Name: İmalat ve Organ-on-chip sistemin doğrudan Transendothelial elektrik direncini ölçmek için entegre elektrotlar ile doğrulama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Öğrenin, entegre elektrotlarla organ-on-chip cihazı imalatını ve transendotelyal elektrik direnci (TEER) ölçümünü. Bu yöntem, kan-beyin bariyeri fonksiyonunu doğrudan izlemek için mikroakışkan teknolojisini kullanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Minnetle Mathijs Bronkhorst ve kalıp imalatı verimli tartışmalar ve veri gösterimi ile yardım için Johan Bomer kabul.
Bu araştırma tarafından finanse edildi: SRO Biyomedikal Microdevices, L.I. Segerink, MIRA Enstitüsü Biyomedikal mühendislik ve teknik tıp, Twente Üniversitesi; SRO organları-Tarih-cips Milattan sonra van der Meer, MIRA Enstitüsü Biyomedikal mühendislik ve teknik tıp, Twente Üniversitesi; ve VESCEL, ERC gelişmiş hibe A. van den Berg (grant no. 669768).

1. organ-on-chip cihaz imalatı <ol><li>Standart fotolitografi yöntemlerle fabrikasyon kanal tasarımları ile bir kalıp PDMS kopyasını yapmak ve mikrosıvısal çip PDMS parçaları elde edilir.
	<ol><li>Tartmak yaklaşık 27 g PDMS temel aracı ve 2.7 g kür Ajan; kitle oranı 10:1 olması gerekiyor. Bu bir 3 mm kalınlığında PDMS levha 130 mm (5 inç) çapında bir kalıp üzerinde iyi gelir. Bu bileşenler iyice karıştırın.</li>
		<li>Hava kabarcıkları kaldırmak için desiccator için yaklaşık 45 dakika karışımı degas.</li>
		<li>Bu arada, kalıp kalıp etrafında Açık teyp yapışarak sıvı PDMS karışımı için hazırlamak veya kalıp bir uygun gofret tutucuya yerleştirin.</li>
		<li>Degassed PDMS karışımı kalıp üzerine dökün. Herhangi bir hava kabarcıkları kaldı PDMS karışımı veya kalıp yüzeyde bu yine yaklaşık 30 dk. degas Eğer</li>
		<li>PDMS karışımı bir fırın 4 h soğumasını izin ver için 60 ° C'de tedavisi.</li>
		<li>Çapraz akışlı başlıklı tedavi PDMS kalıp üzerinden çekin; kalıp hemen daha fazla PDMS yineleme yapmak için yeniden kullanılabilir.</li>
		<li>Ayrı üst ve alt çip parçalar içinde PDMS kesme hatları kullanarak PDMS yineleme oyulmuş.</li>
		<li>En iyi parçalar 1 mm çapında formu giriş ve çıkışları için bir keskin biyopsi yumruk kullanarak dört delik yumruk. İçinde gelen yumruk için dış yongasında toplama PDMS enkaz önlemek için. Onları toz karşı korumak için açık bant ile yonga parçaları kapsayacak.</li>
		<li>Polikarbonat membranlar Transwell ekler üzerinden yaklaşık 3 × 3 mm kareler halinde kesin 2.</li>
	</ol></li> <li>Gözenekli bir membran sızıntı içermeyen bir iki katlı cihaz montajı için iki PDMS parçalar arasında senitehlikeye gözenekli bir membran ile montajı. 
	Not: Bu Griep ve ark adapte iletişim kuralıdır. 19 ve Chueh ve ark. 26 <ol><li>kaynaklanan bir 5:3 ağırlık oranı hazırlama PDMS temel Ajan, kür Ajan 0,07 g ve toluen, 540 µL 0.7 g kullanarak PDMS/toluen havan mermisi. Girdap harç iyice.</li>
		<li>Spin-kat 200 µL harç üzerine cam coverslip 60 için 1500 rpm (1000 devir/dakika/sn parlak alanlardaki renk) s ince, tek bir harç tabakası elde etmek için.</li>
		<li>Coverslip alt kısmı ve çip bir mürekkep silindiri ile üst kısmı üzerine ince bir tabaka halinde harç transfer. Alt kısmında bir fırın güvenli tabak koyun.</li>
		<li>Cımbız, bir dizi ile bir membran spin kaplı harç içine kenarlarını daldırma ve alt kısmı ortasında dikkatlice yerleştirin</li>
		<li>Dikkatle yer üst kısmında alt kısmı hizalamayı dikkat süre. 
		Not: çip üzerine baskı değil ve üst kısmında kanal ekleme ve membran tıkanma harç önlemek için alt kısmı yana kay değil.</li>
		<li>Toz çip girmesini önlemek ve onları 3 h. için 60 ° c fırında için açık bant ile fiş giriş kapağı</li>
	</ol></li> <li>Elektrotlar yan kanal içine entegre. 
	Not: Bu Griep ve ark adapte iletişim kuralıdır. 19 ve Douville ve ark. 18 <ol><li>onları 30 dk. durulama su ve etanol ile aseton içinde batış parçalara, yaklaşık 2 cm. temiz Platin tel kesme ve kurumasını bekleyin.</li>
		<li>Bir çapraz akışlı başlık, bir plastik tabak üzerinde bir çip koymak. Dört Platin tel bir çift cımbız kullanarak bir çip elektrot kanallarına eklemek ve onları aşağı fiksasyon bir sonraki adımda çanak etkinleştirmek için plastik tabak üzerine viraj. Kanal T şeklinde kavşak geçmiş mm kültür kanalı içine 0.7-1 teller takın.</li>
		<li>Elektrot kanal girişinde UV tedavi edilebilir tutkal bir damla uygulayın ve kanal elektrot çevresinde kapiller Kuvvetleri tarafından doldurmak tutkal izin.</li>
		<li>Geçiş UV ve cure yapıştırıcı elektrot kanal sonuna ulaştığında. 
		Uyarı: Bu gözlerini zarar verebilir gibi UV ışık kaynağı bakmıyorum.</li>
		<li>İki bileşenli epoksi yapıştırıcı ile plastik tabak için dört entegre elektrotlar bağlayacaktın. Bu elektrotlar daha kolay işlenmesi sırasında ölçümleri çip üzerinden elektrotlar çekerek riski olmadan sağlar.</li>
		<li>Açık teyp çiplerle kapak ve onları 2 h. soğumasını ve tozsuz kullanmak kadar saklamak için izin ver için 60 ° C'de pişirin. Bu şekilde onlar olabilir güvenli bir şekilde en fazla bir ay için saklı.</li>
	</ol></li></ol> 2. Çip üzerinde endotel hücrelerinin beyin kaynaklı kültür <ol><li>kat hücre eki tanıtmak için fiş.
	<ol><li>Dolgu her iki kanal fosfat ile serum fizyolojik (PBS) ıslak onları reaktifler tanıtımı önce arabelleğe alınmış. Varsa bir mikroskop altında herhangi bir hava kabarcıkları kanallarında kontrol edin. Eğer öyleyse, bunları kaldırmak ilave PBS ile temizlenerek.</li>
		<li>Her iki kanal 20 µg/mL insan fibronektin PBS içinde 30 µL ile doldurun. 37 ° C'de 3 saat kuluçkaya. Hava kabarcıkları için kontrol edin ve gerekirse, PBS ile kanalları ve dolum fibronektin çözüm ile flush.</li>
		<li>Endotelyal büyüme orta çiplerle boşaltır ve onlara 37 ° C ve % 5 CO 2 2 h. için bir kuluçka kuluçkaya</li>
		<li>Boş cips AYLARININ tüm elektrotlar sıvı kanalı ile doğrudan temas içinde olduğundan emin olmak için adım 3'te açıklandığı gibi ölçmek. Boş fiş tipik AYLARININ değerler 0-1 Ω cm 2.</li>
	</ol></li> <li>En iyi kanal içine tohum hücreleri.
	<ol><li>Bir kültür şişesi (75 cm 2 kültür alanı) kültür ortamından insan beyin mikrovasküler endotel hücreleri (hCMEC/D3) bir Konfluent monolayer ile kaldırmak.</li>
		<li>Hücreleri PBS ile yıkayın. 2 mL % 0.05 tripsin-EDTA ekleyin ve 2-5 dakika kadar hücreleri kültür balonun ayırdıktan için 37 ° C ve % 5 CO 2 kuluçkaya.</li>
		<li>Kültür % 20 fetal sığır serum ile (FBS) takıma orta ile tripsin devre dışı bırakın. Hücreleri saymak ve süspansiyon hücrelerde toplam sayısını hesaplamak.</li>
		<li>Bu arada, 390 x g 5 min için de hCMEC/D3 hücreleri santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.</li>
		<li>Hücre Pelet endotelyal büyüme orta (EGM-2) 5 x 10 6 hücre/mL konsantrasyonu gelmesi uygun hacmine resuspend. 2 x 10 5 hücreleri/cm 2 çip'tohum yoğunluğu bu sonuç.</li>
		<li>Yavaş yavaş iyi karma hücre süspansiyon 30 µL en iyi kanal içine pipet ve hala baskı uygulamakla giriş bir akıcı hareketle pipet kaldırın.</li>
		<li>Mikroskop altında sağlanan yoğunluğu kontrol edin. En iyi kanal boyunca hücre tekdüze dağılım elde edilmelidir.</li>
		<li>Ekli olmayan hücreler endotel kültür orta ile dışarı floş için en az 1 h. 37 ° C ve % 5 CO 2 fiş Incubate.</li>
	</ol></li> <li>Üstünde-küçük parça endotel kültür korumak.
	<ol><li>İki kez günlük, alıcılar rezervuar olarak kültür orta dolu pipet ipuçları Ekle ve orta çip içinde yerçekimi tahrik akış tarafından yerine. 
		Not: mikro girme ve hücre katmanı yok hava kabarcıklarını önlemek için bir giriş belgili tanımlık uç eklemeden önce pipet ucu ve sıvı üstünde tepe-in belgili tanımlık küçük parça arasında sıvı-sıvı temas yapmak emin olun. Bu, küçük bir damla ekleyerek kolaylaştırılabilir içinde / çıkış pipet ekleme önce.</li>
		<li>Da Kanallar kurumasını önlemek için çıkışları pipet ucu rezervuar eklemek.</li>
		<li>37 ° C ve % 5 CO 2 fiş kuluçkaya.</li>
	</ol></li></ol> 3. Çip üzerinde AYLARININ ölçümleri <ol><li>th ayarlae AYLARININ ölçüm cihazları, bir kilit amplifikatör ve bir prob kablosu devre Van der dümen ve ark içinde belirtilen gibi oluşan. 16 alternatif olarak, potentiostats veya empedans analiz sistemleri de bu empedans tabanlı AYLARININ ölçümler için uygundur.</li>
	<li>Çip kuluçka makinesi almak ve oda sıcaklığında en az 10 dk. Kaldır herhangi bir sıvı plastik tabak elektrot elektrot dışında çip köprüleme önlemek için çevresinde üzerinden ulaşmak izin.</li>
	<li>Empedans spektrum 200 Hz den 1 6 empedans spectra çip sadece 5-10 dak onay başına empedans spectra beklenen büyüklükleri ve şekiller olarak AYLARININ ölçüm doğrulamak için varsa sonuçlanan MHz için iki elektrot, her birleşimi için al Sonuçlar bölümünde açıklanan.</li>
	<li>Çipi geri kuluçka 37 ° C ve % 5 CO 2 ölçüm bitirdikten sonra koymak.</li>
	<li>Bir normalleştirilmiş AYLARININ değerinde gelmesi elde edilen empedans spectra işlemek.
	<ol><li>Olsun ölçülen direnç <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq1.jpg"> elektrot arasındaki <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq2.jpg"> ve <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq3.jpg">, şekil 2B ve D, karşılık gelen empedans spectra 10 kHz rezistif Plato üzerinden gösterilen.</li>
		<li>Hesaplamak için bir çip bir anda karşılık gelen altı ölçülen Dirençleri kullanarak AYLARININ gelin Şekil 2 g 16 denklemi kullanarak: 
		<img alt="Equation 20" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq20.jpg"> Bu denklemde <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq4.jpg"> içinden direnç ölçülen, kültür alanı &lt; img alt = " Denklem 5"src="/files/ftp_upload/56334/56334eq5.jpg "/ &gt; dirençtir hücresel bariyer ve membran, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq6.jpg">, <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq7.jpg">, <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq8.jpg"> ve <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq9.jpg"> direnç vardır hücresel bariyer ile ölçülen değerleri ve <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq10.jpg"> ve <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq11.jpg"> direnç değerleri ölçülür düz kanalları. 16 rakam 2C içinde resimli eşdeğer devre denklemi elde edilir.</li>
	</ol></li> <li>Boş AYLARININ AYLARININ bütün zaman noktalarda AYLARININ geliştirme zamanında elde etmek için üzerinden çıkarma.</li></ol>

<ol><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Van der Meer, A. D., Van den Berg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-chips%3A+breaking+the+in+vitro+impasse%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse.</a> Integr Biol. 4 (5), 461-470 (2012).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).</li>
<li>Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-on-a-Chip+microenvironment+induces+human+intestinal+cells+to+undergo+villus+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation.</a> Integr Biol. 5 (9), 1130-1140 (2013).</li>
<li>Westein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerotic+geometries+exacerbate+pathological+thrombus+formation+poststenosis+in+a+von+Willebrand+factor-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (4), 1357-1362 (2013).</li>
<li>Van der Helm, M. W., Van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., Van den Berg, A., Segerink, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organ-on-chip+technology+for+blood-brain+barrier+research%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+barriers%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research.</a> Tissue barriers. 4 (1), e1142493(2016).</li>
<li>Abbott, N. J., Dolman, D. M., Yusof, S., Reichel, A. Chapter 6. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/book/10.1007%2F978-1-4614-9105-7">Drug Delivery to the Brain Vol. 10 AAPS Advances in the Pharmaceutical Sciences Series</a>. Hammarlund-Udenaes, M., de Lange, E., Thorne, R. G. , Springer. New York. 163-197 (2014).</li>
<li>Odijk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+direct+current+trans-epithelial+electrical+resistance+in+organ-on-a-chip+microsystems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems.</a> Lab Chip. 15 (3), 745-752 (2015).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+Measurement+Techniques+for+In+Vitro+Barrier+Model+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems.</a> J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Brown, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recreating+blood-brain+barrier+physiology+and+structure+on+chip%3A+A+novel+neurovascular+microfluidic+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor.</a> Biomicrofluidics. 9 (5), 054124(2015).</li>
<li>Deosarkar, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Dynamic+Neonatal+Blood-Brain+Barrier+on+a+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Novel Dynamic Neonatal Blood-Brain Barrier on a Chip.</a> PLoS ONE. 10 (11), e0142725(2015).</li>
<li>Ferrell, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+bioreactor+with+integrated+transepithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+measurement+electrodes+for+evaluation+of+renal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+bioeng%22%5BJournal%5D)">A microfluidic bioreactor with integrated transepithelial electrical resistance (TEER) measurement electrodes for evaluation of renal epithelial cells.</a> Biotechnol bioeng. 107 (4), 707-716 (2010).</li>
<li>Kilic, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-on-a-chip+model+enables+analysis+of+human+neuronal+differentiation+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis.</a> Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).</li>
<li>Partyka, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+regulates+transport+in+a+compliant+3D+model+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress regulates transport in a compliant 3D model of the blood-brain barrier.</a> Biomaterials. 115, 30-39 (2017).</li>
<li>Van der Helm, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+quantification+of+transendothelial+electrical+resistance+in+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectr%22%5BJournal%5D)">Direct quantification of transendothelial electrical resistance in organs-on-chips.</a> Biosens Bioelectr. 85, 924-929 (2016).</li>
<li>Booth, R., Kim, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22422217">Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (mu BBB).</a> Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).</li>
<li>Douville, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+two-layered+channel+system+with+embedded+electrodes+to+measure+resistance+across+epithelial+and+endothelial+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+chemi%22%5BJournal%5D)">Fabrication of two-layered channel system with embedded electrodes to measure resistance across epithelial and endothelial barriers.</a> Anal chemi. 82 (6), 2505-2511 (2010).</li>
<li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BBB+ON+CHIP%3A+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li>
<li>Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+blood-brain+barrier+model+provides+in+vivo-like+barrier+properties+for+drug+permeability+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening.</a> Biotechnol Bioeng. , (2016).</li>
<li>Wang, J. D., Khafagy, E. -S., Khanafer, K., Takayama, S., El Sayed, M. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+Endothelial+Cells%2C+Pericytes%2C+and+Astrocytes+into+a+3D+Microfluidic+in+Vitro+Model+of+the+Blood%E2%80%93Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood–Brain Barrier.</a> Mol Pharm. 13 (3), 895-906 (2016).</li>
<li>Walter, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400515301672">A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers.</a> Sens Actuators B Chem. 222, 1209-1219 (2016).</li>
<li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0969996109002083">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).</li>
<li>Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+the+blood-brain+barrier%3A+molecular+anatomy+and+possible+investigation+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches.</a> Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).</li>
<li>Weksler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).</li>
<li>Chueh, B. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leakage-free+bonding+of+porous+membranes+into+layered+microfluidic+array+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+chem%22%5BJournal%5D)">Leakage-free bonding of porous membranes into layered microfluidic array systems.</a> Anal chem. 79 (9), 3504-3508 (2007).</li>
<li>Golowasch, J., Nadim, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGolowasch%2C+J+%22Encyclopedia+of+Computational+Neuroscience%22">Encyclopedia of Computational Neuroscience</a>. Jaeger, D., Jung, R. , Springer. New York. 555-558 (2015).</li>
<li>Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance-based+cell+monitoring%3A+barrier+properties+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond.</a> Fluids Barriers CNS. 10 (5), (2013).</li>
<li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. -O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hCMEC%2FD3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16(2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu makale, bir organ-on-chip aygıt mühendislik ve cihazda kültürlü bir hücresel bariyer transendothelial elektriksel direnç (AYLARININ) doğrudan belirlenmesi sunuldu. Elektrotlar temiz oda ekipmanları ve dört elektrot kullanarak doğrudan AYLARININ belirlenmesi olmadan entegre sunulan yöntemi iki mikrosıvısal bölmeleri ile herhangi bir organ-on-chip aygıt için geçerlidir. Dört elektrotlar iki bölmeleri ayrılır sürece geometri ve çip düzeni öngörülen deneyler gereksinimlerine uyacak şekilde adapte edilebilir. Altı ölçümleri süresince yerinde fiksasyonlu koşuluyla dört elektrotlar bile varolan fişleri, alıcılar içinde uygun eklenebilir. Kaçak-Alerjik yapıştırma yöntemi farklı membranlar ve kanal geometrileri için PDMS/toluen oranını değiştirerek getirilebilir. Daha yüksek bir toluen içerik bir ince spin kaplı katmanda harç26 sonuç ve sığ ve dar Kanallar PDMS yerlerinde için daha uygun olabilir. Bir alt toluen içerik sonuçlarında daha kalın bir havan topu26 katman ve PDMS bölümleri arasında kalın membranların aldığınızdan daha uygun olabilir.
Şekil 2A şematik empedans spectra ve şekil 2E ve 2Fdeneysel spectra görüldüğü gibi empedans ölçümleri çift katmanlı kapasite elektrot-orta arayüz tarafından etkilenmektedir. Elektrotlar mikro içinde küçük boyutu nedeniyle, çift katmanlı kapasite empedans spectra, AYLARININ miktar zorlaştıran hücresel bariyer rezistif Yaylası üzerinden hâkim olunamaz. Bu sorunu gidermek için elektrotlar takılı fiksasyon önce kültür kanalları içine daha fazla. Bu maruz elektrot yüzey alanını artırır kültür ortamına ve bununla çift katmanlı kapasite de artacak. Böylece hücresel bariyer rezistif Yaylası daha kolay tanınan ve quantified olabilir bu düşük frekanslar için kapasitif yamaç bir kayma olur. Her ne kadar iki elektrot arasında ölçülen yol direnci daha küçük olacak, bu tabi sunulan yöntem AYLARININ miktar etkiler değil.
Hücresel bariyeri ölçme sırasında ekstra rezistif Yaylası tanınamıyor mümkündür. Bu membran kötü harç tarafından ölçülen bir yol etrafında hücresel bariyer yol alınmış Örneğin iki kanal arasında sıvı bir bağlantı sonucu olabilir. Buna ek olarak, olabilir dışında çip elektrotlar kültür orta bir damlacık tarafından bağlıysanız, elektrik köprü oluşturma. Bu genellikle daha düşük ölçülen empedansı ile kombine ve bu köprü kültür ortamının kaldırarak çözülebilir. Son olarak, orada hiçbir direnç Yaylası ve ölçülen empedans büyüklük beklenenden daha yüksek ise, gevşek bir bağlantı elektrik tesisatı veya güç kaynağı olabilir.
Gelecekte, geçerli BBB-on-chip fizyolojik alaka BBB farklılaşma ve artış bariyer gerginlik tanıtmak için bildirdi ve elde etmek zor stres fizyolojik düzeylerde yamultmak için endotel hücreleri açarak artırılabilir geleneksel vitro modellerinde. 29 Ayrıca, beyin kaynaklı hücreler endotel ile birlikte kültürlü için uygun bir bölme sunulan cihazın alt kanal sağlar. Bu da bariyer fonksiyonu artması beklenmektedir ve ayrıca patolojik şartlar altında ilgili hücre tipleri arasındaki karmaşık etkileşimler çalışma sağlar. 29
Sonuç olarak, bu yayında açıklanan organ-on-chip cihaz standart laboratuvar donanımları kullanarak sahte olduğu ve görsel denetim okudu hücrenin engel değil dört entegre elektrotları kullanarak doğrudan AYLARININ ölçüleri sağlamak için gösterilen katman. Bu aygıt organları fiş alanındaki uygulanabilirliği bu çip BBB taklit ve kültür döneminde AYLARININ izleme gösterilmiştir. Diğer (bariyer) organlara bir dizi bu çipe diğer ilgili hücre tipleri dahil olmak üzere taklit. Buna ek olarak, cihaz ve sistemler arasında karşılaştırılabilir tekrarlanabilir ve anlamlı AYLARININ değerleri ulaşmak için diğer iki bölme tabanlı organ-on-chip cihazlarda AYLARININ ölçme yöntemi kolayca uygulanabilir.

Organları fiş hızla yeni bir ortaya çıkan ve sınıf in vitro doku modelleri umut verici. 1 bu modelleri, bu hücrelerin fizyolojik microenvironment taklit ediyorlar şekilde tasarlanmıştır mikrosıvısal cihazlar içinde hücreler kültürlü. 1 , 2 bu basit tasarım ve temel fonksiyonu geleneksel vitro modellerden beklenenden daha gerçekçi fizyolojik veya patolojik davranış bu hücrelerin içinde sonuçlanır. 3 , 5 , 6 Ayrıca, organları fiş içinde vivo modellere kıyasla bir daha iyi kontrol edilebilir ortamı sağlamak ve insan kaynaklı sadakatle insan fizyolojisi ve patoloji çoğaltmak için sağlıklı ve hastalıklı doku dahil edebilirsiniz. Kan - beyin engelleri gelişimi son zamanlarda özetlenen gelişmeler yongaları (BBBs-Tarih-çipleri) üzerinde alan ileri hızlı hareketli olduğunu göster. 7
Onlar gerçek zamanlı ve sürekli mikroskobu, on-line biyokimyasal analizler ve entegre sensörler tarafından cihazın içinde kültürlü dokusu izlemeyi etkinleştir organları fiş başka bir avantaj sağlıyor. 1 , 2 Örneğin, transendothelial veya transepithelial elektriksel direnç (AYLARININ) ölçme non-invaziv geliştirme izlemek için güçlü bir yöntem olduğunu ve bozulma bariyer oluşturan dokular. 8 , 9 , 10 AYLARININ elektriksel direnç hücresel bir engeldir ve bu nedenle bariyer bütünlüğünü ve geçirgen göstergesidir. 10 organları-Tarih-fiş, hücresel engelleri genel olarak iki akışkan kanalları, apikal temsil eden ve bu bariyer doku demiri bölmeleri ayıran bir membran üzerinde kültürlü. Böyle cips AYLARININ ölçümleri uygun giriş ve çıkışları iki kanalının takılı elektrotları ile yapılabilir. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 ancak, el ile ekleme ve elektrot reinsertion kolayca yerleştirme hataları ve böylece örneğin olarak ölçülen direnç değişimler mikro ile daha uzun veya daha kısa yolları dayanıklılığını farklılıkları neden olabilir önemli hücre bariyer direnç karşılaştırılır. 16 cihazlar entegre elektrotlar ile reinsertion hataları ortadan kaldırmak için önerilmiştir. Ancak, bu tümleşik elektrotlar çoğunu doku kültürü17,18,19,20,21 teftiş zaman görmenize ve/veya gerektiren özel temiz oda imalat için işler. 17 , 22
Bu yayındaki bir önceki yayında,16 uygulanan ilk organ-on-chip cihaz görünürlüğü ölçülen hücre katmanı ve kolay üretim on tümleşik elektrotlar kararlılığını birleştirir. Tasarım ve üretim bu çip şekil 1' de tasvir. Kısacası, bu cihaz iki polydimethylsiloxane (PDMS) bölümden oluşur birlikte bağlı kanal diziniz ile kaçak içermeyen bir polikarbonat membran ile 0,4 ile µm arasında gözenekleri. Dört Platin tel elektrotlar takılı ve yerine bir photocurable ile sabit kültür alanı dışında iyi yapıştırıcı. Tüm bu üretim adımları genel Laboratuar donanımları, ezelî belgili tanımlık lüzum için a temiz oda çevre ile yapılabilir. Bunun üzerine, altı empedans ölçümleri yapılabilir böylece ölçülen AYLARININ doğrudan izolasyon kesit için çıkılan ve böylece etkisi en aza indirilmesi mikro direnç bağımsız izin bu dört elektrotlar kullanarak biyolojik olmayan çeşitleri sistemindeki (yeniden) ekleme hataları gibi. 16
Bu aygıt ve doğrudan AYLARININ ölçümleri uygulanabilirliği göstermek için kan - beyin bariyerini (BBB) bu yongası çoğaltılan. Bu biyolojik bariyer özel endotel hücreleri oluşur ve kan ve beyin beyin homeostazı sağlayacak arasında ulaşım düzenler. 23 , 24 BBB taklit etmek için mikrosıvısal cihazın üst kanal (lütfen Dr. s.-O. tarafından sağlanan hCMEC/D3 hücre kültürünü insan beyin mikrovasküler endotel hücreleri ile kaplı Couraud, INSERM, Paris, Fransa). 25 sunulan yöntem, ancak, daha genel olarak herhangi bir organ-on-chip cihaz iki bölmeleri ile uygulanabilir, doğrudan AYLARININ belirlenmesi kolayca kullanma etkinleştirme elektrotlar entegre.
Bu makale, ilk organ-on-chip cihazın entegre elektrotlar ile imalat işlemi açıklanmıştır. İleri, tohumlama yordam ve cihazın içinde beyin endotel hücrelerinin kültürü olduğunu açıkladı, üstünde-küçük parça AYLARININ ölçümleri yanı sıra. Sonuçlar bölümünde temsilcisi AYLARININ ölçümleri gösterilir ve veri işleme açıklığa kavuşturuldu. Son olarak, sunulan cihaz ve AYLARININ izlenecek yöntem uygulanabilirliği gösterilen BBB-tarih-3 gün boyunca takip çipi, bariyer fonksiyonu sunulur.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Malzemeler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Polidimetilsiloksan (PDMS) baz maddesi ve sertleştirici madde: Sylgard 184 Silikon elastomer kiti</td><td>Dow Corning</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Magic bant</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biyopsi zımbası, 1.0 mm çap</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31AA-P / 25</td><td></td></tr><tr><td>Polikarbonat membran, 0.4 &mikro; m gözenek boyutu</td><td>Corning</td><td>3401</td><td>Transwell kültür eklerinden kesilmiş</td></tr><tr><td>Toluen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>Platin tel, 200 & m çaplı</td><td>Alfa Aesar</td><td>10287</td><td></td></tr><tr><td>UV ile kürlenebilen yapıştırıcı: Norland Optik Yapıştırıcı 81</td><td>Norland Ürünleri</td><td>NOA 81</td><td></td></tr><tr><td>Epoksi yapıştırıcı: Loctite M-31 CL Hysol</td><td>Henkel</td><td>30673</td><td></td></tr><tr><td>hCMEC/D3 hücreleri</td><td></td><td></td><td>İnsan serebral mikrovasküler endotel hücre hattı, nazikçe Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, Fransa</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td> <td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>İnsan plazma fibronektin, 20 ve mikro; g/ml</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>Endotelyal büyüme ortamı-2 (EGM-2)</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Endotelyal bazal ortam-2 (EBM-2), EGM-2 ile desteklenmiş SingleQuots</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA, %0.05</td> <td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fırın</td><td>Bağlayıcı</td><td>9010-0190</td><td></td></tr><tr><td>Spin kaplayıcı: Spin 150</td><td>Polos</td><td>SPIN150-NPP</td><td></td></tr><tr><td>UV ışık kaynağı, 350 mW/cm'de 5 sn için 365 nm><sup2</td><td>Şirket içinde</td><td></td> <td>üretilmiştir</td></tr><tr><td>Santrifüj: Allegra X-12R Santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>Bağlayıcı</td><td>CB E2 150</td><td></td></tr><tr><td>Boxense</td><td>LocSense</td><td></td><td>Prob kablo devresine sahip kilitli amplifikatör, çip üzerinde TEER ölçümleri için uzmanlaşmıştır</td></tr></tbody></table>

İmalat ve organ-on-chip sistemin doğrudan transendothelial elektrik direncini ölçmek için entegre elektrotlar ile doğrulama

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organlar üzerinde fiş, vitro modelleri, içinde mikrosıvısal aygıtları (insan) doku kültürü ile ilgili çoğu hızla gelişmekte olan yararlı sağlamak için söz araştırma ve insan sağlığı ve hastalığı çalışmak için araçlar. Organ-on-chip cihazlar içinde kültürlü hücre katmanları bariyer fonksiyonu ayırdetmek için genellikle transendothelial ya da transepithelial elektrik direnci (AYLARININ) ölçülür. Bu amaçla, elektrotlar genellikle yonga elektrotlar alıcılar çipin içine el ile ekleme ile elde daha daha istikrarlı ölçümler sağlamak için mikro işleme yöntemleri tarafından entegre edilmiştir. Ancak, bu elektrotlar sık okudu hücre tabakasının görsel denetim engel veya imalat için pahalı temiz oda işlemlerinin izlenmesini gerektirir. Bu sınırlamalarını aşmak için burada açıklanan cihaz yer alan ve görsel denetim sağlayarak kültür alanı dışında sabit dört kolayca entegre elektrotlar içerir. Altı ölçüm yolları dayanıklılığını sayılabilir, bu dört elektrotlar hangi AYLARININ doğrudan, bağımsız kültür orta dolu mikro direnç olarak izole kullanarak. Kan - beyin bariyerini bu cihazda çoğaltılan ve onun AYLARININ aygıt uygulanabilirliği göstermek için izlenir. Bu çip, entegre elektrotlar ve AYLARININ belirleme yöntemini genellikle organları-Tarih-fiş diğer organlara taklit veya mevcut organ-on-chip sistemleri içine dahil olmak için geçerlidir.

Elektrik empedans spektroskopisi bir çip olmadan hücreleri (düz çizgi) ve hücresel bariyer (kesik çizgi) aracılığıyla şematik sonuçları şekil 2Agösterilir. Dört ana bölgeleri tespit edilmesi, her bir belirli elektrik bileşeni tarafından hakim. Altında yaklaşık 1 kHz, çift katmanlı kapasite elektrot-kültür orta arabirimi, hakim, empedans büyüklüğü ve-90 ° yaklaşan bir faz kayması için negatif bir eğim ile karakterize. Hangi çift katmanlı kapasite hakim, frekans kültür ortamına maruz elektrot alan bağlıdır. 0 °, yakın bir faz kayması ile 1 kHz (olmadan hücreleri) veya 100 kHz (hücrelerle) yukarıda Yaylası rezistif karşılık gelen Kültür orta mikrosıvısal kanallar, kanal uzunluğu ve kesit alanı ve iç bağlı olarak iç direnci membran, porozite ve kalınlığına bağlı olarak. Bir hücresel bariyeri ölçme, 1 ile 10 kHz arasında ekstra karşı koymak bir plato yanı sıra yerel maksimum faz diyagramı görülür. Hücreleri ölçülen yolundaki varsa ve bu nedenle ilgi "bölge" olarak adlandırılır, bu AYLARININ belirlenmesi olarak empedans sonuçları net bir artış için kritik öneme sahip bölgedir. İlave yamaç 10 ve 100 kHz arasındaki elektriksel yalıtım lipid bilayer membranlar doğar ve hücre katmanı Toplam alan üzerinde bağımlı olan hücre bariyer kapasitans karşılık gelir. 27 bu bölgeler yanı sıra empedans büyüklükleri sınırlarını okudu sistemine bağlıdır ve ile diğer şeyler, kanal, kültür orta iletkenlik, elektrot konumunu ve hücre tipi arasında değiştirmek. Teori ve elektrik empedans spektroskopisi engel oluşturmayan üzerinde uygulama hakkında daha fazla okumak için doku derlemede Benson ve ark. tarafından tavsiye edilir. 28
AYLARININ ölçümlerin temsilcisi veriler için boş bir çip ve bir çip ile şekil 2E ve 2F, hCMEC/D3 beyin endotel hücre katmanda sırasıyla gösterilir. Kısacası, empedans spektroskopisi ile dört elektrotlar altı ölçümleri kullanarak gerçekleştirildi: hücre kültürü orta dolu kanallar (düz çizgi) aracılığıyla iki ölçüm ve kanallar gibi membran aracılığıyla dört ölçümleri ve - varsa - hücresel bariyer (kesikli çizgiler). Bu altı ölçüm yolları şematik kesit (şekil 2C) ve üstten görünüm (şekil 2B) türetilmiştir şekil 2B, eşdeğer direnç devrede tespit edilebilir. Boş çip ölçümleri (şekil 2E) empedans spectra ürününün tipik şekil şekil 2Agösterildiği gibi değerleri göster. Hücresel bariyer ( şekil 2Fiçinde kesik çizgiler) aracılığıyla ölçümleri ile şekil 2Ahücrelerde tipik empedans spectra benzer. Empedans büyüklüğü ve faz artış geçiş Not 1 MHz doğru. Bu ölçüm Kur yüksek frekanslarda normal yanıttır ve deneysel kökeni değil.
Bu deneysel empedans spectra kullanarak AYLARININ belirlemek için ilk ölçülen çip direnç, hücre katmanı, kanalları ve membran toplam direnç olduğu belirlenir. Bu amaçla, uygun okuma frekans faiz bölgesinde, yerel maksimum faz arsa hücreleri ve 0 ° faz kayması hücreleri olmadan yakın olan seçildi: 10 kHz. 10 kHz altı ölçülen Dirençleri ile dört elektrotlar arasında ölçülen AYLARININ doğrudan denklemi şekil 2Fiçinde kullanılarak hesaplanır.
Onun AYLARININ kültür 3 gün boyunca izlenen ve sunulan cihazın AYLARININ organları-Tarih-fiş belirlemek için uygun olduğunu göstermek için BBB çip içinde çoğaltılan. Ortalama AYLARININ ± standart hata değerlerin ortalamasının (SEM) 22 ± 1.3 Ω cm2, bir plato kaynaklanan dört BBBs-Tarih-fiş için gösterilen şekil 3A ' da literatürde bildirilen gibi bu hücre kültürünü AYLARININ karşılaştırılabilir. 29 Ayrıca, deney sona ermesi ve floresan çekirdekleri boyama sonra o beyin endotel aygıt (şekil 3B) içinde sürekli bir monolayer oluşan görülebilir. Ayirt sıkı kavşak protein Zonula Occludens-1 (ZO-1) Boyama beyin endotel hücreleri onların BBB özgü fenotip muhafaza ve sıkı bileske kompleksleri kurdu gösterdi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig1.jpg"> 
Resim 1: Tasarım ve montaj organ-on-chip cihazın entegre elektrotlar ile. 
Bir üst PDMS bölümünde en iyi kanal (TC), bir membran (M) ve bir alt PDMS bölümü alt kanal (M.Ö.) ile oluşan mikrosıvısal çip (A) şemayı göster. Dört Platin tel elektrot (E1-4) eklenen ve yan kanallarında sabit. En iyi kanal ve membran üstüne, hCMEC/D3 beyin endotel hücreleri BBB çoğaltmak için kültürlü. (B) çip, plastik bir yemek için sabit monte. Yazdırılan ve adapte ile izninden Elsevier. 16 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig2.jpg"> 
Resim 2: Temsilcisi empedans veri ve AYLARININ belirlenmesi. 
(A) şematik empedans spektrum gösteren empedans büyüklüğü (Ω) ve faz kayması (°) frekans (Hz), elektrik empedans spektroskopisi cips hücreleri (düz çizgi) olmadan ve hücreleri (kesik çizgi) üzerinde için tipik karşı. Dört ana bölgeleri vardır, her hakim: çift katman kapasitans elektrotlar, kültür orta direniş, hücre bariyer direnç ve hücre zarının kapasite. "Bölge" ilgi hücre katmanı katkısını quantified (kırmızı ok) nerede olabilir gösterir. (B) en iyi kanal dirençler R1 ve R3, alt kanal dirençler R2 ve R4 ve membran ve EC bariyer direnç Rmgösterilen çipin eşdeğer direnç devre. (C) şematik üst kanala kültürlü endotel hücreleri (EC) gösterilen kesit. (D) en iyi şematik BBB chip elektrotlar yapılandırmasını ve hangi aracılığıyla empedans ölçülür 0,25 mm2 kültür alanında gösterilen. (E) temsilcisi empedans spectra boş bir çipin hücre kültür orta ile dolu. (F) temsilcisi empedans spectra bir çipin hangi hCMEC/D3 içinde beyin endotel hücreleri 3 gün boyunca kültür vardı. (G) dört elektrot tüm altı kombinasyonlar arasında ölçülen Dirençleri üzerinden AYLARININ hesaplamak için formül. Yazdırılan ve adapte ile izninden Elsevier. 16 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig2large.jpg" target="_blank">büyük vers görmek için buraya tıklayın lütfen</a>Bu rakam iyon.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig3.jpg"> 
Şekil 3: Temsilcisi AYLARININ BBB-on-chip geliştirilmesi. 
(A) AYLARININ ortalama ± standart hatasını dört BBBs-üstünde-bir plato 22 ± 1.3 Ω cm2 (ortalama ± SEM) ulaşan cips kültür süresi üç gün boyunca ortalaması (SEM). Karşılaştırma için veri boş fiş, değişim ve fiş değerini AYLARININ hücreleri ile karşılaştırıldığında aynı döneminde marjinal değişim ve 0 Ω cm2 sapma gösteren kullanılır. (B) Floresans mikroskobu, lekeli çekirdeği endotel, PDMS ve membran ilave belirtilen konumda hem sürekli bir monolayer ortaya koydu. (C) ayirt sıkı kavşak protein Zonula Occludens-1, BBB özgü sıkı kavşak hücreler arasında ölçülen AYLARININ çıkmasına gösteren varlığı saptandı. Yazdırılan ve adapte ile izninden Elsevier. 16 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Bu yayın entegre elektrotlar transendothelial elektrik direniş (AYLARININ) doğrudan miktar için bir organ-on-chip cihazı imalatı açıklar. Doğrulama, kan - beyin bariyerini bu mikrosıvısal cihazın içinde taklit ve bariyer fonksiyonu izlenir. Elektrot entegrasyon ve doğrudan AYLARININ miktar için sunulan yöntemleri genel olarak geçerlidir.

İmalat ve Organ-on-chip sistemin doğrudan Transendothelial elektrik direncini ölçmek için entegre elektrotlar ile doğrulama

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Bu videonun genel amacı, transendotelyal veya transepitelyal elektrik direnci ölçümleri veya TEER ölçümleri için entegre elektrotlu mikro akışkan çiplerin nasıl üretileceğini ve kullanılacağını göstermektir. Bu, mikro-akışkan çipte bir kan-beyin bariyeri kullanılarak gösterilmiştir. Bu yöntem, örneğin entegre elektrotlar kullanarak kan-beyin bariyeri dokusunun bariyer fonksiyonunun doğrudan ölçülmesini sağlayarak Çip Üzerinde Organlar alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Tekniğimizin temel avantajı, elektrotların Organ-on-Chip sistemlerine kolayca entegre edilebilmesi ve bunun sonuçlarının farklı sistemler arasında karşılaştırılabilmesidir. Bu teknolojinin etkileri, sağlık ve hastalık, ilaç keşfi ve kişiselleştirilmiş tıpta kan-beyin bariyeri işlevini anlamaya kadar uzanır. Bu yöntem kan-beyin bariyeri işlevi hakkında bilgi sağlamak için kullanılabilse de, Çip Üzerinde Akciğer ve Çip Üzerinde Bağırsak gibi diğer Çip Üzerinde Organ sistemleri bağlamında da kullanılabilir.Bu işleme başlamak için 27 gram PDMS baz maddesini ve 2.7 gram sertleştirici maddeyi iyice karıştırın. Daha sonra hava kabarcıklarını gidermek için karışımı bir desikatörde yaklaşık 45 dakika gazdan arındırın. Bu arada, kalıbın etrafına şeffaf bant yapıştırarak kalıbı sıvı PDMS karışımı için hazırlayın veya kalıbı uygun bir gofret tutucusuna yerleştirin.Gazı alınmış PDMS karışımını kalıba dökün. Daha sonra, PDMS karışımını 60 santigrat derecede bir fırında dört saat kürleyin ve daha sonra soğumaya bırakın. Çapraz akışlı bir davlumbazda, kürlenmiş PDMS'yi kalıptan çekin.PDMS'deki kesme çizgilerini kullanarak PDMS replikasını ayrı üst ve alt talaş parçalarına kesin. Bunu takiben, giriş ve çıkışları oluşturmak için bir milimetre çapında keskin bir biyopsi zımbası kullanarak üst kısımlara dört delik açın. PDMS kalıntılarının çipte birikmesini önlemek için içeriden dışarıya doğru zımbalayın.Ardından, talaş parçalarını toza karşı korumak için şeffaf bantla örtün. Daha sonra, polikarbonat membranları transwell eklerinden yaklaşık üç ila üç milimetre karelik kareler halinde kesin. Bundan sonra, gözenekli bir membran ile arayüzlenmiş iki katmanlı bir cihazı monte etmek için iki PDMS parçası arasına sızıntı yapmayan gözenekli bir membran monte edin.Bu amaçla, 0.7 gram PDMS baz maddesi, 07 gram kürleme maddesi ve 540 mikrolitre toluen kullanarak bir PDMS toluen harcı hazırlayın. Harcı iyice girdaplayın, ardından ince, homojen bir harç tabakası elde etmek için 200 mikrolitre harcı 1500 rpm'de 60 saniye boyunca bir cam lamel üzerine döndürün. Daha sonra, lamel tabakasından ince bir harç tabakasını bir mürekkep silindiri ile çipin alt kısmına aktarın.Alt kısmı fırına dayanıklı bir kaba koyun ve ardından harcı cipsin üst kısmına aktarın. Bir cımbız seti ile bir zarın kenarlarını spinli harcın içine batırın ve alt kısmın ortasına dikkatlice yerleştirin. Bunu takiben, hizalamaya dikkat ederek üst kısmı dikkatlice alt kısma yerleştirin.Talaşın içine toz girmesini önlemek için cips girişlerini şeffaf bantla kapatın ve 60 derecede üç saat pişirin. Bu adımda dikkatli olmak çok önemlidir. Harcın kanallara girmesini ve membranı tıkamasını önlemek için talaş üzerine baskı uygulamayın ve üst kısmı alt kısmın üzerine kaydırmayın.Elektrotları yan kanallara entegre etmek için, iki santimetre uzunluğunda parçalar halinde bir platin tel kesin. Ardından, 30 dakika boyunca asetona batırın. Daha sonra su ve etanol ile durulayın ve kurumasını bekleyin.Çapraz akışlı bir davlumbazda, plastik bir tabağa bir çip koyun. Bir cımbız kullanarak çipin elektrot kanallarına dört platin tel yerleştirin ve bir sonraki adımda tabağa sabitlemeyi sağlamak için bunları plastik tabağın üzerine bükün. 0,7 ila bir milimetrelik telleri, T şeklindeki kanal bağlantısını geçecek şekilde kültür kanalına yerleştirin.Daha sonra, elektrot kanalı girişine bir damla UV ile kürlenebilen yapıştırıcı uygulayın ve yapıştırıcının kanalı kılcal kuvvetlerle doldurmasına izin verin. Ardından, UV'yi açın ve elektrot kanalının sonuna ulaştığında yapıştırıcıyı sertleştirin. Dört entegre elektrotu iki bileşenli bir epoksi yapıştırıcı ile plastik kalıba sabitleyin.Bunu takiben, cipsleri şeffaf bantla örtün ve iki saat boyunca 60 santigrat derecede pişirin. Soğumalarını bekleyin ve kullanana kadar tozsuz bir şekilde saklayın. Hücre bağlanmasını teşvik etmek için çipleri kaplamak için, reaktifleri eklemeden önce her iki kanalı da PBS ile doldurun.Kanallarda hava kabarcığı olup olmadığını mikroskop altında kontrol edin. Eğer öyleyse, ekstra PBS ile yıkayarak bunları çıkarın. Daha sonra, her iki kanalı da PBS'de mililitre insan fibronektininde 30 mikrolitre 20 mikrogram ile doldurun.Onları üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra cipsleri endotelyal büyüme ortamı ile yıkayın ve iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, tüm elektrotların kanallardaki sıvı ile doğrudan temas halinde olduğundan emin olmak için boş talaşların TEER'ini ölçün.Bunu yapmak için, inkübatörden bir çip alın ve en az on dakika oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin. Çipin dışında elektro-köprülenmeyi önlemek için elektrotların etrafındaki plastik tabaktaki sıvıyı çıkarın. Daha sonra, iki elektrotun her kombinasyonu için empedans spektrumunu 200 hertz'den bir megahertz'e alın, bu da TEER'nin doğrudan belirlenebildiği beş ila on dakika içinde çip başına altı empedans spektrumu ile sonuçlanır.TEER ölçümünü doğrulamak için empedans spektrumlarının beklenen büyüklüklere ve şekillere sahip olup olmadığını kontrol edin. Şimdi, kültür ortamını birleşik tek katmanlı hcMEC / D3 hücreleri ile bir kültür şişesinden çıkararak üst kanala oturtulacak bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Bundan sonra, hücreleri PBS ile yıkayın.PBS'yi çıkarın ve ardından iki mililitre yüzde 05 tripsin EDTA ekleyin ve hücreler kültür şişesinden ayrılana kadar iki ila beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, tripsini yüzde 20 FBS ile desteklenmiş kültür ortamı ile devre dışı bırakın. Hücreleri sayın ve askıya alınan toplam sayılarını hesaplayın.Bu arada, hcMEC / D3 hücrelerini beş dakika boyunca 390 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve çipte santimetre kare başına 200 bin hücrelik bir tohumlama yoğunluğuna karşılık gelen mililitre başına beş milyon hücrelik bir konsantrasyonla sonuçlanacak şekilde hücre peletini uygun hacimde endotelyal büyüme ortamında yeniden askıya alın. Ardından, iyi karıştırılmış hücre süspansiyonunun 30 mikrolitresini üst kanala yavaşça pipetleyin ve yine de basınç uygularken pipeti akıcı bir hareketle girişten çıkarın.Tohumlama yoğunluğunu mikroskop altında kontrol edin. Üst kanal boyunca hücrelerin düzgün bir dağılımı sağlanmalıdır. Daha sonra cipsleri en az bir saat boyunca 37 santigrat derecede ve yüzde beş karbondioksitte inkübe edin.Daha sonra, bağlı olmayan hücreleri endotel kültür ortamı ile yıkayın. TEER'in kültür döneminde izlendiğini unutmayın. Bunlar, hücresiz ve hücreli çiplerde elektriksel empedans spektroskopisi için empedans büyüklüğünü ve faz kaymasını gösteren tipik şematik empedans spektrumudur.Elektrotlarda çift katmanlı kapasitans, kültür ortamı direnci, hücre bariyeri direnci veya hücre zarı kapasitansının hakim olduğu dört ana bölge vardır. İlgilenilen bölge, hücre katmanının katkısının nerede ölçülebileceğini gösterir. Ve bu, dört elektrotun altı kombinasyonunun tümü arasındaki ölçülen dirençlerden TEER'i hesaplama formülüdür.Burada gösterilen, üç günlük kültür periyodu boyunca 22 artı veya eksi 1.3 ohm santimetre karelik bir platoya ulaşan cipsler üzerindeki dört BBB'nin ortalama TEER'sidir. Karşılaştırma için, hücreli çiplerin TEER değerindeki değişime kıyasla aynı dönemde sıfır ohm santimetre kareden marjinal varyasyon ve sapma gösteren boş çiplerin verileri dahil edilmiştir. Lekeli çekirdeklerin floresan mikrokopisi, hem PDMS hem de iç kısımda belirtilen yerdeki membran üzerinde sürekli bir tek kat endotel tabakası ortaya çıkardı.İmmünofloresan, sıkı bağlantı proteini zonula'nın varlığını ortaya çıkardı, bunlardan biri hücreler arasındaki BBB'ye özgü sıkı bağlantıların ölçülen TEER'ye yol açtığını gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, Organs-on-Chips'te TEER ölçümleri için entegre elektrotlu çiplerin imalatı ve kullanımı hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu teknik, örneğin Alzheimer hastalığında doğrudan doğum ve hastalık özelliklerini incelemek için kan-beyin bariyeri araştırması alanında kullanılabilir.Bu prosedürü takiben, insan kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden farklılaşan beyin endotelinin bariyer fonksiyonu da kişiselleştirilmiş tıptaki uygulamalar için izlenebilir.

fabrication-validation-an-organ-on-chip-system-with-integrated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu video, in vitro olarak fare beyni mikrovasküler endotel hücrelerinde transendotelyal elektrik direncini (TEER) değerlendirmek için bir yöntemi göstermektedir. Yüksek bir TEER değeri, sağlam endotel hücre bağlantılarını gösterirken, aktive edilmiş T hücrelerinin eklenmesi, bağlantı bariyerinin bozulmasını yansıtan TEER değerini düşürür.

Transendotelyal Elektrik Direncinin İn Vitro Kan-Beyin Bariyeri Modelinde Değerlendirilmesi

Organik Elektrokimyasal Transistor canlı hücreler ile entegre ve mide-bağırsak epitelyal bariyer boyunca iyon akışı izlemek için kullanılır. Bu çalışmada, kalsiyum kenetleme maddesi EGTA (etilen glikol-bis (beta-aminoetil eter)-N, N, N ', N'-tetra asetik asit varlığı ile indüklenen sıkı birleşme bozulması ile ilişkili iyon akışında bir artış, asit), ölçülür.

Organik Elektrokimyasal Transistör Bariyer Doku bozulması ve Algılama

Burada, açıklar gerilebilir, Çift Kanal imalatı, organ çip mikrosıvısal hücre kültür cihazlar organ düzeyi işlevlerine içinde in vitrorecapitulating için bir iletişim kuralı mevcut.

Ölçeklenebilir gerilebilir, Çift kanal, mikrosıvısal Organ cips imalatı

Burada, transepitelyal/endotel elektriksel direnç ölçümleri için piyasada bulunan çubuk elektrotlarla kullanılabilen programlanabilir çıkış frekansına sahip ucuz bir volt-ampermetrenin nasıl kurulabileceğini gösteriyoruz.

Programlanabilir Çıkış Frekansı Ile Kendi Kendine Yapılmış Volt-Ampermetre Kullanarak TEER Ölçümlerini Gerçekleştirmek Için Basit Bir Yaklaşım

Kan-beyin bariyeri (BBB) sıkı beyin homeostazı düzenleyen bir çok hücreli nörovasküler birimdir. İnsan iPSC'leri ve çip üzerine organ teknolojilerini birleştirerek, hastalık modellemesi ve CNS ilaç penetrite tahminleri için uygun kişiselleştirilmiş bir BBB çipi ürettik. BBB çipinin üretimi ve işletimi için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır.

İnsan iPSC Tabanlı Kan-Beyin Bariyer Chip Üretimi

Bu protokol, çip üzerinde laboratuvar, mikroakışkan elektroporasyon cihazı oluşturmak için gereken mikrofabrikasyon tekniklerini açıklar. Deney düzeneği, sürekli bir akışta kontrollü, tek hücre düzeyinde transfeksiyonlar gerçekleştirir ve popülasyon tabanlı kontrol ile daha yüksek verimlere genişletilebilir. Hücre zarı geçirgenliğinin derecesini gerçek zamanlı olarak elektriksel olarak izleme yeteneğini gösteren bir analiz sağlanmıştır.

Sürekli akışlı, permeabilizasyon algılamalı mikro-elektroporasyon sisteminin imalatı ve işletilmesi

Biyopsi kaynaklı intestinal organoidler ve çip üzerinde organ teknolojileri, bölgeye özgü bağırsak işlevselliğini özetlemek için mikrofizyolojik bir platformda birleştirilir.

Bağırsak Bölgesine Özgü İşlevselliği Modellemek için İnsan Organoidlerini ve Çip Üzerinde Organ Teknolojisini Birleştirme

Köpek bağırsak organoidlerinin ve bir Çip Üzerinde Bağırsak mikroakışkan sisteminin entegrasyonu, insan bağırsak hastalıkları için ilgili translasyonel modeller sunar. Sunulan protokoller, bağırsağın 3D morfogenezine ve dinamik in vitro modellemesine izin vererek, köpeklerde ve insanlarda Tek Sağlık ile bağırsak hastalıkları için etkili tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olur.

İnflamatuar Bağırsak Hastalığı Hastalarından Türetilen Bağırsak Organoidleri Kullanılarak Çip Üzerinde Köpek Bağırsağında Üç Boyutlu Morfogenez

Bu çalışma, ince ve kalın bağırsaklardan türetilen 2D tek katmanlı domuz organoidleri oluşturmak için bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. Bu tek tabakaların büyümesi, sağlam epitel bütünlüğünü gösteren artan TEER değerleri ile işaretlenir. Ek olarak, bu tek tabakalar, forskolin uygulamasını takiben Ussing odası deneylerinde fizyolojik salgı tepkileri sergiler.

Doğal Bağırsağın Fizyolojik Özelliklerini Yansıtan İki Boyutlu Domuz Bağırsak Organoidleri

Burada, epitel dokusu homeostazının elektromekanik regülasyonunu incelemek için benzersiz bir iki katmanlı mikroakışkan cihaz üretmek için bir protokol sunuyoruz. Cihaz, doku düzlemine dik olarak statik fizyolojik elektrik akımları uygulayarak hücre-hücre yapışmasını, çoğalmasını ve ekstrüzyonunu etkiler. Canlı hücre görüntüleme ve mekanik stres ölçümleri, bu süreçlerin mekanizmalarını ortaya çıkarır.

İki katmanlı mikroakışkan cihaz kullanarak doku homeostazının elektromekanik kontrolünün ortaya çıkarılması

Öğrenin, entegre elektrotlarla organ-on-chip cihazı imalatını ve transendotelyal elektrik direnci (TEER) ölçümünü. Bu yöntem, kan-beyin bariyeri fonksiyonunu doğrudan izlemek için mikroakışkan teknolojisini kullanır.

İmalat ve Organ-on-chip sistemin doğrudan Transendothelial elektrik direncini ölçmek için entegre elektrotlar ile doğrulama

Daha fazla video keşfet