Name: Fonksiyonel analiz bağırsak kök ve niş hücre Organoid sulandırma tahlil (ORA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Öğrenin bağırsak kök ve niş hücrelerinin fonksiyonel analizi için Organoid Yeniden Oluşturma Tahlili. Bu yöntem Lgr5+ ve Paneth hücrelerini ayırarak hücre tipine özgü genetik ve biyokimyasal modifikasyonlara olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada Hollanda Kanser Derneği (KWF; fon tarafından mümkün yapıldı EMCR 2012-5473) ve dünya kanser araştırma fonları International (WCRF; Proje No 2014-1181)

Tüm yordamları yerel hayvan refah kanun ve kurallara göre yapıldı.
1. hazırlanması aletleri, kültür medya ve yemekleri
<ol><li>Otoklav 1 dizi bağırsak makas, normal makas ve forseps steril bir kap içinde.</li>
	<li>Bir kuluçka 37 ° C'de bir 96-iyi (düz dipli) tabak yerleştirin</li>
	<li>10 mL tam kültür ortamının malzemeleri tabloda listelenen reaktifleri ile hazır olun.</li>
	<li>Bir su banyosu içinde 37 ° C'de tam orta kuluçkaya.</li>
	<li>Tezcan bir buz kovası yerleştirerek membran Claudia adıyla yeniden düzenlendi. Sulandırılan membran 4 ° C'de sıvı hale gelir.</li>
	<li>4 Petri yemekler soğuk fosfat tamponlu tuz veya kısaltılmış PBS (4 ° C) doldurun.</li>
</ol>2. izolasyon küçük bağırsak kriptalarının
<ol><li>CO2 inhalasyon tarafından Lgr5- eGFP-DDE'ler-CreERt2 fare C57BL6/J arka plan üzerinde kurban. Karın zarını boyuna makas çifti ile incelemek.</li>
	<li>Mide Forseps ile tutun ve transversally ikiye kesilmiş.</li>
	<li>Şu andan itibaren bağırsak makas kullanırken, bağırsak çekin ve PBS içeren bir kabında yerleştirin. Not: Bağırsak makas keskin bir ve künt bir ipucu var. Bu makas künt ucu crypt-villus mimari bağırsak açılırken zarar vermemesi gerekiyordu.</li>
	<li>Künt ipucu mide yerleştirerek başlayın ve yavaşça mide itin. Makas ile kesme ve Forseps ile çekerek devam edin.</li>
	<li>Bir kez tüm ince bağırsak boyuna açıldı, soğuk PBS Forseps ile tutarak yıkayın ve yavaşça U şeklindeki hareketleri ile PBS çözümde durulayın.</li>
	<li>Bir kez tüm dışkı artıkları temizlenir, bağırsak luminal tarafı yukarı bir kesme tahtası üzerinde dümdüz devam edin. Kan damarları yokluğu ve dış kısmı ile karşılaştırıldığında soluk görünümü tarafından kolayca tanınabilir luminal takımıdır.</li>
	<li>Bir cam slayt ile düzleştirilmiş bağırsak kazıma villus yavaşça çıkarın. İki kez dokunun tüm uzunluğu boyunca bu adımı gerçekleştirin.</li>
	<li>Bağırsağın bir steril cerrahi bıçak ile 2-5 mm parçalar halinde kesin.</li>
	<li>Küçük bağırsak parçaları buz soğuk PBS 10 mL içeren bir 50 mL tüp içinde yerleştirin.</li>
	<li>Onları yukarı ve aşağı içinde PBS pipetting tarafından kalan herhangi bir yabancı maddelerin kaldırılması doku parçaları, temiz. Süpernatant atın ve PBS tamamen temizlenene kadar bu adımı yineleyin.</li>
	<li>15 mL soğuk PBS PBS son hacmi 25 mL getirmek için ekleyin. 2 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) eklemek ve bir silindir 4 ° C'de 45 dk için kuluçkaya</li>
	<li>PBS/EDTA atmak.</li>
	<li>PBS 10 mL ekleyin ve doku parçaları yukarı ve aşağı (en az üç kez) pipetting sert tarafından kriptalarının ayır. Süpernatant toplamak.</li>
	<li>Adımı yineleyin 2,13 dört kez. Kültür son hacmi 50 mL ulaşmak için orta ekleyin.</li>
	<li>Santrifüjü (5 min için 300 x g) tarafından hücreleri cips.</li>
	<li>Pelet 10 mL kültür orta resuspend ve aralıklarla (3 dk 80 x g) tarafından kriptalarının cips.</li>
</ol>3. tek hücre hazırlık
<ol><li>Süpernatant pelleted kriptalarının atın ve onları 1 mL tripsin benzeri-enzimler ile birlikte 50 µL resuspend Dnaz (50 µg/mL).</li>
	<li>Bir su banyosu için 2 dk 32 ° C'de hücrelerde kuluçkaya.</li>
	<li>Kültür orta 10 mL ekleyin. Kriptalarının sert yukarı ve aşağı en az 5 kez pipetting tarafından tek hücrelere ayırmak.</li>
	<li>Çözüm (kümeleri ve diğer yabancı maddelerin ortadan kaldırmak için) 40 µm süzgeç aracılığıyla filtre ve 300 x g 5 min için de tek hücre.</li>
</ol>4. Akış Sitometresi ve kaplama
<ol><li>50 mL 1 x Hank tamponlu tuz solüsyonu veya HBSS/2% fetal inek serum (FCS) çözüm hazırlamak ve Pelet her 106 hücreler için 1 ml resuspend</li>
	<li>Hücre süspansiyon BV421 Lin- (CD31, CD45, TER119), 1: 100 ve CD24 APC ve CD117-PE her iki konsantrasyon için 30 dk 1:250 antikorların bir konsantrasyon, ekleyin.</li>
	<li>Sıralama Lgr5+ kök hücre ve ayrı düşük Paneth hücreleri bağlamak tüpler. İletişim kuralları için sıralama hakkında ayrıntılı bilgi için Lgr5+ ve Paneth hücreleri, lütfen bakın Roth vd. 7 ve Schewe vd. 6<ol>
<li>300 x g 5 dakika süreyle de sıralanmış hücreleri 1.3 olduğu gibi açıklanan bileşenleri ile 100 µL orta hücrelerde Resuspend santrifüj ( Tablo reçetesigörmek).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Paneth hücreleri (örneğin, kimyasal ve genetik modifikasyonu ile) tedavi (n = 2000) veya Lgr5+ kök hücre (n = 2000).<ol>
<li>Hücreleri tedavi için toplam hacmi 100 µL kültür orta ve küçük müdahale RNA (siRNA) 100 bir konsantrasyon, lipozom aracılı transfection reaktif 5 µL kullanın nM. 37 ° C'de siRNA için veya seçilen değiştirilmesi için gerekli süre 30 dk için kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>500 µL kültür orta iki kez hücrelerde yıkayın.</li>
	<li>300 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve 10 µL kültür orta hücrelerde resuspend.</li>
	<li>İki hücresel bileşenleri havuz (Paneth veya Lgr5+ hücreleri) 20 µl Toplam hacim ve RT., 5 min için 300 x g, santrifüj</li>
	<li>Paneth co kuluçkaya ve RT., 10 dk Lgr5+ hücreleri</li>
	<li>10 µL süpernatant, kaldırmak ve bir Menisküs sıvı emin olmak için hücre Pelet Aspire edin değil bırakın.</li>
	<li>Toplam hacmi 40 µL için hücreleri Sulandırılan membran 30 µL eklemek, hücreleri resuspend ve Önceden ısıtılmış bir 96 iyi tabak içinde plakası. 10 dakika sonra tam orta 200 µL ekleyin ( Tablo reçetesigörmek). Değişim orta her 48 h.</li>
	<li>Organoid çeşitlilik gün 5 say.</li>
</ol>

<ol><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li>
<li>Cantrell, M. A., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+modeling+for+cancer+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Organoid modeling for cancer precision medicine.</a> Genome Med. 7, 32(2015).</li>
<li>Schewe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+Phospholipases+A2+Are+Intestinal+Stem+Cell+Niche+Factors+with+Distinct+Roles+in+Homeostasis%2C+Inflammation%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer.</a> Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).</li>
<li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+in+intestinal+homeostasis+and+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury.</a> PLoS One. 7, e38965(2012).</li>
<li>Rodriguez-Colman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+metabolic+identities+in+the+intestinal+crypt+supports+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function.</a> Nature. 543, 424-427 (2017).</li>
<li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apc+Restoration+Promotes+Cellular+Differentiation+and+Reestablishes+Crypt+Homeostasis+in+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer.</a> Cell. 161, 1539-1552 (2015).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li>
<li>Igarashi, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+and+SIRT1+Cooperate+to+Foster+Expansion+of+Gut+Adult+Stem+Cells+during+Calorie+Restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction.</a> Cell. , 436-450 (2016).</li>
</ol>

Hiçbir rakip finansal faiz veya diğer çatışmaları yazarlar var

ORA iki temel bileşenleri bağırsak kök hücre niş, yani Lgr5+ ve Paneth hücreleri rafine fonksiyonel analiz sağlar. Bu yaklaşım daha önce bize ve diğerleri tarafından hafif değişiklikler6,10,11ile istihdam edilmiştir. Burada, ORA yordamı bir tekrarlanabilir ve standart laboratuvar iletişim kuralı olarak mevcut. Ayrıca, biz Lgr5+ kök hücre, Apc downregülasyon etkileri genetik uygula...

Bağırsak epitel memeli vücuttaki en hızlı kendini yenileyerek doku ve, bu nedenle, nesne kimliği ve Türbenin alt kısmında bulunan yetişkin kök hücrelerin fonksiyonel karakterizasyonu yönelik çalışmalar bir bolluk olmuştur Lieberkühn, ifade Lgr5 gen tarafından ayrılmış ve kurallı Wnt sinyal1bağımlı. Özellikle Lgr5+ kök hücre çevrili ve özel niş hücreleri, Yani da kendi olgunlaşma2için Wnt sinyal üzerinde bağlıdır Paneth hücreleri tarafından desteklenen. Birlikte, bu iki hücre tipleri öz-yenileme bağırsak epitel astar altında yatan ve günlük homeostatik denge korumak: Lgr5+ kök hücre hızla Böl ve yaratıcı için ortaya çıkmasına ve daha fazla bağırsak İhtisas epitel hücreleri; Paneth hücreleri sağlamak temel niş faktörler (örneğin, Dll1, Wnt3, EGF) için Lgr5+ kök hücreleri2. Kapasite organize ve kendini yenileyerek yapıları oluşturmak için kaplama ex vivo organoids veya "mini-cesaret", çağrıldığında bağırsak kriptalarının kendini yenileme gibi süreçleri içgörü sağlamak için deneysel bir araç olarak kullanan ve farklılaşma kanser4de dahil olmak üzere normal ve patolojik koşullarda. Organoid kültürlerden gelen çeşitli dokular, bağırsak, pankreas, karaciğer ve böbrek, fare ve insan örnekleri4de dahil olmak üzere kurulmuştur. Çıkarma yöntemi ve bu organoid kültürler geliştirmek için istihdam büyüme faktörleri doku özgü ve çoklu soy farklılaşma sürücü ve mümkün olduğunca özgün kök hücre niş taklit etmek için tasarlanmış içinde vivo. Organoids genetik hastalıklar tedavi, kanser tedavi edici etkinliği, ilaç toksisitesi analizi veya organogenesis vitro5çalışmanın değerlendirilmesi de dahil olmak üzere potansiyel uygulamalar olabilir.
Genel olarak, doku örnekleri kuruldu organoid kültürlerin ana sınırlama hücre-özgüllük olmaması. Örneğin, tüm bağırsak kriptalarının kurulan bağırsak organoids içinde doku kaynağı kapsıyordu hücresel bileşenleri tek tek analiz izin verme (örneğin, tüm kriptalarının içeren Lgr5+, Paneth, ve progenitör hücre).
Burada, ORA anılacaktır ve bağırsak organoid kültürler avantajlarını en temel bileşenleri, yani kök (Lgr5+) ve niş (Paneth) hücrelerin fonksiyonel analiz ile birleştiren yeni bir yöntem, açıklayın. Bu Paneth benzersiz yeteneği elde edilir ve fiziksel olarak ortak inkübe ve organoids2,6,10' a ortaya çıkmasına birbirleri ile ilişkilendirmek için Lgr5+ hücreleri. Biz bu özelliğin avantajlarından aldı ve iki hücre türleri tek tek izin vermeden önce onları organoids reconstitute önceden tedavi. Bunu yaparken, her hücre bileşeni herhangi bir verilen ilaç, büyüme faktörü, biyokimyasal inhibitörü, genetik modifikasyon veya önce sulandırma ve organoid oluşumu kimyasal işleme maruz kalabilirler. Bu nedenle, ORA tahlil kullanarak bir özel uyuşturucu tedavi veya genetik değişiklik kök hücre veya onların niş karşılığı belirli bir etkiye sahip olup olmadığını belirler belirlenmesi sağlayacaktır.

<table><tbody><tr><td>Gelişmiş DMEM F12 *</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax *</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Son konsantrasyon: 10 mM</td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin *</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Son konsantrasyon:% 1</td></tr> <tr><td>Hepes *</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td>Son konsantrasyon: 10 mM</td></tr><tr><td>Rekombinant murin EGF *</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PMG8041</td><td>Nihai konsantrasyon: 50 ng / ml</td></tr><tr><td>Rekombinant murin Noggin *</td> <td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Nihai konsantrasyon: 100 ng / ml</td></tr><tr><td>y27632 *</td> <td>Sigma</td><td>Y0503</td><td>Nihai konsantrasyon: 10 & mikro; M</td></tr><tr><td>Pürüzlü-1 *</td> <td>Anaspec Bio</td><td>AS-61298</td><td>Nihai konsantrasyon: 1 & mikro; M</td></tr><tr><td>Rekombinant murin R-spondin *</td><td>R& D sistemleri</td><td>3474-RS-050</td><td>Nihai konsantrasyon: 1 mg / ml</td></tr><tr><td>Flexitube Gen çözeltisi siRNA APC</td><td>Qiagen</td><td>GS11789</td><td>Nihai konsantrasyon: 100 nM</td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>CD24 APC</td><td>Biolegend</td><td>101814</td><td></td></tr><tr><td>c-kit PE</td><td>Biolegend</td><td>105808</td><td></td></tr><tr><td>BV 421 CD31</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>102424</tr><tr><td>BV 421 CD45</td><td>Biolegend</td><td>103134</td><td></td></tr><tr><td>BV421 TER119</td><td>Biolegend</td><td>116234</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>B6.129P2-Lgr5tm1 (cre / ERT2) CLE / J</td><td>Jackson Laboratuvarları</td><td>008875</td><td></td></tr><tr><td>Düşük bağlayıcı tüpler</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>* Bu reaktiflerin kombinasyonu tam kültür ortamını</td><td></td><td></td><td></td> oluşturur</tr></tbody></table>

fonksiyonel analiz bağırsak kök ve niş hücre organoid sulandırma tahlil (ora)

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Bağırsak epiteli tarafından son derece hızlı devir hızı ile karakterizedir. Memelilerde, 4-5 gün içinde tüm epitel astar yenilenir. Yetişkin bağırsak kök hücre Lieberkühn kriptalarının alt kısmında bulunan, Lgr5 gen ifade tarafından ayrılmış bulunmaktadır ve ile onların karakteristik yüksek proliferatif oranı1homeostazı korumak. İnce bağırsak boyunca Lgr5+ kök hücre Paneth hücreleri denilen özel salgı hücreleri ile iç içe. Paneth hücreleri antibakteriyel bileşikler (Yani, lizozim ve cryptdins/defensins) salgılar ve bağırsak florasının denetleme rolünü uygulamayın. Son zamanlarda, yeni bir işlev Paneth hücreleri, yani kendi kapasitesi Wnt3, EGF ve Dll12olarak birkaç anahtar ligandlar ile Lgr5+ kök hücreleri için niş destek sağlamak için keşfetti.
Ne zaman ex vivo izole ve belirli büyüme faktörleri ve hücre dışı matriks bileşenlerinin huzurunda kültürlü, tüm bağırsak kriptalarının için uzun ömürlü ortaya çıkmasına ve 3D yapılar kendini sürekli yenileyen denilen son derece crypt villus benzer organoids 3yetişkin ince bağırsak epitel mimarisi. Organoid kültürler, tüm kriptalarının kurulan zaman bireysel bileşenleri, yani Lgr5+ katkısı olsa adresleme olmadan kendini yenileme, çalışma ve bağırsak kök hücre niş farklılaşma izin ve Paneth hücreleri.
Burada, biz Paneth yeteneği yararlanır organoid tahlil için yeni bir yaklaşım tarif ve Lgr5+ hücreleri ilişkilendirmek ve organoids oluşturmak için zaman ortak kültürlü. Burada "organoid sulandırma tahlil" olarak adlandırılan bu yaklaşım (ORA), Paneth genetik ve biyokimyasal modifikasyonu sağlar veya Lgr5+ organoids sulandırma tarafından takip, kök hücre. Bu nedenle, iki ana bileşen bağırsak kök hücre niş fonksiyonel analiz sağlar.

Organoid sulandırma tahlil küçük müdahale RNA Apc gen tarafından (siRNA) aşağıda gösterildiği bağırsak epitel temel niş ve kök hücre bileşenlerinin ayrı fonksiyonel analiz sağlar.
Bu amaca ulaşmak için ilk floresan aktif hücre (FACS) 8000 Lgr5+ hücreleri ve 6000 Paneth hücreleri doğuştan C57BL6/J fareler ayırmak için sıralama kullanılmıştır. Şekil 1a', bir akış ORA testi...

Bağırsak organoid kültürler tüm kriptalarının kurulur ve kendini yenileme ve farklılaşma analizi bir hücre özgü biçimde izin vermez. Bu iletişim kuralı sulandırma sıralanmış kök (Lgr5+) açıklar ve neden olmaktadır organoids için onların önceki biyokimyasal ve genetik modifikasyon ve fonksiyonel analiz etkinleştirilirken (Paneth) hücreleri niş.

Fonksiyonel analiz bağırsak kök ve niş hücre Organoid sulandırma tahlil (ORA)

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

Organoid sulandırma testinin genel amacı, Paneth hücrelerinde pozitif olan bağırsak kök hücre nişi Lgr5'in iki ana bileşeninin genetik veya biyokimyasal modifikasyonları yoluyla fonksiyonel analizi ve ardından kendi kendini yenileyen organoidlere yeniden yapılandırılmasıdır. Bu yöntem, kök ve niş hücrelerde genetik veya biyokimyasal modifikasyon gibi bağırsak kök hücre alanındaki temel spesifik soruların ele alınmasına izin verir. Bu tekniğin ana avantajı, tüm kriptleri kullanan diğer tahlillerin aksine, sıralanmış kök ve niş hücreleri kullanması ve böylece hücre tipine özgü analize izin vermesidir.Bu yöntemin video gösterimi, özellikle doku ayrışması ve hücre işleme adımları söz konusu olduğunda kritik öneme sahiptir. Düzgün bir şekilde yürütülmezse, bu adımlar, özellikle gerçek sıralamadan sonra zayıf hücre canlılığına yol açacaktır. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi malzemelerin hazırlanması ve bir C57BL/6J arka plan üzerinde bir Lgr5 farenin feda edilmesiyle başlayın.Peritonu bir makasla uzunlamasına inceleyin. Mideyi forseps ile tutun ve bu noktadan itibaren bağırsak makası kullanarak enlemesine ikiye kesin. Bağırsağı dışarı çekin ve PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin.Künt ucu mideye yerleştirerek başlayın ve nazikçe pilordan itin. Makasla keserek ve forseps ile çekerek ilerleyin. İnce bağırsağın tamamı uzunlamasına açıldıktan sonra, forseps ile tutarak soğuk PBS'de yıkayın ve PBS solüsyonunda U şeklinde hareketlerle nazikçe durulayın.Tüm dışkı kalıntıları temizlendikten sonra, bağırsağı lümen tarafı yukarı bakacak şekilde bir kesme tahtası üzerinde düzleştirmeye devam edin. Lümen tarafı, kan damarlarının olmaması ve dış kısım ile karşılaştırıldığında solgun görünümü ile kolayca tanınabilir. Bir cam slaytla, düzleştirilmiş bağırsağı kazıyarak villusları nazikçe çıkarın.Adımı dokunun tüm uzunluğu boyunca iki kez gerçekleştirin. Ardından, ince bağırsağı steril bir cerrahi bıçakla iki ila beş milimetrelik parçalar halinde kesin. İnce bağırsak parçalarını 10 mililitre buz gibi soğuk PBS içeren 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.Doku parçalarını temizleyin, kalan kirleri PBS'de yukarı ve aşağı pipetleyerek çıkarın. Süpernatanı atın ve PBS tamamen temizlenene kadar adımı tekrarlayın. Daha sonra, PBS'nin toplam nihai hacmini 25 mililitreye getirmek için 15 mililitre soğuk PBS ekleyin.İki milimolar EDTA ekleyin ve dört santigrat derecede bir silindir üzerinde 45 dakika inkübe edin. PBS EDTA'yı attıktan sonra, 10 mililitre PBS ekleyin ve doku parçalarını sert bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleyerek kriptleri ayırın. Ardından, süpernatanı toplayın.Bu adımı dört kez tekrarlayın. 50 mililitrelik bir nihai hacme ulaşmak için kültür ortamı ekleyin. Hücreleri santrifüjleme ile peletleyin.En sonunda, kriptleri santrifüjleme ile peletlemeden önce peleti 10 mililitre kültür ortamında yeniden süspanse edin. Tek hücreli hazırlık için, önce peletlenmiş kriptlerin süpernatantını atın ve bunları 50 mikrolitre DNaz ile birlikte bir mililitre tripsin benzeri enzimler içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri iki dakika boyunca 32 santigrat derecede bir su banyosunda inkübe edin.10 mililitre kültür ortamı ekledikten sonra, en az beş kez sert bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleyerek kriptleri tek hücrelere ayırın. Topakları ve diğer yabancı maddeleri ortadan kaldırmak için çözeltiyi 40 mikronluk bir süzgeçten süzün. Ardından, tek hücreleri beş dakika boyunca yerçekiminin 300 katı ile pellet edin.Akış sitometrisi için, peleti her milyon hücre için% 2 fetal serumu ile bir X Hank'in tamponlu tuz çözeltisinin bir mililitresinde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonuna, soy belirteci CD31, CD45 ve Ter119 için birden 100'e kadar bir konsantrasyonda Brilliant Violet 421 etiketli antikorlar ekleyin. Ayrıca, bir ila 250 konsantrasyonda anti-CD24 APC ve anti-CD117 PE ekleyin.30 dakika sonra, Lgr5 pozitif kök hücreleri ve Paneth hücrelerini ayrı düşük bağlayıcı tüplere sıralayın. Sıralanan hücreleri beş dakika boyunca yerçekiminin 300 katı sıcaklıkta santrifüjleyin. Ardından, hücreleri metin protokolünde açıklanan bileşenlerle 100 mikrolitre ortamda yeniden süspanse edin.Hücreleri tedavi etmek için, toplam 100 mikrolitre kültür ortamı hacminde beş mikrolitre lipozom aracılı transfeksiyon reaktifi ve 100 nanomolar konsantrasyonda küçük enterferans yapan RNA kullanın. Hücreleri, küçük enterferans yapan RNA için 37 santigrat derecede 30 dakika veya seçilen modifikasyon için gereken süre boyunca inkübe edin. Hücreleri 500 mikrolitre kültür ortamında iki kez yıkayın.Hücreleri beş dakika boyunca yerçekiminin 300 katı santrifüjledikten sonra, 10 mikrolitre kültür ortamında tekrar süspanse edin. Daha sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca yerçekiminin 300 katı sıcaklıkta santrifüjlemeden önce iki hücresel bileşeni 20 mikrolitrelik toplam hacimde toplayın. Paneth ve Lgr5 pozitif hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika birlikte inkübe edin.Süpernatanın 10 mikrolitresini çıkarın ve hücre peletinin aspire edilmesini önlemek için bunları bir sıvı kayağında bırakın. Ardından, toplam 40 mikrolitre hacim için hücrelere 30 mikrolitre sulandırılmış bazal membran ekleyin. Hücreleri yeniden süspanse edin ve önceden ısıtılmış 96 oyuklu bir plakaya koyun.10 dakika sonra 200 mikrolitre tam ortam ekleyin. Ortamı her 48 saatte bir değiştirin. Son olarak, beşinci günde organoid çeşitliliğini sayın.Lgr5 pozitif kök hücrelerde murin APC geninin küçük enterferans yapan RNA aracılı yıkımı ve bunun sonucunda kanonik Wnt/beta-katenin sinyal yolunun aktivasyonu, tedavi edilmemiş muadilleri veya şifreli dizi kontrolü ile karşılaştırıldığında organoid çokluğunu olumlu yönde etkiler. Wnt aktivasyonunun oluşturulması, daha önce bildirildiği gibi Paneth hücrelerine olan gereksinimi de ortadan kaldırır. Ayrıca, bu organoidler, Paneth-Lgr5 hücre çiftlerinden elde edilenlerin morfolojisi ile karşılaştırıldığında, APC mutantı veya Wnt ile uyarılmış organoidler için iyi tanımlanmış bir fenotip olan içi boş küreler olarak görünür.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa beş saat içinde yapılabilir. Bu tekniği denerken, tüm adımları ve kuluçka sürelerini takip etmek önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, bağırsak kriptini nasıl çıkaracağınızı, tek hücreli bir özet hazırlayacağınızı ve organoidler oluşturmak için niş ve kök hücreleri nasıl yeniden oluşturacağınızı iyi anlamış olmalısınız.Bu teknik, bağırsak kök hücre alanındaki araştırmacıların, fare, ince bağırsak veya kalın bağırsaktaki kök veya niş hücrelere özgü etkileri incelemesinin yolunu açtı. Bu yöntem bağırsak kök hücre nişinin fonksiyonel analizi için kurulmuş olsa da, meme bezi veya saç folikülü gibi diğer somatik kök hücre nişlerine de uygulanabilir. Bu prosedürü takiben, QPCR veya Western blotting gibi organoidlerde genom protein ekspresyonunu analiz etmek için ek deneyler yapılabilir.

the-organoid-reconstitution-assay-ora-for-functional-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu video protokolünde, primer intestinal epitel organoidlerinde lentiviral transdüksiyonun ve bu kültürlerin kantitatif RT-PCR, RNA-mikroarray ve immünohistokimya ile işlenmesi ve aşağı akış analizinin adım adım açıklamasını veriyoruz.

Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol

Burada, hasat korumak ve patojen ilişkili moleküler modelleri (PAMPS) ve Listeria monocytogenes fare ince bağırsak organoids tedavisi için bir protokol da gen ifadesi ve protein için uygun normalizasyon ağırlıklı olarak, tarif edilmektedir.

<em&gt; Ex Vivo</emFare Bağırsak Organoids ve&gt; Kültür ve Desen Tanıma Reseptör Uyarım

Burada ince bağırsak organoidlerinin bariyer bütünlüğünü ölçmek için bir teknik açıklanmıştır. Yöntemin canlı organoidlere dayanması, farklı bariyer bütünlüğünün maddeleri veya bunların kombinasyonlarını zaman içinde çözümlü bir şekilde modüle ederek sıralı olarak araştırılmasını sağlar.

Yaşayan Organoidlerde Bağırsak Bariyerinin Bozulmasının Araştırılması

Bu protokol, insan pluripotent hücrelerinin bağırsak organoidlerine farklılaşmasına izin verir. Protokol, hücreleri kesin endoderm, arka bağırsak endodermi ve ardından bağırsak epiteli popülasyonuna farklılaştırarak normal insan gelişimini taklit eder. Bu, protokolü hem bağırsak gelişimini hem de hastalık modelleme uygulamalarını incelemek için uygun hale getirir.

Gelişimsel ve Hastalık Modelleme Uygulamaları için hiPSC Kaynaklı Bağırsak Organoidlerinin Üretilmesi

Burada, bağırsak bariyer fonksiyonunu, geçirgenliğini ve taşınmasını incelemek için insan organoid türevi bağırsak epitel monokatmanlarının hazırlanmasını açıklıyoruz. Organoidler dış uyaranlara karşı orijinal epitel dokusu yanıtını temsil ettiğinden, bu modeller hücre hatlarının genişletilebilirliğinin avantajlarını ve birincil dokunun alaka düzeyini ve karmaşıklığını birleştirir.

Organoid Kaynaklı Epitel Tek Katmanlı: Bağırsak Bariyer Fonksiyonu için Klinik Olarak İlgili Bir In Vitro Model

Biyopsi kaynaklı intestinal organoidler ve çip üzerinde organ teknolojileri, bölgeye özgü bağırsak işlevselliğini özetlemek için mikrofizyolojik bir platformda birleştirilir.

Bağırsak Bölgesine Özgü İşlevselliği Modellemek için İnsan Organoidlerini ve Çip Üzerinde Organ Teknolojisini Birleştirme

Bu protokol, bir klodin-7 nakavt modelinde kolonik kök hücrelerin aktivitesini ve işleyişini incelemek için bir murin kolonik organoid sisteminin kurulmasını açıklamaktadır.

Bağırsak Kök Hücre Fonksiyonunu Incelemek için Murin Kolonik Kriptlerinin Üç Boyutlu Kültürü Ex Vivo

Murin ince bağırsak kriptlerini ve kültür bağırsak 3D organoidlerini kriptlerden izole etmek için bir protokol tarif ediyoruz. Ek olarak, bir alt epitelyal hücresel nişin yokluğunda tek bir bağırsak kök hücresinden organoidler üretmek için bir yöntem tarif ediyoruz.

Murin Bağırsak Kriptlerinden Organoidlerin 3D Kültürlenmesi ve Organoid Araştırmaları için Tek Bir Kök Hücre

Burada, sıçan bağırsak organoidleri üretmek ve bunları birkaç aşağı akış uygulamasında kullanmak için bir protokol sunuyoruz. Sıçanlar genellikle tercih edilen bir klinik öncesi modeldir ve sağlam bağırsak organoid sistemi, in vivo çalışmalara eşlik edecek bir in vitro sistem ihtiyacını karşılar.

Sıçan Bağırsak Organoidlerinin Üretimi ve Manipülasyonu

İnsan perivasküler kök hücreler (PSC'ler) mezenkimal kök hücreler (MKH) benzer iskelet doku yenilenmesine yönelik yeni bir kök hücre sınıfı vardır. PSC'ler standart bir yağ emme prosedürleri sırasında temin adipoz dokusu FACS (floresans aktive hücre ayırma) yoluyla izole edilebilir, ardından kemik oluşumunu sağlamak için bir osteoendüktif iskelesi ile...

Kemik Rejenerasyon için İnsan perivasküler Kök Hücre kullanın

Öğrenin bağırsak kök ve niş hücrelerinin fonksiyonel analizi için Organoid Yeniden Oluşturma Tahlili. Bu yöntem Lgr5+ ve Paneth hücrelerini ayırarak hücre tipine özgü genetik ve biyokimyasal modifikasyonlara olanak tanır.

Fonksiyonel analiz bağırsak kök ve niş hücre Organoid sulandırma tahlil (ORA)

Daha fazla video keşfet