Vitro Fagositoz miyelin enkaz kemik iliği türevi makrofajlar tarafından

Biz birincil fare kemik iliği türevi makrofajlar fluorescently etiketli miyelin enkaz ve hücre içi lipid damlacık boyama kullanarak fagositik kapasitesini değerlendirmek için yöntemler mevcut.

Bu protokolün genel amacı, beyin kaynaklı miyelin kalıntılarının kemik iliği kaynaklı makrofaj fagositozunu değerlendirmektir. Bu protokol, nörotravma alanındaki temel soruları yanıtlamak için tasarlanmıştır. Bu yöntemin avantajı, in vitro makrofaj yanıtlarının, özellikle miyelin kalıntıları için kemik iliği kaynaklı makrofajların fagositik kapasitesinin in vitro olarak verimli ve nispeten uygun maliyetli analizine izin vermesidir.

Bu yöntem, harici modülatörlerin etkilerini araştırmak için kolayca uyarlanabilir. Fareyi% 70 etanol ile doyurduktan sonra karın derisinde bir açıklık açın. Diseksiyon için bacakları ortaya çıkarmak için cildi geri çekin.

Bu işlem sırasında periton boşluğunu delmemeye dikkat edin. Açığa çıktıktan sonra, ayak bileğini ve kalçayı keserek bacakları çıkarın. Bacakları antibiyotiklerle desteklenmiş buz gibi soğuk PBS'ye yerleştirin.

Diğer bacak için tekrarlayın. Diseksiyon sırasında dokuya yapışmış olabilecek partikülleri çıkarmak için dokuyu antibiyotiklerle desteklenmiş taze buz gibi PBS'de yıkayın. Kas boyunca uygulanan hafif bir kazıma hareketi, istenmeyen dokunun çoğunu yerinden çıkaracaktır.

Bir neşter ve cımbız ile tibiayı kas ve bağ dokusundan kurtarın. Serbest bırakıldıktan sonra, ilik boşluğunu ortaya çıkarmak için her iki ucunu da çıkarın. Femur için bu işlemi tekrarlayın.

Tam kemik iliği türevi makrofaj ortamı ile doldurulmuş 20 milimetrelik bir şırıngaya 25 gauge bir iğne takın. Sonra kemik iliği boşluğunu yıkayın. Kemik yeterince yıkandığında beyaz görünecektir.

Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için toplanan ilik aspiratlarını 18 gauge iğne ile 30 ila 90 saniye boyunca çalkalayın. Daha sonra süspansiyonu steril 70 mikrometre gözenek boyutunda bir hücre süzgecinden geçirin. Hücre süspansiyonlarını 145 santimetrelik hücre kültürü kaplarına eşit olarak bölün.

Her fare toplam üç yemek için yeterli olacaktır. Yedi günlük kültürden sonra, bu yemekler tipik olarak olgun makrofajlarla %70 ila %80 arasında birleşecektir. Ham miyelin kalıntılarını beyinlerden izole etmek için bir dizi sükroz gradyan ultrasantrifüjleme adımı gerçekleştirilir.

Başlamak için, sekiz ila 10 haftalık farelerden 10 ila 12 beyin çıkarılır. Beyinler daha sonra 0.32 molar sükroz çözeltisi içinde homojenize edilir ve daha sonra süreksiz bir gradyan oluşturmak için 0.383 molar sükroz çözeltisi yastığı üzerine katmanlanır. Santrifüjlemeyi takiben, ham miyelin kalıntısı katmanlar arasındaki arayüzde bulunur.

Bu toplanır ve bir Tris tampon çözeltisine dağıtılır ve miyelin kalıntılarını peletlemek için tekrar santrifüjlenir. Pelet, Tris tampon çözeltisi içinde tekrar süspanse edilir ve ek senetrifügasyon için iki tüp arasında bölünür. Başlamak için, tüm beyni çıkarın ve buz gibi soğuk 0.32 molar sükroz çözeltisi içeren bir tabağa koyun.

Steril cerrahi makas kullanarak, toplanan beyinleri yaklaşık beş milimetre büyüklüğünde parçalar halinde kesin. Bu adım, sonraki homojenizasyon işlemine yardımcı olur. Dokuyu 50 mililitrelik bir tüpe toplayın.

Döner bir homojenizatör kullanarak, dokuyu pürüzsüz bir bulamaç halinde homojenize edin. Tüm büyük görünür beyin katılarının tamamen homojenize edildiğinden emin olun. 20 mililitre 0.83 molar sükroz çözeltisi içeren bir ultrasantrifüj tüpüne, ayırmayı korumaya özen göstererek üretin ve homojenleştirin.

0.32 molar sükroz çözeltisini kullanarak her tüpü dikkatlice dengeleyin. Bitirdikten sonra, tüpleri uygun bir santrifüj rotoruna aktarın ve 100.000 kez yerçekiminde, dört santigrat derecede 45 dakika döndürün. Hızlanma ve yavaşlamanın minimum değerlerine ayarlandığından emin olun.

Santrifüjleme tamamlandıktan sonra, miyelin kalıntıları sakaroz yoğunluk arayüzü arasında görünür olacaktır. Miyelin kalıntılarını nazikçe toplayın. Toplandıktan sonra, miyelin kalıntılarına Tris tamponu ekleyin.

Döner homojenizatör ile tekrar homojenize edin. Homojenatı altı temiz ultrasantrifüj tüpü arasında bölün ve tüpleri gerektiği gibi ek Tris tamponu ile dengeleyin. Toplanan miyelin kalıntılarını 100.000 kez yerçekiminde, dört santigrat derecede 45 dakika boyunca, hızlanma ve yavaşlama maksimum değerlerine ayarlanmış olarak tekrar santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra miyelin peletlenmiş olacaktır. Tris tamponunu kullanarak peleti yeniden askıya alın. Süspansiyonları ve ultrasantrifüjü tekrar birleştirin.

Santrifüjlemeden sonra, sıkıca paketlenmiş bir pelet oluşturulur. Süpernatı boşaltın. Peleti steril PBS'de yeniden süspanse edin.

Yeniden süspanse edilmiş miyelin kalıntılarını önceden tartılmış mikrosantrifüj tüplerine eşit olarak bölün. 22.000 kez yerçekiminde 10 dakika santrifüjledikten sonra, PBS süpernatını çıkarın. Peleti tarttıktan sonra, PBS ile mililitre başına 100 miligramlık bir konsantrasyona geri dönün.

Elde edilen ham miyelin kalıntısı artık fagositoz çalışması için uygundur. CFSE etiketleme miyelin kalıntısı, erken içselleştirmenin yanı sıra hücre içi trafiği izlemek için kullanılabilir. Etiketlenmemiş miyelin kalıntıları, içselleştirilmiş lipitlerin depolanmasını ve metabolizmasını değerlendirmek için Yağ Kırmızısı-O lipid boyama ile uyumludur.

Eksi 80 santigrat derecede depolanmış miyelin kalıntıları kullanıyorsanız, önce 29 gauge iğne ile yeniden askıya almak isteyeceksiniz. 200 mikrolitre PBS'de 10 miligram peletlenmiş miyelin kalıntısını yeniden süspanse edin. Sonra iki mikrolitre beş milimolar CFSE çözeltisi ekleyin.

Karıştırmak için pipetleyin. 30 dakikalık bir inkübasyondan sonra, ışıktan ve ardından yıkamadan korunarak, miyelin kalıntılarını PBS ile mililitre başına 100 miligrama kadar yeniden süspanse edin. % 4 paraformaldehit ile kültür ve fiksasyondan sonra, her oyuğa% 100 propilen glikol ekleyin.

Oda sıcaklığında beş dakika inkübe ettikten sonra, her bir oyuğa Yağ Kırmızı-O boyama solüsyonu ekleyin. Hafif çalkalama ile 60 santigrat derecede sekiz dakika inkübe edin. Yağ Kırmızısı-O lekesinin tamamen aspire edilmesini sağlamak için plakayı hafifçe eğin.

Her kuyucuğa% 85 propilen glikol ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakikalık inkübasyondan sonra, kuyuları PBS ile yıkayın ve hücreleri seçtiğiniz nükleer boya ile boyayın. Kültür sırasında kemik iliği hücrelerinin temsili ışık mikroskobu görüntüleri.

İlk tohumlamadan 24 saat sonra, az sayıda yapışık hücre bulunur. Bununla birlikte, makrofaj koloni uyarıcı faktör olan M-CSF varlığında, lökosit öncü hücreleri farklılaşmaya başlar. M-CSF varlığında yedi günlük kültürden sonra, öncü hücreler fagositoz yapabilen olgun kemik iliği kaynaklı makrofajlara tamamen farklılaşır.

Bu yöntemi kullanarak, sekiz ila 10 haftalık tek bir C57 siyah 6J faresi tipik olarak 18 ila 24 milyon kemik iliği makrofajı verecektir. İçselleştirmeyi görselleştirmek için, kemik iliği türevli makrofaj kültürlerine CFSE etiketli miyelin kalıntıları eklenir. Hücreler, yıkanmadan ve %4 paraformaldehit ile fiksasyondan önce bir saat boyunca mililitre CFSE etiketli miyelin kalıntısı başına bir miligram ile muamele edildi.

İçselleştirilmiş miyelin kalıntıları, epifloresan özellikli bir mikroskopta standart GFP filtre setleri kullanılarak görselleştirilebilir. Miyelin lipid birikiminin zaman içinde nasıl değiştiğini göstermek için, makrofajlar 90 dakika boyunca etiketlenmemiş miyelin kalıntıları ile muamele edildi, daha sonra çeşitli zaman noktalarında yıkandı ve sabitlendi. Yıkamadan hemen sonra, birkaç lipit damlacığı görülebilir.

Bununla birlikte, zaman ilerledikçe, daha fazla lipit damlacığı görünür hale gelir ve yıkamadan yaklaşık 24 saat sonra maksimuma ulaşır. Makrofajlar, lipit depolarına akış için metabolize olmaya başlayacak ve lekelenebilir damlacıkların sayısını azaltacaktır. Yağ Kırmızısı-O boyamasını ölçmek için, epifloresan özellikli bir mikroskop kullanılarak her bir zaman noktası örneğinden rastgele elde edilen beş görüntü elde edildi.

Petrol Kırmızısı-O lekeli alan, DsRed kanalında yakalanan görüntüler kullanılarak her kuyu için belirlendi. Toplam hücre sayısı, her alanda bulunan çekirdek sayısı sayılarak belirlenir. Bu grafik, elde edilen nicelemeyi göstermektedir.

Kemik iliğinden türetilmiş makrofajlar içselleştirilmiş miyelin lipidlerini nötr lipidlere dönüştürdüğü için Yağ Kırmızısı-O-pozitif sinyalinde sabit bir artış tipiktir. Yağ Kırmızısı-O-pozitif sinyalindeki bir azalma, makrofajlar lipitleri metabolize etmeye veya dışarı atmaya başladığında 24 saat sonra zirveyi takip eder. Bu videoyu izledikten sonra, birincil kemik iliği türevli makrofajların nasıl izole edileceği ve kültürleneceğinin yanı sıra bunların yeni izole edilmiş beyin kaynaklı miyelin kalıntıları ile etkileşimlerini nasıl inceleyeceğiniz konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.

Bu prosedürlerin en önemli kısmı, aseptik tekniğin her zaman uygun şekilde sürdürülmesidir. Makrofajlar, küçük miktarlarda patojenle ilişkili moleküllere sağlam bir şekilde yanıt verebildiğinden, sonuçları önyargılı hale getirebilecek herhangi bir potansiyel etkileşimi en aza indirmek çok önemlidir. Bu tekniklerin temel avantajı, ihtiyaç duyulan özel ekipman miktarını ortadan kaldırırken, bizi biyolojik olarak ilgili birincil hücrelerden ve taze miyelin kalıntılarından oluşturmalarıdır.

Ek olarak, bazı kullanıcı optimizasyonları ile bu yöntemler, kemik iliği kaynaklı makrofajların miyelin kalıntılarına tepkisi ile ilgili çok çeşitli soruları ele almak için kolayca uyarlanabilir. Hem floresan etiketli miyelin kalıntılarını hem de miyelinli makrofajın Yağ Kırmızısı-O boyamasını kullanarak, çeşitli nörotravmalardan muzdarip hastalar için potansiyel terapötik müdahaleleri araştırmak mümkündür. Bu tür bir çalışmanın genel amacı, inflamasyon çözünürlüğünü teşvik etmek için uzak makrofaj aracılı hücresel kalıntı temizliğidir.