Name: Boş hücre biyokimyasal Fluorometrik enzimatik tahlil yüksek yoğunluklu Lipoprotein Lipid peroksidasyon yüksek üretilen iş ölçümü için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Öğrenin, HDL fonksiyonunu belirlemek için hücre dışı biyokimyasal florometrik enzimatik analiz yöntemini. Bu yöntem, kardiyovasküler hastalıklarda HDL lipid peroksidasyonunu ölçerek metabolik bozuklukların araştırılmasına yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar minnetle Dr Mohamad Navab, Alan Fogelman ve Srinivasa Reddy iş geliştirme, önceki yineleme bu modelin içindeki anahtar rolü için kabul. T.A.A. bir RMIT Üniversitesi-Şansölye Yardımcısı'nın doktora sonrası bursu tarafından desteklenir. AJ ve AA NHMRC proje desteği 1108792 tarafından desteklenir. TK tarafından desteklenmektedir NIH NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # µL1TR000124 verir.

tüm deneylerin insan biyolojik numuneleri kullanılarak etik onayıyla California Los Angeles, Los Angeles ve Alfred hastane insan Etik Komitesi, Melbourne Üniversitesi'nden gerçekleştirilmiştir.
 Not: fluorochrome HDL işlevi tahlil (bkz: tartışma) 32 birçok varyasyonu vardır. Aşağıda en tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar verir Protokolü anlatacağız. Genel testin Şekil 2 ' deki.
 1. numune işleme <ol><li>Kullanım taze, Sigara hemolyzed serum (serum ayırıcı tüplerde toplanan olabilir) veya sitrat plazma elde edilen 12-14 saat sonra oruç. Bu protokol için açıklandığı gibi uygun denetim cryopreserved örnekleri kullanıyorsanız, dahil.</li>
</ol> 2. Tahlil için gün 0-hazırlık <ol><li>hazırlama çalışma düzenini uygun denetimleri ile deneme örnekleri ve çoğaltır. Her örnek en az triplicates içinde çalıştırın. Bir temsilcisi 96 iyi düzen şekil 3 ' te gösterilen.</li>
	<li>Örnekleri ve çoğaltır sayısına göre tahlil için kullanılan reaktifler tüm birimleri hesaplamak. 
	Not: her çalışma hisse senedi yeterli hacim belirli deneme için her reaktif için olduğundan emin olmak için ek bir % 10 birim içerir.</li>
	<li>Etiket HDL, HDL-C (isteğe bağlı) ölçümü ve fluorochromeassay ayrılması için testin tüm farklı adımlar için gerekli tüm tüpler.</li>
</ol> 3. Gün 1-hazırlık denetimleri <ol><li>çalışma özel havuza alınan denetim hazırlanması <ol><li>oluşturma bir denetimi örneğini havuza alınan plazma veya serum tüm çalışma örnekleri. 20 örnekleri her plaka nüsha olarak çalışıyorsa, her örnek üzerinden 10 µL 200 µL havuza alınmış denetime birleştirin. Bu denetimin HDL-C değeri belirlemek için klinik laboratuvar için havuza alınan bu denetimin ayrı bir aliquot verin. 
		Not: Bu havuza alınan denetim tahlil standartlaştırmak ve olası tüm bilinen için hesap için kullanın (örneğin plazma, donma-çözülme çevrimleri, dondurma karşı bir matris serum yazın) ve deneysel değişkenlik etkileyebilir bilinmeyen kaynaklanan 27 , 28.</li>
	</ol></li> <li>Özel kalite kontrol (QCs) hazırlanması <ol><li>her laboratuvar (örneğin 5 mL plazma 10 sağlıklı bağışçılardan de gelen izole HDL) HDL büyük bir hazır hazırlamak ve bu birkaç aliquots cryopreserve hisse senedi donma-çözülme döngüsü en aza indirmek için.</li>
		<li>Kullanımı en az 10 farklı HDLox ortalama değerini belirlemek için bu stoktan çoğaltır. Ölçülen HDLox kabul edilebilir bir aralık değerleri için her QC örnek her tahlil dahil içinde &lt; bu ortalama değer of varyasyon katsayısı % 15.</li>
		<li>Vermek ayrı bir aliquot havuza alınan bu denetimin bu denetimin (örneğin 40 mg/dL) HDL-C değeri belirlemek için klinik laboratuvar. 
		Not: Daha detaylı bir yaklaşım kan kan bankalardan bu denetimleri oluşturmak için nasıl kullanılacağı açıklanan 27 , 28 , 32 olmuştur. Gerektiğinde ek QCs kullanın (örneğin bir sağlıklı bir donörden normal HDL işlevi ve bir büyük ölçüde anormal HDL iþlevi için bilinen bir donörden bilinmektedir.</li>
	</ol></li> <li>En iyi duruma getirme arka plan sinyal ve boş değerleri (isteğe bağlı) <ol><li>arka plan en aza indirmek için kurulan H 2 O hızla kaldırmak için kuluçka ortamda katalaz (1-4 U/mL) uygun miktarda ekleyin 2 nedeniyle kendiliğinden hava oksidasyon arabelleklerinin. 
		Not: değerleri boş kuyulardan (HDL) HDL örnekleri değerleri çıkarılan ve sonuçları olmak beri (yani aynı 96 iyi plaka dahil) bir havuza alınan denetimi göre rapor bu adımı değil pratikte affec mu bulduk t sonuçları. Böylece, katalaz ile arka plan sinyal duruma getirilmesi, gerekirse atlanabilir.</li>
	</ol></li></ol> 4. Gün 1-ayrılık HDL kolesterol HDL yağış kullanarak Not: bir ticari olarak mevcut standart HDL kolesterol Hizlandirici reaktif tükenmiş apoB serum üreticiye göre ayırmak için kullanın ' s talimatları. Bu reaktifler Renkölçer deneyleri HDL kolesterol düzeylerini belirlemek için yaygın olarak kullanılan.
<ol><li>Plazma veya serum örneği kullanmak taze (veya çözülme).</li>
	<li>Karışımı eşit miktarda (örneğin 80 µL) plazma ve HDL kolesterol reaktifi (% 20 w/v polietilen glikol glisin tampon pH 10.0 (25 ° C)) presipite.</li>
	<li>Mix de tarafından yukarı ve aşağı pipetting.</li>
	<li>, Santrifüj kapasitesi 1000-2000 g 10 dakika süreyle x</li>
	<li>Süpernatant (HDL kesir) Aspire edin.</li>
	<li>İdeal hemen izole HDL HDL lipid peroksidasyon fluorochromeassay için kullanın. Ancak, aynı gün içinde çeşitli örnekleri çalıştırmak ve HDL-kolesterol konsantrasyonu ölçümü yapılır Ayrıca gibi diğer adımları, sonra 4 ° C'de izole HDL kapaklarý takýlý bu ertesi gün fluorochromeHDL işlevi tahlil için.</li>
</ol> 5. Gün 1-HDL-C izole HDL tayini Not: HDL-C klinik laboratuvar değerini HDLox normale HDL-C miktar kadar kullanılırsa, isteğe bağlıdır.
<ol><li>Miktarını HDL-kolesterol plazma üzerinden, standart Renkölçer kullanarak 27 deneyleri. Kolesterol reaktif 50 µL her kuyuya ekleyin ve kolorimetrik plaka okuyucu ve bir kolesterol standart her Seti'nde sağlanan kullanarak kolesterol konsantrasyonu belirlemek.</li>
</ol> 6. Gün 2-reaktifler hazırlanması <ol><li>HRP 5 U/mL solüsyon (aralığı 1-10 U/mL) hazırlamak HRP ve kolesterol çözümler.</li>
	<li>20 mM fluorochrome (örneğin, Amplex kırmızı) çözümleri hazırlamak: bir şişe fluorochrome reaktif ve DMSO için oda sıcaklığında erimek. Kullanılmadan önce fluorochrome reaktifi (1 mg) DMSO 200 µL geçiyoruz. Saklamak hisse senedi çözüm dondurulup ≤-20 ° C, ışıktan korunan.</li>
	<li>Pozitif ve negatif kontrolleri hazırlayın: Kullanım 1 X ' reaksiyon arabellek ' kolesterol ve 20 mM H 2 O 2 çalışma çözüm negatif ve pozitif kontrol sırasıyla.</li>
</ol> 7. Gün 2-Fluorochrome tahlil <ol><li>Ekle 50 µL tepki arabellek boş (negatif kontrol) olarak x 1.</li>
	<li>İsteğe bağlı: olumlu denetim her plaka olarak 20 mM çalışma çözüm H 2 O 2 ekleyin.</li>
	<li>Deneysel değişkenlik en aza indirmek ve reaktifler ve örnekleri bu ek sağlamak için sürekli olarak yapılır ve zamanında, bir ayrı 96 de yuvarlak-alt, açık, polistren veya polipropilen plaka (plaka 1) örneklerinin tüm eklemeler gerçekleştirmek. Belirli birimlerdeki 3 96-şey kalıplara aktarmak için bir çok kanallı pipet kullanın (2-4 tabaklar: Polipropilen, düz botTom, siyah) (Bu aynı düzene sahip) ( Şekil 2, şekil 3).
	<ol><li>Örneğin, önce izole HDL 160 µL plaka 1 her şey/örnek ekleyin ve sonra çok kanallı pipet kullanımı ile HDL-kolesterol 50 µL 96-şey siyah kalıplara her şey/örnek aktarmak. Değiştirmek ipuçları arasında her satır/sütun ve filtre edilmemiş su ipuçlarını tüm transferler için kullanın.</li>
	</ol></li> <li>Bırakın örnekleri wells. Atmayın. Reaktifler eklenmesi arasında hiçbir yıkama adım vardır.</li>
	<li>Ekle 50 µL HRP çözüm 5 U/mL (0.25 U) her şey. 
	Not: Kullanım fluorochrome reaktif eklenmesi önce HRP.</li>
	<li>37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya Örnekleri kuluçka (reaktifler eklemeler arasında hiçbir yıkama adımları) sonra atmayın.</li>
	<li>Fluorochromereagent 300 son bir konsantrasyon için Ekle 50 µL µM. Bu noktada, toplam reaksiyon birimdir 150 µL. iyice karıştırın ve ışıktan korumak.</li>
	<li>Değerlendirmek (karanlıkta) floresan okuma her dakika 120 dk bir floresan plaka okuyucu (530/590 nm filtreleri) ile 37 ° C'de. 
	Not: daha kısa bir 60 dakika aralığı ile taze örnekler kullanın. O 120 dakikalık tahlil cryopreserved örnekleri kullanımı ile daha fazla tekrarlanabilir veri verir bulduk.</li>
	<li>Kaydetmek uygun yazılımı kullanarak veri.</li>
</ol> 8. Gün 3-veri analizi <ol><li>fluorochrome reaktif ilavesi sonra 120 dakika boş wells de dahil olmak üzere tüm örnekleri için kayıt Floresans birimleri (rasgele adet) ve tüm denetimleri.</li>
	<li>Floresan birimleri ortalama değerini hesaplamak (temel alan en az triplicates) (HDL ox_sample). Aykırı kabul ediyor (&gt; 2 ortalama değer üzerinden SDs) içine dikkat.</li>
	<li>Aşağıdaki denklemi kullanarak arka plan Floresans çıkarma: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq1.jpg"></li> <li>normalleştirme HDL kolesterol miktarı (HDL-C) için: HDL-C tarafından HDLox lipid peroksidasyon değeri (havuzda çalıştırılır denetimi dahil) her örnek için Normalize) (mg/dl). Sonuçları bölümü HDL öküz n HDL-c Duzeltme yansıtacak şekilde (HDL-C) HDLox ölçü olarak sunulur Aşağıdaki denklemi kullanın: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq2.jpg"></li> <li>HDLox lipid peroksidasyon değeri her örnek havuza alınan bir denetimin değerini karşı ifade standartlaştırmak. (HDL-C) HDLox lipid peroksidasyon değeri (HDL-C için ayarlanabilir) her örnek için n n (HDL-C) HDLox lipid peroksidasyon havuza alınan denetiminin değerini normalleştirmek. Sonuçları bölümü HDL öküz deneysel değişkenliği ve HDL-c Duzeltme yansıtacak şekilde nHDL öküz ölçü olarak sunulur Aşağıdaki denklemi kullanın: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq3.jpg"> Not: Bu yaklaşım diğer kurulan deneysel yaklaşımlar gibi deneysel ölçümler değişkenliği azaltmak için benzer Uluslararası oranı (INR) 44 , 45 normalleştirilmiş. Bu yaklaşım klinik çalışmalar 32 , 33 , 34 , 35 , 36 yılında doğrulandı , 37 , 38 , 39.</li> <li>kalite kontrol deneysel sonuçların standart kalite kontrol örnekleri kullanarak gerçekleştirmek. Her laboratuar kendi kalite denetimleri (QCs) oluşturmanız gerekir. İdeal olarak bir QC bilinen işlevsiz HDL ile bir örnekten nHDLox için ve bir QC için sağlıklı donör [örneğin kullanım havuza alınan örnekten kurulan kan Bankası bağışçılar ve hiçbir bilinen ektanı ve risk faktörleri için genç yetişkin bir örnekten nHDLox olduğunu Kardiyovasküler hastalık] yasaktır dahil olmak üzere. İkinci denetim sonuçları farklı laboratuvarlar arasında standartlaştıran. Ortalama bu QCs kurulan bağlı olarak en az 5 çoğaltır (genellikle 10 çoğaltır bu önemli adım için kullandığımız) değerleridir.
	<ol><li>Onay her tahlil ölçülen QCs olup olmadığını değerleri değer beklenen Aralık içinde. Bir kabul edilebilir en fazla deneysel değişkenliğin % 15 varsayarsak, deneysel ölçülen değerlerin kurulan QC bilinen ortalama değerlerden % 15'lik düşmek gerekir. Aşağıdaki denklemler kullanın: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq4.jpg"> <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq5.jpg"> Not: ya dahil kalite kontrol örnekleri Eğer () normal işlevsiz HDL karşı) HDLox değerleri (her laboratuvar kurulu) beklenen aralığın dışında verir sonra denemeyi tekrarlamak.</li>
	</ol></li> <li>Kalite kontrol deneysel sonuçlar deneysel değişkenlik ölçmek için (CV) varyasyon katsayısı kullanarak gerçekleştirmek: MF % ile tüm örneklerini tekrar &gt; % 15. Aşağıdaki denklemi kullanın: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq6.jpg"> Not: bir tipik Intra-tahlil (içinde aynı plaka) ve (arasında farklı tabak) arası tahlil deneysel değişkenlik &lt; . 2) tipik bir 1-%7 ve CV % 3-10 arasında olduğunu tipik bir interassay içi-tahlil CV olduğunu.</li>
</ol>

Bu iletişim kuralı ve tahlil patent PCT/US2015/018147 için uygundur.

Burada açıklanan protokol HDL işlev ateroskleroz ve insan hastalık rolü ile ilgili önemli araştırma soruları cevaplamak için güçlü bir araç sunar. Tahlil HDL lipid peroksit içeriği HDL-C enzimatik amplifikasyon (HRP) kullanarak mg başına quantifies. Bu yaklaşım kullanılan hücre türleri, okuma rapor türünü, standardizasyon eksikliği ve karıştırıcı etkileri açısından önemli heterojenite dahil olmak üzere önceki HDL işlevi deneyleri (örneğin kolesterol sızma tahlil) bilinen sınırlamaları önler trigliserid7...

Aterosklerotik kardiyovasküler hastalık (CVD) ölüm dünya çapında1,2önde gelen nedenidir. Epidemiyolojik çalışmalar yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) kolesterol seviyesinin düşük genellikle ters ateroskleroz1,2gelişimi için risk ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Çeşitli çalışmalarda HDL1,2için bir atheroprotective rol desteklese de, hangi tarafından HDL başlama ve ilerleme ateroskleroz zayıflar karmaşık 3,4mekanizmadır. Bu nedenle, karmaşık yapısı ve fonksiyonu mutlak düzeyi yerine HDL ateroskleroz 5,6,7,8daha doğru tahmin sürülmüştür. Ateroskleroz gibi inflamatuar Birleşik Devletleri, HDL fonksiyonu zarar HDL protein ve lipit kompozisyon değişiklikler oluşur. Bunlar i) azaltmak onun kolesterol sızma potansiyel 9, II) azaltın anti-enflamatuar ve artış pro-inflamatuar proteinler HDL ilişkili 6,7, III) azalma antioksidan faktör düzeyleri ve etkinlik ve HDL Düşük yoğunluklu Lipoprotein (LDLox)10 ve IV oksidasyonu inhibe yeteneği) lipid hydroperoxide içerik ve Redoks etkinliği (HDLox)9,11artırın. HDL pleotropic işlevleri (örneğin, kolesterol sızma, antioksidan işlevi) çizimle sağlam deneyleri HDL-HDL-C klinikte belirlenmesi tamamlayıcı.
HDL işlevi genellikle kolesterol sızma tahlil8,12,13,14gibi hücre tabanlı yöntemler tarafından değerlendirilir. Bu yöntemi kullanılan hücre türleri, okuma rapor türünü, standardizasyon eksikliği ve trigliserit 7,15karıştırıcı etkileri açısından önemli heterojenite dahil olmak üzere önemli sınırlamaları vardır. Bu sakıncaları zorluklar büyük klinik çalışmalar16için poz. Boş hücre deneyleri HDL işlevi hücre tabanlı deneyleri için kıyasla daha sağlam önlemler verebilir. Kolesterol sızma HDL en önemli işlevlerinden biridir ama hücre tabanlı deneyleri tarafından yalnızca belirlenebilir. Proteomik17,18,19,20,21,22,23gibi HDL işlevini belirlemek için diğer yaklaşımlar 24 ve hücre tabanlı monosit kemotaksisi deneyleri HDL işlevi 17,22,25 değil standardize ve büyük ölçekli insan çalışmalarda kullanılamaz.
HDL önemli antioksidan atheroprotective etkisi5,6,7,8vardır. Antioksidan işlevi HDL, LDL huzurunda önceki hücre ücretsiz Fluorometrik deneyleri 26yılında belirlenmiştir. Biyokimyasal Fluorometrik yöntemlerin HDL antioksidan işlevi başlangıçta Mohamad Navab ve Alan Fogelman ve onların iş arkadaşları26tarafından geliştirilmiştir. Her ne kadar birçok insan çalışmaları-si olmak kullanılmış bu yöntemler HDL işlevi 17,18,19,20,21,22,23 belirlemek için ,24, lipid (HDL)-lipid (LDL) ve lipid fluorochrome etkileşimleri bu hücre ücretsiz enzimatik olmayan biyokimyasal deneyleri HDL işlevi27,28tekrarlanabilirlik sınırlamak.
Son faiz lipidler ve HDL 27,29,30içinde protein oksidasyon sonucu HDL oksidasyon fonksiyonel sonuçları üzerinde odaklanmıştır. Önceki çalışmalar göstermiştir bu oksidasyonunu HDL HDL işlevi 27,29,30bozar. HDL lipid peroksit taşımacılığında önemli bir rolü vardır ve yüksek miktarda lipid peroksitler anormal HDL fonksiyonuyla ilişkilidir. Böylece HDL lipid peroksit içeriği HDL işlevi 9,17,20,31 belirlemek için kullanılan ve HDL işlev7önceki deneyleri bilinen sınırlamaları verilen, 15,27,32, HDL lipid peroksit içeriği (HDLox) 32quantifies alternatif bir Fluorometrik yöntem geliştirdik. Bu yöntem enzim horseradish peroksidaz (HRP) ve fluorochrome (kolesterol oksidaz) HDL-C 32mg başına lipid peroksit içeriği ölçmek Amplex kırmızı temel alır. Tahlil biyokimyasal prensibi şekil 1' de gösterilen. Biz bu floresan dayalı yaklaşım önceki HDL işlevi deneyleri27,28sınırlamaları yok göstermiştir. Bu tahlil edilmiş daha rafine ve böylece büyük ölçüde insan çalışmaları bile cryopreserved plazma 32,33,34, , güvenilir bir şekilde kullanılabilir bizim laboratuarda standart 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. bu tahlil okuma doğrulanmış hücre tabanlı deneyleri, kalp-damar hastalıkları, sistemik inflamasyon, immün disfonksiyon ve ilişkili kardiyovasküler ve metabolik risk fenotipleri vekil önlemler çıktıları ile ilişkilidir 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. burada, HDL lipid peroksit içeriği (HDLox) ölçmek için bu basit ama güçlü yöntemi açıklanmaktadır. Bu tahlil bir aracı insan hastalığında HDL işlevinin rolü ile ilgili önemli araştırma soruları cevaplamak için sistemik inflamasyon, oksidatif stres ve okside lipidler (ateroskleroz gibi) önemli rol32olduğu kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Deneysel Reaktifler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDL PEG (Polietilen Glikol) Çökeltici Reaktif</td><td>Pointe Scientific</td><td>H7511</td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red reaktifi.</td><td>Yaşam Teknolojileri, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Kırmızı Kolesterol Test Kiti. &boğa; &le; &ndash; 20&derece; C ve boğa; Kurutma &boğa; Işıktan</td></tr><tr><td>koruyun DMSO.</td><td>Yaşam Teknolojileri, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Kırmızı Kolesterol Test Kiti. &boğa; &le; &ndash; 20&derece; C ve boğa; Kurutma &boğa; Işıktan koruyun</td></tr><tr><td>At Turpu Peroksidaz (HRP)</td> <td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Kırmızı Kolesterol Test Kiti. & boğa; &le; &ndash; 20&derece; C ve boğa; Kurutma &boğa; Hafif</td></tr><tr><td>Kolesterol Esterazdan koruyunuz.</td><td>Yaşam Teknolojileri, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Kırmızı Kolesterol Test Kiti. &boğa; &le; &ndash; 20&derece; C ve boğa; Kurutma &boğa; Işıktan koruyun</td></tr><tr><td>Kolesterol Referans standardı</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Kırmızı Kolesterol Test Kiti. &boğa; &le; &ndash; 20&derece; C ve boğa; Kurutma &boğa; Işıktan koruyun</td></tr><tr><td>Resorufin floresan Referans standardı</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Kırmızı Kolesterol Test Kiti. &boğa; &le; &ndash; 20&derece; C ve boğa; Kurutma &boğa; Işıktan koruyun</td></tr><tr><td>5x Reaksiyon Tamponu.</td><td>Yaşam Teknolojileri, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Kırmızı Kolesterol Test Kiti. &boğa; &le; &ndash; 20&derece; C ve boğa; Kurutma &boğa; Işıktan koruyun</td></tr><tr><td>HDL Kolesterol Otomatik Reaktif</td><td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, ABD.</td><td>TR39601</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plakalar (polipropilen, düz dipli, şeffaf).</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0687</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plakalar (polipropilen, düz tabanlı, siyah).</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9936</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf tüpleri</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>ClipTip 200, steril</td><td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, ABD.</td><td>14-488-058</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Çok Kanallı Pipetler, 8 kanallı, 125&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, ABD.</td><td>&nbsp; 14-387 - 955</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > İsim</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 2.01 yazılım</td><td>Biotek, Vermont, ABD</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td> Şirket</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 Plaka okuyucu</td><td>Biotek, Vermont, ABD</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

boş hücre biyokimyasal fluorometrik enzimatik tahlil yüksek yoğunluklu lipoprotein lipid peroksidasyon yüksek üretilen iş ölçümü için

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Düşük yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL-C) kolesterolü aterosklerotik kardiyovasküler hastalık (CVD) en güçlü bağımsız negatif belirleyicileri bulunmaktadır. Yapısı ve fonksiyonu HDL-C yerine HDL daha doğru ateroskleroz tahmin. Ateroskleroz gibi inflamatuar Birleşik Devletleri, HDL fonksiyonu zarar HDL protein ve lipit kompozisyon değişiklikler oluşur. HDL işlevi genellikle deneyleri kolesterol sızma tahlil ama bu deneyleri gibi sayısız sakıncaları standardizasyon eksikliği var dayalı hücre tarafından belirlenir. Boş hücre deneyleri HDL işlevi hücre tabanlı deneyleri için kıyasla daha sağlam önlemler verebilir. HDL oksidasyon HDL işlevini bozar. HDL lipid peroksit taşımacılığında önemli bir rolü vardır ve yüksek miktarda lipid peroksitler anormal HDL fonksiyonuyla ilişkilidir. Lipid-sonda etkileşim ne zaman enzimatik olmayan floresan Spektrometre sonuçlarını yorumlama lipid oksidatif devlet ölçmek için deneyleri düşünülmelidir. Bu bize HDL disfonksiyon katkıda bulunan HDL lipid peroksit içeriği (HDLox) değerlendirmek için bir boş hücre biyokimyasal enzimatik yöntem geliştirmek için motive. Bu yöntem enzim horseradish peroksidaz (HRP) ve fluorochrome (kolesterol oksidaz) HDL-c mg başına lipid peroksit içeriği ölçmek Amplex kırmızı dayanır Burada bir iletişim kuralı fluorochrome reaktif kullanarak HDL-lipid peroksidasyon belirlenmesi describedfor. Tahlil değişkenlik deneysel koşullar sıkı Standartlar Kuruluşu tarafından azaltılabilir. Daha yüksek HDLox düşük HDL antioksidan işlevi ile ilişkili değerlerdir. Bu testin okuma doğrulanmış hücre tabanlı deneyleri, kalp-damar hastalıkları, sistemik inflamasyon, immün disfonksiyon ve ilişkili kardiyovasküler ve metabolik risk fenotipleri vekil önlemler çıktıları ile ilişkilidir. Bu teknik yaklaşım HDL işlevi insan hastalığında sistemik inflamasyon, oksidatif stres ve okside lipidler (ateroskleroz gibi) önemli bir rol olduğu değerlendirmek için sağlam bir yöntemdir.

Her HDL örneğinin 50 µL adım 7,3 olduğu gibi her kuyuya eklenir. 50 µL HRP çözüm 5 U/mL (0.25 U) sonra adım 7.5 olduğu gibi her kuyuya ekledi. Örnekleri adım 7,6 olarak 37 ° C'de 30 dakika inkübe. Fluorochrome reaktif 50 µL sonra adım 7,7 (300 µM son konsantrasyonu) olduğu gibi her kuyuya eklenir. (Karanlıkta) floresan okuma sonra her dakika bir floresan plaka okuyucu (530/590 nm filtreleri) ile 37 ° C'de 120 dakika içinde değerlendirilir. Boş, havuza alınan denetim temsilcisi Floresans v...

Biz burada bir Fluorometrik boş hücre biyokimyasal tahlil HDL-lipid peroksidasyon belirlenmesi için tarif. Bu hızlı ve tekrarlanabilir tahlil anlayışımız HDL fonksiyonunu kullanabilirsiniz insan hastalık katkıda bulunabilir ve büyük ölçekli çalışmalarda HDL işlevini belirlemek için kullanılabilir.

Boş hücre biyokimyasal Fluorometrik enzimatik tahlil yüksek yoğunluklu Lipoprotein Lipid peroksidasyon yüksek üretilen iş ölçümü için

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Bu deneysel yöntemin genel amacı, belirli bir HDL miktarının lipid peroksit içeriğini ölçen biyokimyasal hücresiz bir test kullanarak yüksek yoğunluklu lipoproteinin işlevini belirlemektir. Bu yöntem, kardiyovasküler hastalık metabolik anormalliklerinde HDL fonksiyonunun rolü gibi tıbbın çeşitli alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, HDL fonksiyonunu güvenilir bir şekilde belirlemek için kullanılabilen hücresiz bir biyokimyasal yöntem olmasıdır.Bu yöntem, kardiyovasküler hastalık ve metabolik anormalliklerde HDL fonksiyonunun rolü hakkında fikir verebilse de, enflamatuar hastalıklar gibi diğer hastalık çalışmalarına da uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi uygun kontroller, numuneler ve kopyalar dahil olmak üzere 96 oyuklu plaka için çalışma düzenini hazırlayın. Numune ve replikasyon sayısına bağlı olarak ihtiyaç duyulan reaktif hacmini hesaplayın.Kalıcı bir işaretleyici kullanarak, testteki her adım için tüpleri etiketleyin. Ardından, havuzlanmış bir kontrol örneği oluşturmak için her numuneden 10 mikrolitreyi birleştirin. HDL-C değerini belirlemek için klinik laboratuvar için ikinci bir havuzlanmış kontrol örneği oluşturun.Büyük bir HDL stoğu hazırladıktan sonra, donma çözülme döngülerini en aza indirmek için birkaç alikotu kriyo-koruyun. Havuzlanmış bir kalite kontrolü oluşturmak için en az 10 farklı kopyayı bir araya getirin. Ardından, metin protokolünde belirtildiği gibi HDLox'ın ortalama değerini belirleyin.HDL-C değerini belirlemek için klinik laboratuvar için ikinci bir havuzlanmış kalite kontrol oluşturun. Başlamak için taze bir plazma veya serum örneğini çözün. Eşit hacimlerde plazma ve HDL kolesterol çökeltici reaktifi karıştırın.İyice karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. 10 dakika boyunca 1000 ila 2000 kez G arasında bir hızda santrifüjleyin. Bundan sonra, süpernatanı aspire edin.İzole edilmiş HDL'yi, florokrom HDL fonksiyon testini gerçekleştirmeye hazır olana kadar dört santigrat derecede saklayın. HDLox'u normalleştirmek için klinik laboratuvarın HDL-C değeri kullanılıyorsa, metin protokolünde belirtildiği gibi plazmadan HDL-C'yi ölçün. Başlamak için, kolesterol ve HRP'yi karıştırın, böylece hazırlanan çözeltiler mililitre HRP başına beş birim içerir.Bir şişe florokrom reaktifi ve bir şişe DMSO'yu oda sıcaklığına çözün. Çözüldükten sonra, bir miligram florokrom reaktifini 200 mikrolitre DMSO'da çözün. Bu çözeltiyi ışıktan korunurken eksi 20 santigrat derecenin altındaki bir sıcaklıkta saklayın.Ardından, negatif kontrol olarak numune plakasına 50 mikrolitre 1X reaksiyon tamponu ekleyin. Pozitif kontrol olarak 50 mikrolitre 20 milimolar hidrojen peroksit çalışma çözeltisi ekleyin. Bundan sonra, hazırlık plakası olarak kullanılmak üzere taze yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plaka yerleştirin.Bu hazırlık plakasının her bir oyuğuna 200 mikrolitre izole HDL ekleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, metin protokolünde belirtildiği gibi, 50 mikrolitre HDL'yi hazırlama plakasından deney plakalarına, deney plakalarının sayısı tahlildeki kopya sayısına eşit olacak şekilde aktarın. Bundan sonra, her bir kuyucuğa 50 mikrolitre hazırlanmış HRP çözeltisi ekleyin.37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin, ardından oyuk başına toplam 150 mikrolitre hacim için her oyuğa 50 mikrolitre florokrom reaktifi ekleyin. İyice karıştırın ve ışıktan koruyun. Bir floresan plaka okuyucu kullanarak, floresan okumasını 37 santigrat derecede, karanlıkta, 120 dakika boyunca her dakika değerlendirin.Uygun yazılımı kullanarak verileri kaydedin, ardından metin protokolünde belirtildiği gibi floresan birimlerinin ortalama değerini hesaplayın. Bu çalışmada, miligram HDL-C başına HDL lipid peroksit içeriğini ölçmek için hücresiz bir biyokimyasal florometrik test geliştirilmiştir. Bu, HRP kullanılarak enzimatik amplifikasyon ile gerçekleştirilir.Daha sonra karanlıkta floresansı 120 dakika boyunca her dakika ölçmek için bir floresan plaka okuyucu kullanılır. Disfonksiyonel HDL'ye sahip olduğu bilinen bir hasta için temsili veriler, havuzlanmış kontrolle karşılaştırıldığında burada gösterilmektedir. Disfonksiyonel HDL'nin, sağlıklı katılımcılardan toplanan HDL'de görülenlerden iki kat daha yüksek lipid peroksit seviyelerine sahip olduğu görülmektedir.Daha sonra, HDL izole edilir ve 50 sağlıklı denekte ve 100 HIV ile enfekte hastada HDLox belirlenir. HIV ile enfekte hastaların, sağlıklı bireylere göre miligram HDL-C başına ortalama %60 daha yüksek HDL peroksit içeriğine sahip olduğu görülmektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa altı saatin altında yapılabilir.Bu prosedürü denerken, tüm reaktifleri ve kontrolleri önceden hazırlamayı, tutarlı, kesin olmayı ve her deney plakasına her zaman uygun deneysel kontrolü dahil etmeyi unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, HDL'yi nasıl izole edeceğinizi, belirli bir HDL miktarının lipid peroksit içeriğini nasıl belirleyeceğinizi ve HDL işlevimizi nasıl kullanımdan kaldıracağınızı iyi anlamış olmalısınız. Biyolojik örneklerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

cell-free-biochemical-fluorometric-enzymatic-assay-for-high

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

De novo lipogenez ve β-yağ asidi oksidasyon hepatosit kilit metabolik, yağlı karaciğer hastalığı da dahil olmak üzere birçok metabolik bozukluklar, içinde tedirgin olan yollar oluşturmaktadır. Burada fare primer hepatositlerin izolasyonu göstermek ve β-yağ asidi oksidasyon ve lipogenez ölçümü açıklar.

Fare İlköğretim Hepatositlerde Yağ Asidi Oksidasyon ve lipogenez Belirlenmesi

Opsin ile sulandırılmış büyük unilameller lipozomlarda fosfolipid karıştırmayı ölçmek için floresan bazlı bir test tarif ediyoruz.

Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

Bu iletişim kuralı görüntüleme sistemi içinde çeşitli hücre tiplerinin bir canlı hücre kullanarak gerçek zamanlı akını oranları ile LDL kolesterol alımını ölçme verimli bir yaklaşım sağlar. Bu teknik Farmakolojik aktivite LDL akını hücre morfolojisi ve dolayısıyla potansiyel sitotoksisite izleme sırasında etkileyen bileşiklerin ekran için bir platform sağlar.

LDL kolesterol alımını tahlil canlı hücre analizi ile hücre Imaging kullanarak sistem durumu izleme

Tüp bebek kolesterol sızma kapasitesi serum veya plazma makrofaj hücre modelleri için gelecek vaat eden bir araç olarak bir biyomarker ateroskleroz için ölçümdür. Bu da çalışmanın, biz optimize etmek ve bir floresan NBD-kolesterol sızma yöntemi standartlaştırmak ve 96-şey plakaları kullanarak yüksek üretilen iş çözümlemesi geliştir.

Yüksek işlem hacmi Nitrobenzoxadiazole etiketli kolesterol sızma tahlil

Burada, lipoprotein parçacıklarının yerel Micro-RNA içeriğinin (mutlak/göreceli) belirlenmesi için nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyon tabanlı protokol sunulur. Buna ek olarak, Mikro-RNA seviyesini artırmak için bir yöntem, hem de lipoprotein parçacıkları hücresel alımını oranını belirlemek için bir yöntem gösterilmiştir.

MicroRNA ile yerli lipoprotein parçacıkları zenginleştirme ve onların mutlak/bağıl microRNA Içerik ve onların hücresel transfer hızı sonraki belirlenmesi

Burada, diyasilgliseril peptid ve alkin-fosfolipitleri klik-kimyası ile substrat olarak kullanarak apolipoprotein N-asiltransferaz aktivitesini izlemek için hassas bir floresan testi sunulmaktadır.

Enzim Karakterizasyonundan Yüksek Verimli Taramaya Kadar Apolipoprotein N-asiltransferaz için Click-Kimya Tabanlı Florometrik Analiz

Burada, bir proteinin fosfatidiylserine veya fosfatidiliinositol 4-fosfat in vitro'yuayıklayıp taşımadığını belirlemek için floresan lipid sensörleri ve lipozomlar kullanarak protokolleri açıklıyoruz.

Membranlar Arasında Fosfataylserine/Fosfatidiylinositol 4-Fosfat Değişiminin Floresan Bazlı Ölçümleri

Gözün retina pigment epitel tabakasını etkileyen dejeneratif göz hastalıkları monogenik ve poligenik kökenlidir. Çeşitli hastalık modelleri ve bir yazılım uygulaması olan LipidUNet, hastalık mekanizmalarını ve potansiyel terapötik müdahaleleri incelemek için geliştirilmiştir.

LipidUNet-Machine Learning Tabanlı iPSC Kaynaklı Retinal Pigment Epiteli Kullanılarak Lipid Birikintilerinin Karakterizasyonu ve Nicelleştirilmesi Yöntemi

Plazma zarının lipitleri ile eksojen lipitler arasındaki değişime aracılık etmek için siklodekstrin kullanmak için bir yöntem tarif ediyoruz. Bu teknik, lipid sal benzeri ortamlarda, sal benzeri olmayan ortamlarda olduğundan farklı davranan transmembran proteinleri inceleyen deneylerle eşleştirilebilir.

Canlı Hücrelerde Lipid Değişim Testi

Bu protokol, uzun zincirli ve çok uzun zincirli doymuş yağ asitlerinin BODIPY-C12 ve BODIPY-C16 floresan analogları ile stimülasyon üzerine endotel hücrelerinde hücresel lipid alımını ölçmek için bir in vitro testi detaylandırır. Bu yöntem verimlidir ve diğer hücre tiplerine uyarlanabilir ve lipid metabolizmasını incelemek için yararlı bir yaklaşım sunar.

Floresan Yağ Asidi Analogları Kullanılarak Endotelyal Yağ Asidi Alımının Miktar Tayini

Burada, tüm insan plazmasında veya serumunda bulunan yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) tarafından lipid donör partiküllerinden spesifik olarak uzaklaştırılan floresan fosfolipid miktarını ölçmek için protokolleri açıklıyoruz. HDL işlevselliğinin bu metriğinin, kardiyovasküler hastalık olayını öngördüğünü gösterdik.

Yüksek Yoğunluklu Lipoproteine Özgü Fosfolipid Akış Testi

Öğrenin, HDL fonksiyonunu belirlemek için hücre dışı biyokimyasal florometrik enzimatik analiz yöntemini. Bu yöntem, kardiyovasküler hastalıklarda HDL lipid peroksidasyonunu ölçerek metabolik bozuklukların araştırılmasına yardımcı olur.

Boş hücre biyokimyasal Fluorometrik enzimatik tahlil yüksek yoğunluklu Lipoprotein Lipid peroksidasyon yüksek üretilen iş ölçümü için (Video) | JoVE Journal

Boş hücre biyokimyasal Fluorometrik enzimatik tahlil yüksek yoğunluklu Lipoprotein Lipid peroksidasyon yüksek üretilen iş ölçümü için

Daha fazla video keşfet