisyon dalga boylarında 494 vardır nm ve 521 nm, anılan sıraya göre.</li>
		<li>CFSE pozitif hücre sayısı çekirdeği göreli miyelin enkaz alımını belirlemek için sayıya bölme.</li>
		<li>Görüntüleme önce plakaları ışıktan korunan 4 ° C'de 7 güne kadar korumak.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. yağ kırmızı-O boyama ile hücre içi lipidler miktar
Not: Hücre içi miyelin enkaz türetilmiş lipidler gözlemlemek için temel yöntem aşağıdadır.Miyelin enkaz etiketli CFSE kullanımı nedeniyle spektral örtüşme boyama ORO floresan miktar için tavsiye edilmez. Diğer tedaviler ve deneysel koşullar ek araştırmacı tarafından optimize edilmiş olması gerekir.
<ol>
	<li>Hazırlık çözümler boyama
	<ol>
		<li>% 0,5 yağ kırmızı-O (ORO) Boyama çözüm hazırlamak.<ol>
			<li>Yavaş yavaş ORO (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) karıştırma süre. 0,5 g % 100 propilen glikol (1,2-Propanediol) 100 mL eklemek</li>
			<li>Çözüm 95 ° C'de 15 dakika veya tüm büyük parçacıklar çözünene kadar ısı. 
			Not: üzerinde 100 ° c ısı değil</li>
			<li>Solution'ı filtre kağıt hala sıcak iken yeni bir konteyner içine filtre.</li>
			<li>Serin gecede RT. çözüm çözüm-ebilmek var olmak stok RT. ilâ 1 yıl için izin</li>
		</ol>
		</li>
		<li>%85 propilen glikol çözeltisi hazırlamak.<ol>
			<li>% 100 propilen glikol 85 mL ddiH2O. kadar karışık heyecan için 15 mL ekleyin. Çözüm-ebilmek var olmak stok ilâ 1 yıl RT.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tedavi plakaları hazırlanması
	<ol>
		<li>Tabi belgili tanımlık yöntem Bölüm 3'te özetlenen bir 24-şey tabak hazırlamak.</li>
		<li>37 ° c, % 5 CO2 24 h için kuluçkaya.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Miyelin enkaz tedavi
	<ol>
		<li>100 mg/mL miyelin enkaz 10 µL her şey (son konsantrasyonu 1 mg/mL) ekleyin.</li>
		<li>1-3 h 37 ° c, % 5 CO2için kuluçkaya.</li>
		<li>Plaka sigara sindirilmiş miyelin enkaz kaldırmak için 3 kez steril PBS ile yıkayın. Not: Bu noktada, tabaklar da hemen fiksasyon uygulayabilir veya taze CMCM eklenebilir ve hücreleri kuluçka için ek zaman Puan girildi.</li>
		<li>400 µL % 4 paraformaldehyde, her şey için ekleyin. 30 dk RT. az için kuluçkaya</li>
		<li>2 kez ile steril PBS sonra procced boyama için plaka yıkayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ORO boyama ve analiz
	<ol>
		<li>Sabit plaka ddiH2O. ile 3 kez yıkamak</li>
		<li>Her şey % 100 propilen glikol 400 µL ekleyin ve RT., 5 min için kuluçkaya 
		Not: Bu ertelenmiş ddiH2O. azaltır</li>
		<li>Propilen glikol Aspire edin ve her şey için 400 µL ORO çözüm ekleyin.</li>
		<li>8 dk. 60 ° C'de için kuluçkaya</li>
		<li>ORO çözüm Aspire edin. Daha sonra her şey için % 85 propilen glikol 400 µL ekleyin ve RT., 5 minumintes için kuluçkaya</li>
		<li>Plaka ddiH2O. ile 3 kez yıkamak</li>
		<li>Höchst 33258 çözüm 400 µL her şey için ekleyin. RT, ışıktan korunan, 5 min için kuluçkaya.</li>
		<li>Tabak 2 kez steril PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Fluoro-jel 200 µL Tris arabelleği ile her şey için ekleyin.</li>
		<li>Görüntü hücre ters bir epi-floresan yetenekli mikroskop kullanarak. ORO standart bir Texas kırmızı veya DsRed filtre seti kullanarak yansıma.</li>
		<li>ORO olumlu alanını her resim alanı belirleme ve çekirdeği sayısına bölen tarafından göreli lipid saklama ölçmek.</li>
		<li>İçin 7 gün 4 ° c seramik plakalar ışıktan korunan korumak.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
<li>Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-presenting+function+of+the+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen-presenting function of the macrophage.</a> Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).</li>
<li>Cavaillon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Cytokines and macrophages.</a> Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).</li>
<li>Ren, Y., Savill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+the+importance+of+being+eaten%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: the importance of being eaten.</a> Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+spinal+cord+injury%3A+phenotypic+and+functional+change+from+exposure+to+myelin+debris%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris.</a> Glia. 63 (4), 635-651 (2015).</li>
<li>Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+myelin+lipids+during+degeneration+and+regeneration+of+peripheral+nerve%3A+an+autoradiographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study.</a> J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).</li>
<li>Greenhalgh, A. D., David, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+Phagocytic+Response+of+Microglia+and+Peripheral+Macrophages+after+Spinal+Cord+Injury+and+Its+Effects+on+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death.</a> J Neurosci. 34 (18), 6316(2014).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+activates+FAK%2FAkt%2FNF-kappaB+pathways+and+provokes+CR3-dependent+inflammatory+response+in+murine+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system.</a> PLoS One. 5 (2), e9380(2010).</li>
<li>Gensel, J. C., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+its+role+in+repair+and+pathology+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury.</a> Brain Res. , 1-11 (2015).</li>
<li>Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+consists+of+a+continuum+of+particles+of+different+density+with+varying+lipid+composition%3A+major+differences+are+found+between+normal+mice+and+quaking+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants.</a> Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).</li>
<li>Larocca, J. N., Norton, W. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLarocca%2C+JN+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Norton, W. T., Poduslo, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+in+rat+brain%3A+method+of+myelin+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Myelination in rat brain: method of myelin isolation.</a> J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).</li>
<li>Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester+fluorescent+dye+for+cell+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).</li>
<li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+and+proliferation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies.</a> Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).</li>
<li>Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+image+analysis+approach+for+lipid+droplet+size+quantitation+of+Oil+Red+O-stained+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells.</a> Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).</li>
<li>Kroner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF+and+increased+intracellular+iron+alter+macrophage+polarization+to+a+detrimental+M1+phenotype+in+the+injured+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord.</a> Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).</li>
<li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow-derived+Macrophage+Production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Marrow-derived Macrophage Production.</a> J Vis Exp. (81), e50966(2013).</li>
<li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescuing+macrophage+normal+function+in+spinal+cord+injury+with+embryonic+stem+cell+conditioned+media%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media.</a> Mol Brain. 9 (1), 48(2016).</li>
<li>Bosco, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+synthetic+matrix+metalloproteinase+inhibitor+reduces+human+mesenchymal+stem+cell+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis.</a> PLOS ONE. 12 (2), e0172925(2017).</li>
<li>Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+adipose+conversion+and+triglycerides+by+staining+intracytoplasmic+lipids+with+oil+red+O%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem%22%5BJournal%5D)">Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O.</a> Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).</li>
<li>Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+oil+red+staining+permits+combination+with+immunofluorescence+and+automated+quantification+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids.</a> Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).</li>
<li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-Induced+Macrophage+Inflammatory+Response+Is+Regulated+by+SHIP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP.</a> J Immunol. 173 (1), (2004).</li>
<li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front Biosci. 13, (2008).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir açıklamalar var.

Burada açıklanan yordamları taze izole kaba CNS miyelin enkaz ve birincil kemik iliği türevi makrofajlar kullanmaktadır. Hayvan harcamaları azaltmak için her iki beyin önerilir ve kemik iliği hücreleri kurban anda her fare--dan hasat. Birlikte çalışan iki araştırmacı aynı anda her iki malzeme hazırlayabilirsiniz. Alternatif olarak, beyin-80 ° c miyelin enkaz yalıtım önce antibiyotik ile takıma PBS içinde saklanır. Hiç beyin bizim deneyim ilâ 1 ay miyelin enkaz üretme potansiyeli sezilebilir kaybı için bu koşullarda muhaf...

Makrofajlar (BMDMs) kemik iliği türevi doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık sistemleri arasında önemli bir bağlantı vardır. Antijen sunan hücreler (ZPT), olarak her iki antijen sunumu ile lenfositler ile iletişim kurabilir ve sitokin yayın1,2,3. Ancak, profesyonel fagositler onların birincil işlevi patojenler, yaşlı hücreler ve hücresel enkaz1,4temizlemektir. Bir omurilik yaralanması (SCI), miyelin enkaz önemli miktarda hücre tipi CNS axon myelination5için sorumlu ölmek üzere olan oligodendrocytes oluşturulur. Biz ve diğerleri miyelin enkaz temizleme BMDMs5,6,7infiltre öncelikle sorumluluğu olduğunu göstermiştir. Ancak, Medulla Spinalis Yaralanmalarında içinde siteleri engulfment miyelin enkaz bir pro-inflamatuar durumu5,8,9karşı bu normalde anti-inflamatuar hücreleri kaydırmaya sürülmüştür. Anahtar arabulucu nöro-inflamasyon yaralı spinal kord BMDMs önemli klinik hedefleridir.
BMDMs etkisi yaralı spinal kord araştırmak yardımcı olmak için nasıl BMDMs miyelin enkaz için yanıt doğrudan çalışmaya bir vitro modeli geliştirdik. Biyolojik alaka artırmak için birincil fare BMDMs ve taze izole miyelin enkaz bu araştırmalarda kullanılır. Bu nedenle, burada sunulan yöntemleri de detay yalıtım ve birincil fare BMDMs kültürünü ve fare CNS ayırmak için kullanılan bir değiştirilmiş Sükroz degrade teknik miyelin enkaz10,11,12türetilmiş. Miyelin enkaz kolayca floresan bir boya carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), sitotoksik sigara çünkü onun içselleştirilmesi BMDMs. CFSE tarafından de bu uygulama için uygun izlemek ve kendi dar floresan spektrum izni ile Etiketlenmiş diğer floresan ile çoğullama13,14sondalar. Fagositoz, miyelin enkaz lipidler organellerin taşınır ve nötr lipitler gibi hücre içi lipid damlacıkları5paketlenmiş. Bu hücre içi lipid birikimi ölçmek için boyama yöntemi kantitatif görüntü analizi için en iyi duruma getirilmiş bir yağ kırmızı O (ORO) mevcut. Bu basit boyama yöntemi sağlam tekrarlanabilir sonuçlar ve miktar15üretir. Bu yöntemlerden miyelin enkaz fagositoz ve lipid saklama sınırlı özel ekipman ile çalışma kolaylaştırmak.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>SH30243.01</td><td>L-glutamin, sodyum piruvat ile yüksek glikoz</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Çözeltisi Corning</td><td>30-002-CI</td><td>100X Çözeltisi</td></tr><tr><td>Yeni Doğan Buzağı Serumu (NCS)</td> <td>Rocky Mountain Biologics</td><td>NBS-BBT-5XM</td><td>Amerika Birleşik Devletleri Menşei</td></tr><tr><td>NCTC klonu 929 [L hücresi, L-929, Suş L'nin türevi] &nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td>L929 Şartlandırılmış Ortam Hazırlama Hücre Hattı</td></tr><tr><td>24 oyuklu Hücre Kültürü Plakaları</td><td>VWR</td><td>10062-896&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Kabı</td><td>Greiner Bio-One</td><td>639960</td><td>Polistirin, 145 / 20mm</td></tr><tr><td>CFSE Hücre Proliferasyon Kiti</td><td>Thermo Fisher</td><td>C34570</td><td>Yeniden Yapılandırma için</td></tr><tr><td>DMSO, Tris Tamponlu Floro-jel Sağlandı&nbsp;</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>17985-11</td><td></td></tr><tr><td>Yağ Kırmızısı O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Ekipman</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Malzemeler</güçlü></td><td><güçlü>Şirket</güçlü></td><td><güçlü>Katalog Numarası</güçlü</td><td>><güçlü>Yorumlar<></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj Tüpleri</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td>İnce Duvar, Polipropilen, 38,5 mL, 25 x 89 mm</td></tr><tr><td>SW 32 Ti Ultrasantrifüj Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td>SW 32 Ti Rotor, Sallanan Kova, Titanyum</td></tr><tr><td>El Tipi Döner Homojenizatör</td><td>Fisher Science</td><td>08-451-71</td><td></td></tr></tbody></table>

vitro fagositoz miyelin enkaz kemik iliği türevi makrofajlar tarafından

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Makrofajlar (BMDMs) kemik iliği elde edilen profesyonel fagositler olarak kritik bir fizyolojik rolü parçacıklar çeşitli Temizleme yeteneğine hizmet olgun lökosit vardır. Normalde, BMDMs merkezi sinir sistemi (MSS) sınırlı ama bir yaralanma, onlar kolayca sızmak olabilir. Bir kez yaralı CNS doku içinde BMDMs lipid zengin miyelin enkaz büyük miktarlarda dahil olmak üzere yaralanma kaynaklı hücresel enkaz için izni sorumlu birincil hücre türü vardır. BMDM infiltrasyon ve miyelin enkaz fagositoz MSS içinde neuropathological yansımaları karmaşık ve iyi anlaşılan. Burada, açıklanan protokollere izin ver BMDMs doğrudan vitro çalışma bağlamında, CNS yaralanma için. Biz fare BMDM yalıtım ve kültür, miyelin enkaz hazırlama ve deneyleri BMDM miyelin enkaz fagositoz değerlendirmek için kapağı. Bu teknikler önemli özel ekipman veya malzemeler için gerek kalmadan sağlam ölçülebilir sonuçlar üretmek henüz araştırmacılar ihtiyaçlarını karşılamak üzere kolayca özelleştirilebilir.

Miyelin enkaz etiketli CFSE ile BMDMs tedavisinde açık içselleştirilmesi (Şekil 2) verim. 3 saatlik etkileşim vakit BMDMs sağlam aşağı akım algılama için yeterli eklenen miyelin enkaz phagocytose için yeterli olsa da, hücre içi birikimi ile etkileşim 1 saat kadar görülebilir. Ancak, bazı miyelin enkaz hala yıkandıktan sonra hücre yüzeyinde mevcut olabilir. Bu yetersiz yıkama veya tam değil içselleştirilmiş fagositoz erken evrelerinde parçacıkları nedeniyle olabilir.
<p class="jove_conten...

Biz birincil fare kemik iliği türevi makrofajlar fluorescently etiketli miyelin enkaz ve hücre içi lipid damlacık boyama kullanarak fagositik kapasitesini değerlendirmek için yöntemler mevcut.

Vitro Fagositoz miyelin enkaz kemik iliği türevi makrofajlar tarafından

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

Bu protokolün genel amacı, beyin kaynaklı miyelin kalıntılarının kemik iliği kaynaklı makrofaj fagositozunu değerlendirmektir. Bu protokol, nörotravma alanındaki temel soruları yanıtlamak için tasarlanmıştır. Bu yöntemin avantajı, in vitro makrofaj yanıtlarının, özellikle miyelin kalıntıları için kemik iliği kaynaklı makrofajların fagositik kapasitesinin in vitro olarak verimli ve nispeten uygun maliyetli analizine izin vermesidir.Bu yöntem, harici modülatörlerin etkilerini araştırmak için kolayca uyarlanabilir. Fareyi% 70 etanol ile doyurduktan sonra karın derisinde bir açıklık açın. Diseksiyon için bacakları ortaya çıkarmak için cildi geri çekin.Bu işlem sırasında periton boşluğunu delmemeye dikkat edin. Açığa çıktıktan sonra, ayak bileğini ve kalçayı keserek bacakları çıkarın. Bacakları antibiyotiklerle desteklenmiş buz gibi soğuk PBS'ye yerleştirin.Diğer bacak için tekrarlayın. Diseksiyon sırasında dokuya yapışmış olabilecek partikülleri çıkarmak için dokuyu antibiyotiklerle desteklenmiş taze buz gibi PBS'de yıkayın. Kas boyunca uygulanan hafif bir kazıma hareketi, istenmeyen dokunun çoğunu yerinden çıkaracaktır.Bir neşter ve cımbız ile tibiayı kas ve bağ dokusundan kurtarın. Serbest bırakıldıktan sonra, ilik boşluğunu ortaya çıkarmak için her iki ucunu da çıkarın. Femur için bu işlemi tekrarlayın.Tam kemik iliği türevi makrofaj ortamı ile doldurulmuş 20 milimetrelik bir şırıngaya 25 gauge bir iğne takın. Sonra kemik iliği boşluğunu yıkayın. Kemik yeterince yıkandığında beyaz görünecektir.Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için toplanan ilik aspiratlarını 18 gauge iğne ile 30 ila 90 saniye boyunca çalkalayın. Daha sonra süspansiyonu steril 70 mikrometre gözenek boyutunda bir hücre süzgecinden geçirin. Hücre süspansiyonlarını 145 santimetrelik hücre kültürü kaplarına eşit olarak bölün.Her fare toplam üç yemek için yeterli olacaktır. Yedi günlük kültürden sonra, bu yemekler tipik olarak olgun makrofajlarla %70 ila %80 arasında birleşecektir. Ham miyelin kalıntılarını beyinlerden izole etmek için bir dizi sükroz gradyan ultrasantrifüjleme adımı gerçekleştirilir.Başlamak için, sekiz ila 10 haftalık farelerden 10 ila 12 beyin çıkarılır. Beyinler daha sonra 0.32 molar sükroz çözeltisi içinde homojenize edilir ve daha sonra süreksiz bir gradyan oluşturmak için 0.383 molar sükroz çözeltisi yastığı üzerine katmanlanır. Santrifüjlemeyi takiben, ham miyelin kalıntısı katmanlar arasındaki arayüzde bulunur.Bu toplanır ve bir Tris tampon çözeltisine dağıtılır ve miyelin kalıntılarını peletlemek için tekrar santrifüjlenir. Pelet, Tris tampon çözeltisi içinde tekrar süspanse edilir ve ek senetrifügasyon için iki tüp arasında bölünür. Başlamak için, tüm beyni çıkarın ve buz gibi soğuk 0.32 molar sükroz çözeltisi içeren bir tabağa koyun.Steril cerrahi makas kullanarak, toplanan beyinleri yaklaşık beş milimetre büyüklüğünde parçalar halinde kesin. Bu adım, sonraki homojenizasyon işlemine yardımcı olur. Dokuyu 50 mililitrelik bir tüpe toplayın.Döner bir homojenizatör kullanarak, dokuyu pürüzsüz bir bulamaç halinde homojenize edin. Tüm büyük görünür beyin katılarının tamamen homojenize edildiğinden emin olun. 20 mililitre 0.83 molar sükroz çözeltisi içeren bir ultrasantrifüj tüpüne, ayırmayı korumaya özen göstererek üretin ve homojenleştirin.0.32 molar sükroz çözeltisini kullanarak her tüpü dikkatlice dengeleyin. Bitirdikten sonra, tüpleri uygun bir santrifüj rotoruna aktarın ve 100.000 kez yerçekiminde, dört santigrat derecede 45 dakika döndürün. Hızlanma ve yavaşlamanın minimum değerlerine ayarlandığından emin olun.Santrifüjleme tamamlandıktan sonra, miyelin kalıntıları sakaroz yoğunluk arayüzü arasında görünür olacaktır. Miyelin kalıntılarını nazikçe toplayın. Toplandıktan sonra, miyelin kalıntılarına Tris tamponu ekleyin.Döner homojenizatör ile tekrar homojenize edin. Homojenatı altı temiz ultrasantrifüj tüpü arasında bölün ve tüpleri gerektiği gibi ek Tris tamponu ile dengeleyin. Toplanan miyelin kalıntılarını 100.000 kez yerçekiminde, dört santigrat derecede 45 dakika boyunca, hızlanma ve yavaşlama maksimum değerlerine ayarlanmış olarak tekrar santrifüjleyin.Santrifüjlemeden sonra miyelin peletlenmiş olacaktır. Tris tamponunu kullanarak peleti yeniden askıya alın. Süspansiyonları ve ultrasantrifüjü tekrar birleştirin.Santrifüjlemeden sonra, sıkıca paketlenmiş bir pelet oluşturulur. Süpernatı boşaltın. Peleti steril PBS'de yeniden süspanse edin.Yeniden süspanse edilmiş miyelin kalıntılarını önceden tartılmış mikrosantrifüj tüplerine eşit olarak bölün. 22.000 kez yerçekiminde 10 dakika santrifüjledikten sonra, PBS süpernatını çıkarın. Peleti tarttıktan sonra, PBS ile mililitre başına 100 miligramlık bir konsantrasyona geri dönün.Elde edilen ham miyelin kalıntısı artık fagositoz çalışması için uygundur. CFSE etiketleme miyelin kalıntısı, erken içselleştirmenin yanı sıra hücre içi trafiği izlemek için kullanılabilir. Etiketlenmemiş miyelin kalıntıları, içselleştirilmiş lipitlerin depolanmasını ve metabolizmasını değerlendirmek için Yağ Kırmızısı-O lipid boyama ile uyumludur.Eksi 80 santigrat derecede depolanmış miyelin kalıntıları kullanıyorsanız, önce 29 gauge iğne ile yeniden askıya almak isteyeceksiniz. 200 mikrolitre PBS'de 10 miligram peletlenmiş miyelin kalıntısını yeniden süspanse edin. Sonra iki mikrolitre beş milimolar CFSE çözeltisi ekleyin.Karıştırmak için pipetleyin. 30 dakikalık bir inkübasyondan sonra, ışıktan ve ardından yıkamadan korunarak, miyelin kalıntılarını PBS ile mililitre başına 100 miligrama kadar yeniden süspanse edin. % 4 paraformaldehit ile kültür ve fiksasyondan sonra, her oyuğa% 100 propilen glikol ekleyin.Oda sıcaklığında beş dakika inkübe ettikten sonra, her bir oyuğa Yağ Kırmızı-O boyama solüsyonu ekleyin. Hafif çalkalama ile 60 santigrat derecede sekiz dakika inkübe edin. Yağ Kırmızısı-O lekesinin tamamen aspire edilmesini sağlamak için plakayı hafifçe eğin.Her kuyucuğa% 85 propilen glikol ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakikalık inkübasyondan sonra, kuyuları PBS ile yıkayın ve hücreleri seçtiğiniz nükleer boya ile boyayın. Kültür sırasında kemik iliği hücrelerinin temsili ışık mikroskobu görüntüleri.İlk tohumlamadan 24 saat sonra, az sayıda yapışık hücre bulunur. Bununla birlikte, makrofaj koloni uyarıcı faktör olan M-CSF varlığında, lökosit öncü hücreleri farklılaşmaya başlar. M-CSF varlığında yedi günlük kültürden sonra, öncü hücreler fagositoz yapabilen olgun kemik iliği kaynaklı makrofajlara tamamen farklılaşır.Bu yöntemi kullanarak, sekiz ila 10 haftalık tek bir C57 siyah 6J faresi tipik olarak 18 ila 24 milyon kemik iliği makrofajı verecektir. İçselleştirmeyi görselleştirmek için, kemik iliği türevli makrofaj kültürlerine CFSE etiketli miyelin kalıntıları eklenir. Hücreler, yıkanmadan ve %4 paraformaldehit ile fiksasyondan önce bir saat boyunca mililitre CFSE etiketli miyelin kalıntısı başına bir miligram ile muamele edildi.İçselleştirilmiş miyelin kalıntıları, epifloresan özellikli bir mikroskopta standart GFP filtre setleri kullanılarak görselleştirilebilir. Miyelin lipid birikiminin zaman içinde nasıl değiştiğini göstermek için, makrofajlar 90 dakika boyunca etiketlenmemiş miyelin kalıntıları ile muamele edildi, daha sonra çeşitli zaman noktalarında yıkandı ve sabitlendi. Yıkamadan hemen sonra, birkaç lipit damlacığı görülebilir.Bununla birlikte, zaman ilerledikçe, daha fazla lipit damlacığı görünür hale gelir ve yıkamadan yaklaşık 24 saat sonra maksimuma ulaşır. Makrofajlar, lipit depolarına akış için metabolize olmaya başlayacak ve lekelenebilir damlacıkların sayısını azaltacaktır. Yağ Kırmızısı-O boyamasını ölçmek için, epifloresan özellikli bir mikroskop kullanılarak her bir zaman noktası örneğinden rastgele elde edilen beş görüntü elde edildi.Petrol Kırmızısı-O lekeli alan, DsRed kanalında yakalanan görüntüler kullanılarak her kuyu için belirlendi. Toplam hücre sayısı, her alanda bulunan çekirdek sayısı sayılarak belirlenir. Bu grafik, elde edilen nicelemeyi göstermektedir.Kemik iliğinden türetilmiş makrofajlar içselleştirilmiş miyelin lipidlerini nötr lipidlere dönüştürdüğü için Yağ Kırmızısı-O-pozitif sinyalinde sabit bir artış tipiktir. Yağ Kırmızısı-O-pozitif sinyalindeki bir azalma, makrofajlar lipitleri metabolize etmeye veya dışarı atmaya başladığında 24 saat sonra zirveyi takip eder. Bu videoyu izledikten sonra, birincil kemik iliği türevli makrofajların nasıl izole edileceği ve kültürleneceğinin yanı sıra bunların yeni izole edilmiş beyin kaynaklı miyelin kalıntıları ile etkileşimlerini nasıl inceleyeceğiniz konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.Bu prosedürlerin en önemli kısmı, aseptik tekniğin her zaman uygun şekilde sürdürülmesidir. Makrofajlar, küçük miktarlarda patojenle ilişkili moleküllere sağlam bir şekilde yanıt verebildiğinden, sonuçları önyargılı hale getirebilecek herhangi bir potansiyel etkileşimi en aza indirmek çok önemlidir. Bu tekniklerin temel avantajı, ihtiyaç duyulan özel ekipman miktarını ortadan kaldırırken, bizi biyolojik olarak ilgili birincil hücrelerden ve taze miyelin kalıntılarından oluşturmalarıdır.Ek olarak, bazı kullanıcı optimizasyonları ile bu yöntemler, kemik iliği kaynaklı makrofajların miyelin kalıntılarına tepkisi ile ilgili çok çeşitli soruları ele almak için kolayca uyarlanabilir. Hem floresan etiketli miyelin kalıntılarını hem de miyelinli makrofajın Yağ Kırmızısı-O boyamasını kullanarak, çeşitli nörotravmalardan muzdarip hastalar için potansiyel terapötik müdahaleleri araştırmak mümkündür. Bu tür bir çalışmanın genel amacı, inflamasyon çözünürlüğünü teşvik etmek için uzak makrofaj aracılı hücresel kalıntı temizliğidir.

in-vitro-phagocytosis-myelin-debris-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Makrofajlar uzun doğal ve adaptif immün yanıtları kritik bir bileşeni olarak kabul edilmiştir. Makrofajlar ve mikrop arasındaki etkileşimin, evrimsel genetik ve biyokimyasal yönleri ile ilgili bilginin son patlama makrofajlara bilimsel ilgi yenilenmiştir. Bu makalede, fare kemik iliği makrofajları ayırt etmek için bir yöntem tarif edilir.

Kemik İliği Makrofaj üretim kaynaklı

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Canlı Makrofagların içinde Phagolysosome Biogenesis&#39;den Çalışması

Biz makrofaj C görselleştirmek için nasıl açıklar neoformans (Cn) dijital ışık mikroskobu kullanılarak litik olmayan ekzositoz sürecine özel vurgu ile gerçek zamanlı etkileşim,. Ayrı ayrı enfekte makrofajlar bu tekniği kullanarak bu olayın çeşitli yönlerini belirlemek için ele alınabilir.

Sigara litik Ekzositoz görselleştirme Cryptococcus neoformans Dijital Işık mikroskopi ile Makrofagların gelen

Burada, in vitro deneyler için doğum sonrası fare yavrularından mikroglia izole etmek için bir protokol (gün 1) sunulmuştur. izolasyon Bu doğaçlama yöntem hem de yüksek verim ve saflıkta, mikroglial biyoloji açıklık amacıyla geniş bir aralık deney sağlar alternatif yöntemler üzerinde önemli bir avantaj oluşturur.

Geliştirilmiş Saflık ve Çok Yönlü İlköğretim mikroglia hızlı ve Rafine CD11 Manyetik İzolasyon

Biz burada Salmonella typhimuriumyalıtım için basit ve hızlı bir yöntem tarif-biotin ve streptavidin bakterilerle kaplama tarafından phagosomes üzerinden makrofajlar içeren.

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Burada dönen disk confocal mikroskobu görüntüsü tek fagositik olayları için fare ikamet periton makrofajlar tarafından kullanma yöntemleri açıklanmaktadır. İletişim kuralları diğer fagositik hücreler için genişletilebilir.

Fagositoz fare makrofajlar tarafından hızlandırılmış 3D görüntüleme

Nörodejeneratif hastalıklar düzensiz mikroglia fonksiyonları ile ilişkilidir. Bu makalede, iPSC-makrofajlar tarafından nöroblastom hücrelerinin fagositozunun in vitro bir tahlili özetlenen bir makale verilmiştir. Nicel mikroskopi okumaları hem canlı hücre zaman atlamalı görüntüleme hem de sabit hücreli yüksek içerikli görüntüleme için açıklanmıştır.

İPSC-Makrofajlar tarafından Ölü Nöroblastom Hücrelerinin Fagositozu için İn vitro Nicel Görüntüleme Tahlili

Bu protokol, farelerden kemik iliği kaynaklı makrofajların izolasyonunu ve kültürünü açıklamaktadır.

Farelerden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Bu protokol, 7-9 günlük yenidoğan fare kemik iliği hücrelerini izole etmek ve granülosit koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kaynağı olarak L929 hücrelerinin bir süpernatantını kullanarak farklılaşmış makrofajlar oluşturmak için enzimatik olmayan ve basit bir yöntemi tanımlar. Kemik iliği kaynaklı makrofajlar, yüzey antijenleri F4/80, CD206, CD11b ve fonksiyonel yeterlilik açısından daha fazla analiz edildi.

Yenidoğan Fare Kemik İliği İzolasyonu ve Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Hazırlanması

Mevcut protokol, tekrarlayan manyetik stimülasyonun mikroglia'nın miyelin kalıntılarını fagositoz etme yeteneği üzerindeki etkisini değerlendirmek için tasarlanmıştır. Bunu yapmak için bir in vitro mikroglia ve miyelin kalıntı ko-kültür sistemi kurulmuştur.

Miyelin Kalıntılarının Mikroglial Fagositozunun Değerlendirilmesi in vitro Tekrarlanan Manyetik Stimülasyon Altında

Öğrenin kemik iliği kaynaklı makrofajların miyelin enkazını fagositozunu değerlendirme yöntemini. Bu protokol nörotravma araştırmalarında makrofaj yanıtlarını in vitro analiz etmek için kullanılır.

Vitro Fagositoz miyelin enkaz kemik iliği türevi makrofajlar tarafından

Daha fazla video keşfet