Name: Hidrodinamik Renal Pelvis enjeksiyon böbrek proteinlerin Non-viral ifade (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Öğrenin böbrek pelvisine hidrodinamik enjeksiyon yöntemiyle yetişkin fare böbreğinde plazmid DNA'dan spesifik protein ifadesi sağlamayı. Bu teknik nefroloji araştırmalarında tekrarlanabilir sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bir kariyer geliştirme Ödülü gelen Department of Veterans Affairs [BX002797] L.E.W. ve ulusal sağlık Enstitüleri [R01-DK095867] desteklenen ve Amerikan Kalp Derneği [15GRNT25700209] J.C. desteklenen Ulusal Sağlık Enstitüleri [DK093660], Department of Veterans Affairs [BX002190] ve böbrek hastalığı Vanderbilt Merkezi M.H.W. desteklenen Bu malzeme kaynakları ve VA Tennessee Vadisi sağlık sistemine tesislerinin kullanımı ile desteklenen iş sonucudur.

<ol><li>Liu, F., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics-based+transfection+in+animals+by+systemic+administration+of+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).</li>
<li>Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+foreign+gene+expression+in+hepatocytes+after+tail+vein+injections+of+naked+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA.</a> Human Gene Therapy. 10, 1735-1737 (1999).</li>
<li>Fumoto, S., Nishimura, K., Nishida, K., Kawakami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Imaging+of+the+Intracellular+Fate+of+Plasmid+DNA+and+Transgene+Expression%3A+ZsGreen1+and+Tissue+Clearing+Method+CUBIC+Are+an+Optimal+Combination+for+Multicolor+Deep+Imaging+in+Murine+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Imaging of the Intracellular Fate of Plasmid DNA and Transgene Expression: ZsGreen1 and Tissue Clearing Method CUBIC Are an Optimal Combination for Multicolor Deep Imaging in Murine Tissues.</a> PLoS One. 11 (1), e0148233(2016).</li>
<li>Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naked+plasmid+DNA+transfer+to+the+porcine+liver+using+rapid+injection+with+large+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume.</a> Gene Ther. 13 (24), 1696-1702 (2006).</li>
<li>Kamimura, K., Suda, T., Xu, W., Zhang, G., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided%2C+lobe-specific+hydrodynamic+gene+delivery+to+swine+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Image-guided, lobe-specific hydrodynamic gene delivery to swine liver.</a> Mol Ther. 17 (3), 491-499 (2009).</li>
<li>Kamimura, K., Zhang, G., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided%2Cintravascular+hydrodynamic+gene+delivery+to+skeletal+muscle+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Image-guided,intravascular hydrodynamic gene delivery to skeletal muscle in pigs.</a> Mol Ther. 18 (1), 93-100 (2010).</li>
<li>Suda, T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+gene+delivery%3A+its+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications.</a> Mol.Ther. 15 (12), 2063-2069 (2007).</li>
<li>Alino, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naked+DNA+delivery+to+whole+pig+cardiac+tissue+by+coronary+sinus+retrograde+injection+employing+non-invasive+catheterization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Naked DNA delivery to whole pig cardiac tissue by coronary sinus retrograde injection employing non-invasive catheterization.</a> J Gene Med. 12 (11), 920-926 (2010).</li>
<li>Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+impact+of+hydrodynamic+injection+on+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver.</a> Gene Ther. 14 (2), 129-137 (2007).</li>
<li>Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+model+of+acute+kidney+injury+and+post+injury+fibrosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Woodard, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney-specific+transposon-mediated+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Kidney-specific transposon-mediated gene transfer in vivo.</a> Sci Rep. 7, 44904(2017).</li>
<li>Liang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+glutathione+S-transferase+A4+accelerates+obstruction-induced+tubule+damage+and+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Loss of glutathione S-transferase A4 accelerates obstruction-induced tubule damage and renal fibrosis.</a> Journal of Pathology. 228 (4), 448-458 (2012).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+of+insulin-like+growth+factor-1+receptor+in+endothelial+cells+against+unilateral+ureteral+obstruction-induced+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Protective role of insulin-like growth factor-1 receptor in endothelial cells against unilateral ureteral obstruction-induced renal fibrosis.</a> Am J Pathol. 185 (5), 1234-1250 (2015).</li>
<li>Corridon, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+facilitate+and+monitor+expression+of+exogenous+genes+in+the+rat+kidney+using+plasmid+and+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">A method to facilitate and monitor expression of exogenous genes in the rat kidney using plasmid and viral vectors.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 304 (9), F1217-F1229 (2013).</li>
<li>Wallace, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+kidney+volume+in+mice+with+polycystic+kidney+disease+by+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Tracking kidney volume in mice with polycystic kidney disease by magnetic resonance imaging.</a> Kidney Int. 73 (6), 778-781 (2008).</li>
<li>Woodard, L. E., Wilson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-ing+models+and+new+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">piggyBac-ing models and new therapeutic strategies.</a> Trends Biotechnol. 33 (9), 525-533 (2015).</li>
<li>Yeikilis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics+based+transfection+in+normal+and+fibrotic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics based transfection in normal and fibrotic rats.</a> World J Gastroenterol. 12 (38), 6149-6155 (2006).</li>
<li>Thalhofer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+transgenic+Leishmania+parasites+in+a+live+host%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Wooddell, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+damage+after+delivery+of+naked+plasmid+DNA+into+skeletal+muscles+is+batch+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Muscle damage after delivery of naked plasmid DNA into skeletal muscles is batch dependent.</a> Hum Gene Ther. 22 (2), 225-235 (2011).</li>
<li>Crespo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+liver+gene+transfer+mechanism+involves+transient+sinusoidal+blood+stasis+and+massive+hepatocyte+endocytic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic liver gene transfer mechanism involves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocytic vesicles.</a> Gene Ther. 12 (11), 927-935 (2005).</li>
<li>Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rAAV9+combined+with+renal+vein+injection+is+optimal+for+kidney-targeted+gene+delivery%3A+conclusion+of+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study.</a> Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa ve hiçbir çıkar çatışması bildirmek üzere bir şey yok.

Bu protokol için tekrarlanabilir gen ekspresyonu özellikle böbrek de ulaşmak için sağlam bir yöntemi açıklanmıştır. Orta derecede deneyimli bir cerrah elinde transgene okuma duyarlılığını ve 50-%100, fare yaş bağlı olarak çeşitli olması için bu tekniği tarafından transfected fareler yüzdesi bulduk. Luciferase gen ekspresyonu düzeyini arka plan üstüne piggyBac Transpozonlar alma farelerde birkaç ay oldu ve tamamen aynı Transpozonlar11alma immün farelerde birkaç hafta saklanır. Hücrelerin ç...

Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon tekniği gen ekspresyonu fare karaciğer1,2yüksek düzeylerine ulaşmak için yaygın olarak kullanılan bir yol haline gelmiştir. Böbrekler de bu tekniği çok daha alt bir düzeyde, yaklaşık 100-fold daha az3ile transfected. Burada açıklanan hidrodinamik renal pelvis enjeksiyon organ ifade daha önce karaciğer4' te,5 kurulmuş aynı hidrodinamik ilkeleri kullanarak fiziksel yollarla özgüllük denetlemek için basit bir yol sağlar , kas6ve diğer organları7,8. Basınç kullanarak canlı hayvan vivo içinde hücrelerde bu yöntem transfects ve aynı anda hızlı bir şekilde organ hasar inducing sıvı içeren DNA hücre zorlamak için hız9çözüldü. Tarafından insülin şırınga ile birlikte tek bir enjeksiyon kanat kesi10 üzerinden böbrek görselleştirmek için köklü cerrahi teknikleri kullanarak, çeşitli böbrek hücre, interstisyel fibroblastlar esas olarak başarılı transfection bulduk, tübüllerin ve toplama kanal11. Bu fareler diseksiyon diğer organ görüntüleme teknikleri11luciferase tarafından görselleştirmek için yüksek düzeyde transfected değil göstermiştir. Teknik olmayan viral olduğu için plazmid DNA kullanımına transfection için enjeksiyon için gerekli reaktifler hızlı ve kolay hazırlanması izin verir.
Antioksidan glutatyon S-transferaz A4, insülin benzeri büyüme faktörü-1 reseptör ve böbrek beklenen biyolojik etkileri11, ile tüm hormon Eritropoetin ifade için yerelleştirilmiş hidrodinamik iğneleri kullandık 12 , 13. yönetim, enjeksiyon hacmi, DNA dozaj ve organizatörü seçim rotanın ayrıntılı değerlendirme gerçekleştirilen11oldu. Ayrıca, bağışıklık reaksiyonu transgene için bastırmak için her iki piggyBac transposon sistemi ve/veya siklofosfamid tedavisi gösterilmiştir uzun vadeli gen ifadesi sonuçlar11geliştirmek için. Diğer araştırmacılar renal ven yaklaşım saat bir ay14daha büyük bir süre için yüksek transfection verimliliği elde başarı, fareyle kullanmışlardır. Ancak, genetik insan hastalığı taklit fenotipleri düzeltilmesi genellikle yapılma farelerde ilk kanıtı-of-concept olarak en memeli genetik modellerini fare modelleri olduğundan. Renal ven enjeksiyon renal pelvis enjeksiyon için karşılaştırıldığında ve renal pelvis içine enjeksiyon renal ven gen ekspresyonu (yaklaşık on daha yüksek) ve hayatta kalma11için daha üstün olduğunu ortaya koymuştur. Renal pelvis idrar üretim dalgalanmalar tolere esnek olduğu için böbrek girdiği ideal bir yoldur ve sık sık ne zaman bile hydronephrosis sırasında genişlemiş, yapısal bütünlüğünü korumak yapabiliyor. Ayrıca, renal pelvis içine enjeksiyon böbrek böbrek kapsülü enjekte sıvı gözle görülür tarafından böbrek intraparenchymal enjeksiyon iyi korunabilmesi izin, piercing olmadan erişebileceğini. Diğer fare organlara girişinin damarlara dışında bir yol var mı ama bir ideal enjeksiyon izi böbrek idrar alanıdır. Ayrıca, renal ven içine enjeksiyon karın boşluğuna kan sızıntı sonuçlandı. Vahşi tipi fare böbrekler toplam böbrek hacmi yaklaşık 0.2 cm3, tek böbrek hacmi yaklaşık renal pelvis tarafından hidrodinamik enjekte sıvı miktarı eşittir olmak manyetik rezonans görüntüleme tarafından tahmin edilmektedir enjeksiyon (100 µL)15. Burada, tüm böbrek tekrarlanabilir transfection elde etmek için hidrodinamik renal pelvis enjeksiyon protokolünün detaylı nüanslar mevcut yaptık.

<table><tbody><tr><td>AnaSed Xylazine</td><td>Patterson Veteriner</td><td>07-808-1947</td><td>Anestezik - Kontrolsüz madde</td></tr><tr><td>BD İnsülin Şırıngası 0.5 mL 29G 1/2 İnç</td><td>Kardinal Sağlık</td><td>309306</td><td>Gerekli şırıngalar</td></tr><tr><td>Buprenex</td><td>Eczacı/Veteriner</td><td></td><td>Analjezi - Kontrollü Madde</td></tr><tr><td>Dynarex Tek Kullanımlık Havlu Örtüsü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>19-310-671</td><td>Isı yastığının üzerine yerleştirin</td></tr><tr><td>EndoFree Plazmid Maxi Kiti</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Yalnızca endotoksin içermeyen plazmit DNA kullanın</td></tr><tr><td>Endosafe Jel-Pıhtı LAL Hızlı Pozitif Kontrol</td><td>Charles River</td><td>PC200</td><td>Endotoksin testi için pozitif kontrol</td></tr><tr><td>Endosafe Jel-Pıhtı LAL Hızlı Tek Test Flakonu</td><td>Charles River</td><td>R13500</td><td>Endotoksin testi</td></tr><tr><td>Ekstra İnce Mikro Diseksiyon Makası</td><td>Roboz Cerrahi Enstrüman</td><td>RS-5882</td><td>Cerrahi alet</td></tr><tr><td>Fisherbrand Anında Sızdırmazlık Sterilizasyon Torbası - 9 "</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>01-812-51</td><td>Cerrahi aletlerin otoklavlanması için</td></tr><tr><td>Gaymar Isı Pompası</td><td>Paragon Medical</td><td>TP-700</td><td>Su sirkülasyonlu ısı pompası</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>Roboz Cerrahi Alet</td><td>DS-401</td><td>Ameliyat sırasında cerrahi aletleri yeniden kullanmak için</td></tr><tr><td>Graefe Forseps</td><td>Roboz Cerrahi Alet</td><td>RS-5136</td><td>Cerrahi alet</td></tr><tr><td>Graefe Doku Forseps</td><td>Roboz Cerrahi Alet</td><td>RS-5153</td><td>Cerrahi alet</td></tr><tr><td>Halsey İğne Tutucu, 5 "Uzunluk</td><td>Roboz Cerrahi Alet</td><td>RS-7841</td><td>Cerrahi alet</td></tr><tr><td>Isı yastıkları - 15" x 21" - en az 3</td><td>Paragon Medical</td><td>TP22G</td> gerekir <td>Gaymar Isı Pompası</td></tr> <tr><td>ile kullanım içinIsoFlo (Isoflurane, USP)</td><td>Abbott Hayvan Sağlığı</td><td>5260-04-05</td><td>Görüntüleme ve ötenazi için</td></tr><tr><td>Isotec Isofluran Dağıtım Sistemi Vaporizor</td><td>Smiths Medical</td><td>VCT3K2</td><td>Görüntüleme ve ötenazi için</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Eczacı/Veteriner Anestezik</td><td></td><td>- Kontrollü Madde</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>Laboratuvar dokuları</td></tr><tr><td>Canlı Görüntü yazılımı</td><td>Kaliper Yaşam Bilimleri</td><td></td><td>Canlı hayvan görüntüleme için</td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Perkin Elmer</td><td>122796</td><td>Canlı hayvan görüntüleme için</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000-US-CAN</td><td>DNA ölçümü için spektrofotometre</td></tr><tr><td>Prevantics Swablar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23-100-110</td><td>Cilt cerrahisi hazırlığı için</td></tr><tr><td>Prolene 5-0 sütürler Konik 30 "</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0256891</td><td>Cilt için emilmeyen sütürler</td></tr><tr><td>Puralube Marka Oftalmik Merhem</td><td>Patterson Veteriner</td><td>07-888-2572</td><td>Ameliyat sırasında gözleri nemli tutmak için</td></tr><tr><td>Trans IT - QR Hidrodinamik Dağıtım Çözümü</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR-5240</td> DNA Vicryl 5-0 <td>Sütürlerin seyreltilmesi için hidrodinamik dağıtım tamponu</td></tr><tr><td>J303H</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9816710</td><td>Kas tabakası için emilebilir dikişler</td></tr><tr><td>Wahl Mini Arco Clipper</td><td>Med-Vet International</td><td>8787-1550</td><td>Cilt hazırlığı için tıraş makinesi</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200</td><td>Kaliper Yaşam Bilimleri</td><td></td><td>Canlı hayvan görüntüleme için</td></tr></tbody></table>

hidrodinamik renal pelvis enjeksiyon böbrek proteinlerin non-viral ifade

Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney

Hidrodinamik enjeksiyon plazmid DNA ve diğer maddeler ile çeşitli dokularda transfect için yerel, yüksek basınçlı bir ortam oluşturur. Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon, örneğin, hangi karaciğer transfected iyi kurulmuş bir yöntemdir. Bu el yazması plazmid DNA için böbrek özel gen ekspresyonu ile doğrudan fare böbrek iğne ile bir uygulama hidrodinamik ilkeleri açıklar. Fareler anestezi ve böbrek renal pelvis doğrudan bir plazmid DNA içeren çözüm hızlı bir iğne ile takip bir kanat kesi tarafından yararlanılır. İğneyi yerinde on saniye tutulur ve kesi sitesi dikmiş. Ertesi gün, hayvan görüntüleme live, Western blot veya immünhistokimya gen ekspresyonu tahlil için kullanılabilir veya diğer deneyleri seçim transgene için uygun faiz protein tespiti için kullanılır. Gen ifadesinin uzatmak için yayımlanmış yöntemleri transgene için bağışıklık yanıtını inhibe transposon-aracılı transgene entegrasyon ve siklofosfamid tedavisi içerir.

Cerrahi ve enjeksiyon tekniği gerçekleştirmek basit bir kez hakim, hiçbir büyük ekipman veya pahalı malzemeler gerektiren. Yeni Eğer kanat-kesi böbrek ameliyatı, birkaç fare ötenazi için zamanlanmış bir eğitim gün bu ameliyatı ilk denemesinde normalden daha uzun sürebilir çünkü fareler kurtarılan aşağıdaki ameliyat olan değil izin verilmelidir. Alternatif olarak, müfettişler benzer teknikleri ile tanıdık daha çok basit gelebilir. Şekil 1 ' deki çizim ve <stro...

Bu iletişim kuralı yoluyla renal pelvis transgene özellikle böbrek ifadede üretmek için fare böbrek içine plazmid DNA enjekte yöntemi açıklanır.

Hidrodinamik Renal Pelvis enjeksiyon böbrek proteinlerin Non-viral ifade

Hydrodynamic injection creates a local, high-pressure environment to transfect various tissues with plasmid DNA and other substances. Hydrodynamic tail ...

Bu cerrahi prosedürün genel amacı, yetişkin fare böbreğindeki plazmit DNA'sından protein ekspresyonu üretmektir. Bu yöntem, nefrolojide, ilgilenilen bir proteinin ekspresyonunun yetişkin böbreğini nasıl etkilediği gibi temel soruları ele almak için yeni bir araçtır. Bu tekniğin temel avantajı, diğer organlarda da gen ekspresyonu üretebilen diğer yöntemlerin aksine, özellikle böbrekte tekrarlanabilir bir şekilde protein ekspresyonu üretmesidir.Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü renal pelvisin enjeksiyonu dikkatli bir pozlama gerektirir ve plazma DNA'sının hücrelere girmesi için hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Hidrodinamik dağıtım tamponunda plazmit DNA'yı yeniden süspanse ederek başlayın. Fareyi mavi bir pedle kaplı su sirkülasyonlu bir ısı yastığına yerleştirin.Evcil hayvan bakımı için tasarlanmış bir tıraş makinesi kullanarak, farenin sırtının sol tarafını omuzdan kıçına ve yanlarından omurgasına kadar tıraş edin. Gevşek saçları ve kalıntıları temizleyin ve kornea kurumasını önlemek için her iki gözüne de veteriner merhemi uygulayın. Şimdi, anestezi uygulanan her fare için ayrı bir şırıngada 10 ila 50 mikrogram seyreltilmiş plazmit DNA içeren 100 mikrolitre hazırlayın ve hava kabarcığı olmadığından emin olun.İğne, herhangi bir güvenlik olmadan kalıcı olarak takılmalıdır. Ameliyatı gerçekleştirmeden önce, steril cerrahi aletleri ısı yastığı üzerine yerleştirilmiş steril bir tepsiye dokunmadan boşaltın. Şimdi, fareyi alın ve aydınlatılmış bir görüş alanına bağlayın.Ambalajdan% 3.15 klorheksidin glukonat ve% 70 izopropil alkol cilt antiseptik çubuklarını çıkarın ve hayvanın yanına yerleştirin. Steril cerrahi eldivenler giyin ve insizyon bölgesinden başlayarak, hayvanı dairesel hareketlerle üç kez yeni bir klorheksidin alkollü çubukla sürün. Şimdi, kesi bölgesini bulun.Cildi cımbızla sıkıştırın ve makas kullanarak cilt tabakasını omurgadan yaklaşık bir santimetre uzakta, göğüs kafesinin altında kesin. Kas tabakasında aşağıdan bir santimetre daha kesik yapın. Böbreği bulun ve dokunmadan, parmaklarınızla karın üzerine sabit bir şekilde hafifçe baskı uygulayarak karın boşluğundan nazikçe açığa çıkarın.Böbreği açığa çıkarmak bazen zordur. Dalağa zarar vermemek için karın ve omurgaya hafif baskı uygulayın. Böbrek dışındaki organlar dışarı çıkarsa, gerekirse kapalı forseps kullanarak nazikçe vücut boşluğuna geri koyun.Ardından, küçük beyaz bir nokta olarak görülebilen renal pelvisi görselleştirmek için böbreği çevreleyen yağdan nazikçe ayırın. Renal pelvisi görselleştirdikten sonra, renal pelvisin görünümde kalması için böbreğin sağ tarafını aşağı doğru itmek için kapalı forseps kullanın. Daha sonra yüklü insülin şırıngasını sağ elinizle çalışma yüzeyine paralel tutarak kavrayın ve iğneyi dikkatlice renal pelvise yerleştirin.İğne yerleştirildikten sonra, çözeltiyi üç saniye içinde hızlı bir şekilde enjekte edin. Çözeltinin geri akışını önlemek için iğnenin yaklaşık 10 saniye yerinde kalmasına izin verin. Daha sonra iğneyi yavaş ve dikkatli bir şekilde çıkarın ve kapalı forseps kullanarak kesi bölgesini nazikçe gererek organı karın boşluğuna geri koyun.Şimdi, kas tabakasını beş o emilebilir dikişlerle dikin ve iki ila dört bağımsız düğüm yerleştirin. Benzer şekilde, cilt tabakasını beş-O veya altı-O emilmeyen naylon dikişlerle dikin ve iki ila dört bağımsız düğüm yerleştirin. Transfeksiyon verimliliğini değerlendirmek için, ertesi gün canlı hayvan görüntülemesi yapmak üzere seyreltilmiş DNA'ya 10 mikrogram lusiferaz eksprese eden plazmid ekleyin.Farelerin ilk kafesini hazneye yerleştirin ve kapatın. Anestezi uygulandıktan sonra, her fareye intraperitoneal olarak 100 mikrolitre çözülmüş lusiferin enjekte edin ve zamanı kaydedin. Doğru kullanıcı kimliğini seçin ve üst menü çubuğundan edinim'e tıklayın ve açılır menüden iki otomatik kaydet'i seçin.Başlat'a tıklayarak sistemi başlatın. Başlatmanın bitmesini bekleyin ve beş fareyi görüntülemek için görüş alanını D olarak değiştirin. Hayvanların istenen sıraya yerleştirildiğinden ve böbreği görselleştirmek için sırtlarının kameraya baktığından emin olun.Ardından, görüntüyü çekmek için enjeksiyondan beş dakika sonra edin'e basın. Edinimden sonra, fareleri görüntüleme makinesinden çıkarın. Gazı kapat.Hazneyi, burun taraklarını ve görüntüleme aşamasını temizleyin. Verileri analiz etmek için, ROI araçlarına tıkladıktan sonra, daire simgesine tıklayın ve etrafında dört kare bulunan kırmızı bir oval ile gösterildiği gibi görüntüye yeni ROI yerleştirmek için açılır menüden birini seçin. ROI'nin boyutunu ayarlamak için, imleci kırmızı bir karenin üzerine getirin ve enjekte edilen böbreği kaplayan mor alanı çevrelemek için sürükleyin.Şimdi, bu ROI'ye sağ tıklayın ve mevcut pencerede ROI'yi çoğaltmak ve bir sonraki fareye taşımak için çift ROI'yi seçin. Menüden tüm ROI'leri doğrudan görüntünün üzerine yerleştirdikten sonra, birimleri sayımlardan parlaklık fotonlarına değiştirin. Son olarak, ROI araçlarına ve ardından kalem cetveli simgesine tıklayarak ROI verilerini araç damağından dışa aktararak ölçümlerin bir elektronik tablosunu oluşturun.Raportör plazmitlerin böbreğin spesifik gen ekspresyonu gösterilmiştir. Tüm farelere, gelişmiş ateşböceği lusiferazı ifade eden pTet plazmidi enjekte edilirken, farelere iki, üç ve beşinciye ayrıca kırmızı floresan proteini tdtomato'yu eksprese eden pEF1-alfa-tdtomato plazmidi enjekte edildi. Genel olarak, genç farelerdeki parlaklık bir büyüklük sırası içinde olacaktır.Bazı farelerin, düşük transfeksiyon verimliliği veya transgenin kendisinin eksikliği nedeniyle kayda değer parlaklık seviyeleri göstermemesi mümkündür. Hidrodinamik tampon enjeksiyonu bir kontrol görevi görür. Sadece hidrodinamik tampon verildiğinde plazmit ekspresyonu gözlenmez.Transfeksiyonu takip eden ilk birkaç gün içinde, transgen için pozitif lekelenen düşük sayıda hücre olacaktır. Bu hücreler, enjeksiyon sıvısının sızdığı bölgelerde yamalar halinde lokalize olarak görülür. Bu görüntüde, yeşil sinyaller lotus tetragonolobus aglütinini için boyanmış proksimal tübüllerden ve kırmızı sinyaller tdtomato raportör genini ifade eden transfekte edilmiş hücrelerden gelmektedir.Bir kez ustalaştıktan sonra, ameliyat 10 dakikadan daha kısa sürede yapılabilir, ancak anestezinin başlatılması ve iyileşmesi zaman alır. Bu nedenle, birlikte çalışan iki eğitimli personel, günde sadece yaklaşık 10 ila 15 fare yapabilir. Bu prosedürü denerken, genç fareleri kullanmayı unutmamak önemlidir.Hidrodinamik teknik, eski fibrotik organlarda da işe yaramaz. Bu prosedürü takiben, ilgilenilen genin ekspresyonunu değerlendirmek için kan, idrar ve böbrek dokusu örneklerinin analizi gibi başka yöntemler de uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, böbreğe özgü protein ekspresyonunu elde etmek için renal pelvise plazmit DNA'sının nasıl enjekte edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

hydrodynamic-renal-pelvis-injection-for-non-viral-expression-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kaynak: Gupta, K. ve diğerleri. Escherichia coli'nin pielonefrit fare modeline intrarenal enjeksiyonu.  J. Vis. Exp. (2017).Bu video, anestezi altında bir sıçanının böbrek pelvisine intrarenal enjekte edilerek lokal bir böbrek enfeksiyonu indükte edilmesini ve akut pielonefriti modellemesini göstermektedir. Konu, sonraki analizler için tekrarlanabilir in vivo enfeksiyon modeli oluşturmak için gerekli temel cerrahi adımları ve aseptik teknikleri vurgular.

Bir Farenin Böbrek Pelvisine E. coli'nin İntorental Enjeksiyonu

Source: Van Lidth de Jeude, et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the process of producing viral particles through transfection of embryonic kidney cells with plasmid–polyethylenimine complexes, which leads to viral genome expression, particle assembly, and virus collection in the medium.

Polyethylenimine-Mediated Transfection of Embryonic Kidney Cells for Recombinant Virus Production

Bu videoda, nükleik asit transfeksiyonu için fare böbreğinin renal pelvisine plazmitlerin hidrodinamik enjeksiyonu protokolünü sunuyoruz. Bu teknik, plazmitleri doku hasarına neden olmadan belirli bölgeye zorla iten yüksek hidrostatik basınç ilkesini kullanarak plazmitlerin organa spesifik olarak verilmesine izin verir.

Hidrodinamik Renal Pelvis Enjeksiyonu: DNA'yı Murin Modelinin Böbrek Hücrelerine Doğrudan Verme Tekniği

Bu videoda, sıçanlarda renal arter yoluyla intrarenal ilaç uygulamasını gösteriyoruz. Bu yöntem, ilaç hedeflemesini, ilaç gücünü iyileştirmede ve sistemik toksisiteyi en aza indirmede faydalıdır.

Sıçanlarda İntrarenal İlaç Dağıtımı: Sıçan Böbreğinde Terapötik İlaçların İntraarteriyel Enjeksiyon Yoluyla Verilmesi İçin Bir Yöntem

Burada, Xenopus laevis embriyolarının böbreğine yol açan bireysel blastomerlere enjeksiyonları hedeflemek için kader haritalarını ve soy izleyicilerini kullanmak için bir protokol sunuyoruz.

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

kemoterapötik antibiyotik arasında değişen ilaçlar yer alır nephrotoxins, kaynaklanacak böbrek yaralanmaları, kimin patogenezi tam olarak anlaşılamamıştır karmaşık bozuklukları oluşabilir. Bu protokol, zebra balığı böbrek koruyucu önlemlerin tanımlanması için uygulanabilir, bu koşullar, hastalık modelleme için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

Böbrek fonksiyonu geri kazanımı için ilaçların uygulanması lokalizasyonu ve tedavi bileşiğinin dağılımının kontrolünü gerektirir. Burada, detaylı sıçanlarda ilaçların intrarenal teslimat için basit bir teknik açıklar. Bu prosedür kolayca hiçbir ölüm ve yüksek ölçüde tekrarlanabilirliği ile gerçekleştirilebilir.

Sıçan Böbrek için Biologies intravasküler teslim

Bu el yazması, Escherichia coli'nin renal pelvise doğrudan intrarenal enfeksiyonu kullanan bir sıçan cerrahi piyelonefrit modelini tanımlamaktadır. Deneysel prosedür, piyelonefritin patogenezinin yanı sıra ilişkili inflamasyon ve fibrozisin patogenezini incelemek için kullanılabilir.

Intrarenal enjeksiyon Escherichia coli Piyelonefritli Sıçan Modelinde

Bu makalede, faredeki infrarenal abdominal aort içine yerleştirilen bir kateter aracılığıyla tek bir böbreğe hedefli doğum için bir yöntem açıklanmaktadır.

Böbrek Atardamarı Ile Böbreğe Doğrudan İlaç Verilmesi

Burada, çeşitli böbrek hastalığı fare modellerinde viral olmayan bir vektörün kuyruk damarı enjeksiyonu ve polietilenimin nanopartikülleri yoluyla böbreğe yapay olarak sentezlenmiş dışsal miRNA taklitleri veriyoruz. Bu, böbrekte hedef miRNA'nın önemli ölçüde aşırı ekspresyonuna yol açtı ve birkaç fare modelinde böbrek hastalığının ilerlemesini engelledi.

Çeşitli Böbrek Hastalığı Fare Modellerinde Polietilenimin Nanopartikülleri Kullanılarak Ekzojen Yapay Olarak Sentezlenmiş MiRNA Mimiklerinin Böbreğe Verilmesi

Bu rapor, fare böbreğine etkili ve güvenli gen transferi için renal pelvis yoluyla AAV vektörlerinin lokalize enjeksiyon yöntemini detaylandırmaktadır.

Adeno ilişkili virüs vektörlerinin yavaş retrograd renal pelvis enjeksiyonu yoluyla fare böbreğine etkili ve güvenli gen iletimi

Öğrenin böbrek pelvisine hidrodinamik enjeksiyon yöntemiyle yetişkin fare böbreğinde plazmid DNA'dan spesifik protein ifadesi sağlamayı. Bu teknik nefroloji araştırmalarında tekrarlanabilir sonuçlar sunar.

Hidrodinamik Renal Pelvis enjeksiyon böbrek proteinlerin Non-viral ifade

Daha fazla video keşfet