Büyük hacimli, insan dışı primatlar Optogenetics için davranışsal ilgili aydınlatma

Bu protokolün genel amacı, insan olmayan primatlarda optogenetik manipülasyonlara çok uygun olan büyük hacimli bir doku aydınlatıcı oluşturmaktır. Bu yöntem, farklı beyin bölgelerindeki nöron popülasyonlarının davranışa nasıl katkıda bulunduğu ve bir bölgedeki zamansal olarak spesifik nöronal ateşleme modellerinin başka bir bölgeyi nasıl etkileyebileceği gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ışık kullanması ve böylece davranışsal olarak ilgili büyük beyin hacimlerinin minimum doku hasarı ile optogenetik manipülasyonuna izin vermesidir.

Bu tekniğin sonuçları, insan ve insan olmayan primat beyinleri arasındaki benzerlikler nedeniyle translasyonel tıbba kadar uzanır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edeceklerdir çünkü bu lifleri çekerken uygun miktarda basınç uygulamak biraz pratik gerektirir. Bu prosedüre başlamak için, istenen toplam aydınlatıcı uzunluğundan en az 10 santimetre daha uzun olan 250 mikrometre çapında plastik optik fiberden bir kesiti kesmek için bir çift keskin makas kullanın.

Ardından, 22 gauge tel sıyırıcı kullanarak plastik optik fiberin bir ucundan 15 ila 20 santimetre polietilen kılıfı çıkarın. Ardından, elyafın soyulmuş ucunun en uzak üç ila beş santimetresini bir masa mengenesi kelepçesine sabitleyin. Elyafın ceketli ucunu bir elinizle sabit ve sabit bir çekişle gergin tutun.

Elyaf zemine paralel olmalı, mengeneden çekilmelidir. Isıtma ve soğutma boyunca elyaf üzerindeki bu sabit gerilimi koruyun, böylece elyaf inceldikçe düz ve gergin kalır. Çift sıcaklıklı bir ısı tabancasının en düşük ayarını kullanarak, elyafın soyulmuş kısmını 60 ila 100 mikrometre çapa veya yaklaşık bir insan saçı çapına kadar inceltilene kadar ısıtın.

Soğumasına izin verirken elyaf üzerindeki sabit gerilimi koruyun. Gerginliğin korunamaması veya elyafın aşırı ısınması, elyafın kıvrılmasına ve/veya kırılmasına neden olabilir. Elyafı ısıtırken sabit gerginliğin korunmasına yardımcı olmak için, baskın olmayan elinizi kullanın, böylece ısı tabancasını kullanırken bırakmak zorunda kalmazsınız.

Ayrıca, daha da iyi bir tutuş elde etmek için lifi avucunuzun etrafına nazikçe sarabilirsiniz. Elyaf tamamen soğuduktan ve istenen çapa ulaşıldıktan sonra, elyafı her iki taraftaki en dar noktadan üç santimetre sıkıştırın. Elyafın ekseni boyunca hızlı ve keskin bir çekme ile, konik bir uç oluşturmak için kenarları ayırın.

Ardından, konik ucu bir diseksiyon mikroskobu altında düşük güçte inceleyin. Uç çatallı veya kıvrılmışsa, lifi atın. Çok fazla pratikle bile, liflerin yaklaşık üçte biri çatallı veya kıvrılmış uçlara sahip olacaktır.

Başka bir lif çekmek çok hızlı ve ucuz olduğu için onları tamir etmeye çalışmak yerine atıyoruz. İstenen uç uzunluğunu açıkta bırakarak, ucun ucuna yakın bir parça laboratuvar bandı yerleştirerek konik ucu aşındırmaya hazırlanın. Burada son beş milimetre açığa çıkar.

Bant, elyafı istenen ışık emisyonu uzunluğunun üzerinde aşınmaya karşı korur. Bundan sonra, başparmak ve işaret parmağı arasında beş mikrometre silisyum karbür alıştırma levhasından oluşan küçük bir kare katlayın. Elyafın ucunu alıştırma tabakasının iki tarafı arasına yerleştirin ve küçük dairesel hareketlerle elyafı nazikçe aşındırın.

Elyafı, her tarafı eşit şekilde kazınacak şekilde sık sık döndürün. Ardından, 22 gauge tel sıyırıcı kullanarak aydınlatıcının karşı ucundan polietilen kılıfın yaklaşık beş milimetresini çıkarın. Ardından, yüzeyi düzleştirmek için karşı ucu sıcak bir bıçakla düz bir şekilde kesin.

Aydınlatıcının ucuna, kazınmış ucun karşısına bir konektör takın. Bu, aydınlatıcının bir optik kabloya veya lazere bağlanmasını sağlar. Daha sonra, arka arkaya daha ince alıştırma tabakalarıyla karşı ucu düz bir şekilde cilalayın.

Daha sonra, düz karşı ucu, yüksüğün ucuyla aynı hizaya gelene kadar 260 mikrometre iç çaplı paslanmaz çelik yüksüğe yerleştirin. Karşı ucun bir fiber mikroskobu ile düzgün ve eşit bir şekilde parlatıldığını görsel olarak onaylayın. Yüksüğü, yüksüğün daha küçük açıklığı aşağıyı gösterecek şekilde masanın kenarına dikey olarak bantlayın.

Ardından, bir mililitrelik bir şırıngayı plastik epoksi ile doldurun ve şırıngaya 18 gauge kör bir iğne takın. Bunu takiben, epoksiyi yüksüğe uygulamak için iğneyi kullanın. Yüksüğü tamamen epoksi ile doldurun.

Fiberi, yüksüğün tabanı ile aynı hizada olacak şekilde yüksüğe yerleştirin. Gerekirse, kurutmadan önce elyafın cilalı yüzeyindeki fazla epoksiyi ıslak tüy bırakmayan bir mendille silin. Bu adımda, her test oturumundan önce bir kule mikro sürücü hazırlayın.

Ardından, sürücüdeki alt kelepçeye eğimli uçlu 25 gauge bir kılavuz tüp takın. Büyük hacimli aydınlatıcıyı üst kıskaça sabitleyin. Bu kelepçe tahrik motoruna takılıdır.

Daha sonra, büyük hacimli aydınlatıcıyı kılavuz borudan tam olarak geçirin ve aydınlatıcının ucunun kılavuz borunun ucunu geçtiğini onaylayın. Alternatif olarak, elyafı korumak için elyafın kendisi yerine bant kenetlenecek şekilde elyafa laboratuvar bandı uygulanabilir. Ardından, kılavuz tüpü ve aydınlatıcıyı sterilizasyon için antiseptik bir solüsyona batırın.

Temiz haznenin içine bir milimetre delik aralığı olan özel bir sterilize edilmiş ızgara yerleştirin ve haznenin yan tarafındaki vida ile önceden belirlenmiş bir yönde sabitleyin. Steril künt forseps kullanarak aydınlatıcıyı yukarı çekerek sterilize edilmiş aydınlatıcıyı kılavuz tüpten geri çekin. Aydınlatıcının ucu, kılavuz borunun ucunun beş ila 10 milimetre üzerinde olmalıdır.

Mikro sürücüyü tutucuya takın ve kılavuz tüpü hedef ızgara deliğine yerleştirin. Ardından, kılavuz tüp dura seviyesinin tam ortasına gelene kadar mikro sürücü aşamasını indirin. Aynı zamanda, aydınlatıcıyı steril forseps ile manuel olarak indirin.

Herhangi bir direnç varsa, aydınlatıcıyı beş ila 10 milimetre geri çekin, 10 dakika bekleyin ve tekrar deneyin. İkinci denemede hala direnç varsa, aydınlatıcı ucunu kılavuz boruya geri çekin, kılavuz boruyu 0.25 milimetre indirin ve tekrar deneyin. Aydınlatıcının diğer ucundaki yüksüğü daha büyük optik kuruluma veya lazere bağlayın.

Bu şekil, aydınlatma ile hata oranlarının önemli ölçüde arttığını göstermektedir. Ve buradaki raster grafikler, korteksin 2.5 milimetre kalınlığını kaplayan nöronların inhibisyonunu gösteriyor. Ve 4,5 milimetreye yayılan ışık artefaktını gösteren yerel alan potansiyeli.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik kullanılarak 10 ila 15 dakika ve ayrıca epoksi kuruma süresi içinde büyük hacimli bir aydınlatıcı oluşturulabilir. Kalibrasyon yarım saat kadar daha ekler, bu nedenle verimliliği en üst düzeye çıkarmak için genellikle aynı anda birkaç aydınlatıcı yaparız. Bu prosedüre katılırken, aydınlatıcıların çoğunun kalite kontrol standartlarını karşılamayacağını unutmamak önemlidir.

Sorun değil. Uç denetimini geçemezlerse, onları atarız. Ancak kalibrasyonda başarısız olurlarsa, genellikle onları yeniden cilalar ve kalibrasyonu tekrarlarız.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların, insan olmayan primatlarda nöronal ateşlemeyi bastırmak ve davranışı modüle etmek için optogenetik kullanmalarının önünü açmaya yardımcı oldu. Bu videoyu izledikten sonra, büyük hacimli bir doku aydınlatıcısının nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.