İmalat ve Organ-on-chip sistemin doğrudan Transendothelial elektrik direncini ölçmek için entegre elektrotlar ile doğrulama

Bu videonun genel amacı, transendotelyal veya transepitelyal elektrik direnci ölçümleri veya TEER ölçümleri için entegre elektrotlu mikro akışkan çiplerin nasıl üretileceğini ve kullanılacağını göstermektir. Bu, mikro-akışkan çipte bir kan-beyin bariyeri kullanılarak gösterilmiştir. Bu yöntem, örneğin entegre elektrotlar kullanarak kan-beyin bariyeri dokusunun bariyer fonksiyonunun doğrudan ölçülmesini sağlayarak Çip Üzerinde Organlar alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Tekniğimizin temel avantajı, elektrotların Organ-on-Chip sistemlerine kolayca entegre edilebilmesi ve bunun sonuçlarının farklı sistemler arasında karşılaştırılabilmesidir. Bu teknolojinin etkileri, sağlık ve hastalık, ilaç keşfi ve kişiselleştirilmiş tıpta kan-beyin bariyeri işlevini anlamaya kadar uzanır. Bu yöntem kan-beyin bariyeri işlevi hakkında bilgi sağlamak için kullanılabilse de, Çip Üzerinde Akciğer ve Çip Üzerinde Bağırsak gibi diğer Çip Üzerinde Organ sistemleri bağlamında da kullanılabilir.

Bu işleme başlamak için 27 gram PDMS baz maddesini ve 2.7 gram sertleştirici maddeyi iyice karıştırın. Daha sonra hava kabarcıklarını gidermek için karışımı bir desikatörde yaklaşık 45 dakika gazdan arındırın. Bu arada, kalıbın etrafına şeffaf bant yapıştırarak kalıbı sıvı PDMS karışımı için hazırlayın veya kalıbı uygun bir gofret tutucusuna yerleştirin.

Gazı alınmış PDMS karışımını kalıba dökün. Daha sonra, PDMS karışımını 60 santigrat derecede bir fırında dört saat kürleyin ve daha sonra soğumaya bırakın. Çapraz akışlı bir davlumbazda, kürlenmiş PDMS'yi kalıptan çekin.

PDMS'deki kesme çizgilerini kullanarak PDMS replikasını ayrı üst ve alt talaş parçalarına kesin. Bunu takiben, giriş ve çıkışları oluşturmak için bir milimetre çapında keskin bir biyopsi zımbası kullanarak üst kısımlara dört delik açın. PDMS kalıntılarının çipte birikmesini önlemek için içeriden dışarıya doğru zımbalayın.

Ardından, talaş parçalarını toza karşı korumak için şeffaf bantla örtün. Daha sonra, polikarbonat membranları transwell eklerinden yaklaşık üç ila üç milimetre karelik kareler halinde kesin. Bundan sonra, gözenekli bir membran ile arayüzlenmiş iki katmanlı bir cihazı monte etmek için iki PDMS parçası arasına sızıntı yapmayan gözenekli bir membran monte edin.

Bu amaçla, 0.7 gram PDMS baz maddesi, 07 gram kürleme maddesi ve 540 mikrolitre toluen kullanarak bir PDMS toluen harcı hazırlayın. Harcı iyice girdaplayın, ardından ince, homojen bir harç tabakası elde etmek için 200 mikrolitre harcı 1500 rpm'de 60 saniye boyunca bir cam lamel üzerine döndürün. Daha sonra, lamel tabakasından ince bir harç tabakasını bir mürekkep silindiri ile çipin alt kısmına aktarın.

Alt kısmı fırına dayanıklı bir kaba koyun ve ardından harcı cipsin üst kısmına aktarın. Bir cımbız seti ile bir zarın kenarlarını spinli harcın içine batırın ve alt kısmın ortasına dikkatlice yerleştirin. Bunu takiben, hizalamaya dikkat ederek üst kısmı dikkatlice alt kısma yerleştirin.

Talaşın içine toz girmesini önlemek için cips girişlerini şeffaf bantla kapatın ve 60 derecede üç saat pişirin. Bu adımda dikkatli olmak çok önemlidir. Harcın kanallara girmesini ve membranı tıkamasını önlemek için talaş üzerine baskı uygulamayın ve üst kısmı alt kısmın üzerine kaydırmayın.

Elektrotları yan kanallara entegre etmek için, iki santimetre uzunluğunda parçalar halinde bir platin tel kesin. Ardından, 30 dakika boyunca asetona batırın. Daha sonra su ve etanol ile durulayın ve kurumasını bekleyin.

Çapraz akışlı bir davlumbazda, plastik bir tabağa bir çip koyun. Bir cımbız kullanarak çipin elektrot kanallarına dört platin tel yerleştirin ve bir sonraki adımda tabağa sabitlemeyi sağlamak için bunları plastik tabağın üzerine bükün. 0,7 ila bir milimetrelik telleri, T şeklindeki kanal bağlantısını geçecek şekilde kültür kanalına yerleştirin.

Daha sonra, elektrot kanalı girişine bir damla UV ile kürlenebilen yapıştırıcı uygulayın ve yapıştırıcının kanalı kılcal kuvvetlerle doldurmasına izin verin. Ardından, UV'yi açın ve elektrot kanalının sonuna ulaştığında yapıştırıcıyı sertleştirin. Dört entegre elektrotu iki bileşenli bir epoksi yapıştırıcı ile plastik kalıba sabitleyin.

Bunu takiben, cipsleri şeffaf bantla örtün ve iki saat boyunca 60 santigrat derecede pişirin. Soğumalarını bekleyin ve kullanana kadar tozsuz bir şekilde saklayın. Hücre bağlanmasını teşvik etmek için çipleri kaplamak için, reaktifleri eklemeden önce her iki kanalı da PBS ile doldurun.

Kanallarda hava kabarcığı olup olmadığını mikroskop altında kontrol edin. Eğer öyleyse, ekstra PBS ile yıkayarak bunları çıkarın. Daha sonra, her iki kanalı da PBS'de mililitre insan fibronektininde 30 mikrolitre 20 mikrogram ile doldurun.

Onları üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra cipsleri endotelyal büyüme ortamı ile yıkayın ve iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, tüm elektrotların kanallardaki sıvı ile doğrudan temas halinde olduğundan emin olmak için boş talaşların TEER'ini ölçün.

Bunu yapmak için, inkübatörden bir çip alın ve en az on dakika oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin. Çipin dışında elektro-köprülenmeyi önlemek için elektrotların etrafındaki plastik tabaktaki sıvıyı çıkarın. Daha sonra, iki elektrotun her kombinasyonu için empedans spektrumunu 200 hertz'den bir megahertz'e alın, bu da TEER'nin doğrudan belirlenebildiği beş ila on dakika içinde çip başına altı empedans spektrumu ile sonuçlanır.

TEER ölçümünü doğrulamak için empedans spektrumlarının beklenen büyüklüklere ve şekillere sahip olup olmadığını kontrol edin. Şimdi, kültür ortamını birleşik tek katmanlı hcMEC / D3 hücreleri ile bir kültür şişesinden çıkararak üst kanala oturtulacak bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Bundan sonra, hücreleri PBS ile yıkayın.

PBS'yi çıkarın ve ardından iki mililitre yüzde 05 tripsin EDTA ekleyin ve hücreler kültür şişesinden ayrılana kadar iki ila beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, tripsini yüzde 20 FBS ile desteklenmiş kültür ortamı ile devre dışı bırakın. Hücreleri sayın ve askıya alınan toplam sayılarını hesaplayın.

Bu arada, hcMEC / D3 hücrelerini beş dakika boyunca 390 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve çipte santimetre kare başına 200 bin hücrelik bir tohumlama yoğunluğuna karşılık gelen mililitre başına beş milyon hücrelik bir konsantrasyonla sonuçlanacak şekilde hücre peletini uygun hacimde endotelyal büyüme ortamında yeniden askıya alın. Ardından, iyi karıştırılmış hücre süspansiyonunun 30 mikrolitresini üst kanala yavaşça pipetleyin ve yine de basınç uygularken pipeti akıcı bir hareketle girişten çıkarın.

Tohumlama yoğunluğunu mikroskop altında kontrol edin. Üst kanal boyunca hücrelerin düzgün bir dağılımı sağlanmalıdır. Daha sonra cipsleri en az bir saat boyunca 37 santigrat derecede ve yüzde beş karbondioksitte inkübe edin.

Daha sonra, bağlı olmayan hücreleri endotel kültür ortamı ile yıkayın. TEER'in kültür döneminde izlendiğini unutmayın. Bunlar, hücresiz ve hücreli çiplerde elektriksel empedans spektroskopisi için empedans büyüklüğünü ve faz kaymasını gösteren tipik şematik empedans spektrumudur.

Elektrotlarda çift katmanlı kapasitans, kültür ortamı direnci, hücre bariyeri direnci veya hücre zarı kapasitansının hakim olduğu dört ana bölge vardır. İlgilenilen bölge, hücre katmanının katkısının nerede ölçülebileceğini gösterir. Ve bu, dört elektrotun altı kombinasyonunun tümü arasındaki ölçülen dirençlerden TEER'i hesaplama formülüdür.

Burada gösterilen, üç günlük kültür periyodu boyunca 22 artı veya eksi 1.3 ohm santimetre karelik bir platoya ulaşan cipsler üzerindeki dört BBB'nin ortalama TEER'sidir. Karşılaştırma için, hücreli çiplerin TEER değerindeki değişime kıyasla aynı dönemde sıfır ohm santimetre kareden marjinal varyasyon ve sapma gösteren boş çiplerin verileri dahil edilmiştir. Lekeli çekirdeklerin floresan mikrokopisi, hem PDMS hem de iç kısımda belirtilen yerdeki membran üzerinde sürekli bir tek kat endotel tabakası ortaya çıkardı.

İmmünofloresan, sıkı bağlantı proteini zonula'nın varlığını ortaya çıkardı, bunlardan biri hücreler arasındaki BBB'ye özgü sıkı bağlantıların ölçülen TEER'ye yol açtığını gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, Organs-on-Chips'te TEER ölçümleri için entegre elektrotlu çiplerin imalatı ve kullanımı hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu teknik, örneğin Alzheimer hastalığında doğrudan doğum ve hastalık özelliklerini incelemek için kan-beyin bariyeri araştırması alanında kullanılabilir.

Bu prosedürü takiben, insan kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden farklılaşan beyin endotelinin bariyer fonksiyonu da kişiselleştirilmiş tıptaki uygulamalar için izlenebilir.