Name: Kitle yalıtım ve Intramolluscan insan kan Fluke Schistosoma Mansoni aşamalarında Vitro ekimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: Öğrenin Schistosoma mansoni miracidyalarının kitle yalıtımı ve in vitro kültür yöntemini. Bu protokol, şistozomiyaz araştırmalarında parazit biyolojisini anlamak ve hastalık kontrolüne katkı sağlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kısmen NIH grant RO1AI015503 tarafından finanse edilmektedir. Paraziti enfekte fareler, BEI kaynaklar üzerinden dağıtım için NIH NIAID sözleşme HHSN272201000005I NIAID sistozomyas Kaynak Merkezi Biyomedikal Araştırma Enstitüsü (Rockville, MD) tarafından verilmiştir.

Tüm hayvan bakımı ve deneysel prosedürler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Wisconsin-Madison Üniversitesi iletişim kuralı altında tarafından onaylanmış yok. V005717. Bu protokol için tasvir paraziti aşamaları hiçbiri insanlar ya da diğer memeliler infektif olmasına rağmen aşağıdaki protokol bir seviye 2 (BSL2) tesis insan patojenler için çalışan içerir. Risk grubu 2 (RG2) insan patojenleri işlemek için kurumsal ilkeleri uygulayın.
Not: Biz böylece daha büyük yumurta yükleri verimli enfeksiyon10, onların daha yüksek duyarlılık nedeniyle kadın Swiss-Webster fareler (6 - eski hafta) kullanın. Tucker ve ark. bu modeli sistem11' kullanılan fare ve salyangoz enfeksiyon iletişim kurallarını açıklar. Malzemeler tablo tüm özel ekipman, malzeme, reaktifler ve hayvansal kaynaklar bu deneysel protokol taşımak için gerekli listeler.
1. enfekte karaciğerleri işlenmesi
<ol><li>CO2 boğulma (dakika başına odası 's hacmi 10-%30 oranı) tarafından fareler, 6-7 hafta sonrası enfeksiyon, ötenazi. Fareler solunum ve kalp atışı kesilmesi için izleyin. Not: Genellikle, belirli bir zamanda 20 fareler kadar işlenmiş.</li>
	<li>Ötenazi fareler bir biyogüvenlik kabini aktarma sonra fare sırtlarını yerleştirin ve onların ventral yüzeyler % 70 etanol ile sprey. 1 dk. için emmek izin.</li>
	<li>Çimdik ve alt karın deri çekin ve boğumlu cilt Bankası arasında steril Cerrahi makas ile karın en yakın kesti. Çekin kesilen deri anteriorly (Yani, kafa doğru) karaciğer ortaya çıkarmak için. Karaciğeri genişlemiş ve bir yumurta kaynaklı Granülomatöz nedeniyle yanıt (şekil 2A) benekli olduğunu unutmayın.</li>
	<li>Karaciğer çıkarın ve 200 mL steril % 1.2 NaCl çözüm içeren kalem/strep içeren bir ölçek yerleştirin.</li>
	<li>1.3 ve 1.4 kalan fareler ile adımları yineleyin. Not: Yirmi fareler genellikle tek bir hasat işlenir.</li>
	<li>Karaciğer içinde steril Petri kabına yerleştirin ve sigara-karaciğer yağ/bağ dokusu ile steril forseps kaldırın.</li>
	<li>Kesilmiş/temizlenmiş karaciğerleri ~ 200 mL steril % 1.2 NaCl çözeltisi ile kalem/strep içeren bir steril 250 mL santrifüj şişe aktarın.</li>
	<li>Şiddetle karaciğerleri içeren şişe sallamak ve steril bir tek kullanımlık pipet kullanarak, köpük/yüzen enkaz fazla yüzey kaldırın. Yavaş yavaş bir konteyner içine kalan tuz solüsyonu dökün veya içeren % 1 çamaşır suyu (dezenfektan) batmak.</li>
	<li>Karaciğer için ~ 200 mL taze tuz çözeltisi ekleyin ve 1.8 üç kez daha tekrarlayın.</li>
</ol>2. karaciğer çıkarma ve miracidial yalıtım
<ol><li>Karaciğerleri küçük steril paslanmaz çelik blender fincan içine yerleştirin ve ~ 2 mL % 1.2 NaCl çözeltisi (şekil 2B) ekleyin.</li>
	<li>Kapak folyo ve sızıntıları önlemek ve 1 dk. için düşük ve yüksek hız (20 s düşük hız/10 s yüksek hızlı; tekrar) alternatif tarafından karışımı bir petri kupa (şekil 2C).</li>
	<li>(4 şişe 20 karaciğerleri kullanmak için) steril 250 mL santrifüj şişe karıştırılan karaciğer süspansiyon dağıtabilmenizi.</li>
	<li>Antibiyotik steril serum fizyolojik ~ 200 mL toplam birim/şişe için ekleyin. Tartmak/şişe Santrifüjü önce denge.</li>
	<li>Santrifüj 290 x g 4 oC. yavaşça, 15 dakika, karışım karaciğerleri supernatants atarak önce çamaşır suyu ile bir kaba dökün.</li>
	<li>2.4-2,5 bir kez yineleyin. Santrifüjü önce karaciğer tortu iyice resuspend emin olun.</li>
	<li>Son serum discarding sonra yıkayın (Adım 2.6), 200 mL steril Göl suyu ile kalem/strep pelleted karaciğer dokusu, tortu resuspend ve tamamen alüminyum ile kapsadığı steril 1-L volumetric flask süspansiyon aktarmak için sallamak için ekleyin folyo, üst boyun (şekil 2B) 3 cm dışında. Not: 1-L şişe iki şişe (10 karaciğerleri =) kullanın. Göl suyu miracidial damızlık yumurtadan uyarmak için gerekli doğal tatlı su ortamına benzeyen.</li>
	<li>Steril Göl suyu kullanarak, yaklaşık 3 cm boyunda kapsayan folyo yukarıda şişeye doldurun. Sonra gecikmeden (miracidia yakında başladığınızda yumurtadan), kalan köpük ve karaciğer dokusu yüzeye hızla ~ 12 mL kadar su birikintisi Su enkaz içeren pipetting tarafından yüzen kaldırmak ve ayrı bir atarak at tüp. Taze steril Göl suyu ile değiştirin.</li>
	<li>Tekrar temizlik adım 2.8, üç kez, miracidia at tüp varlığı için kontrol edin. Tekrarlama miracidia yıkama çözümde görünüyorsa, adım Temizleme keserler.</li>
	<li>Son yıkama sonra ~ 12 mL sıcak steril gölet su (30 oC önceden ısındı) üstüne ılık suyla temiz, steril bir sıcaklık gradyanı oluşturmak için yavaş yavaş ekleyin. Not: Bu en iyi yavaş yavaş karıştırma önlemek için şişe Boyun kenarındaki su boşaltma tarafından gerçekleştirilir.</li>
	<li>Balonun açılış üzerinde bir küçük Petri kabına kapağını yerleştirin ve şişeye su üst yüzeyi aydınlatmak için folyo kapak yukarıda üstünde parlak bir ışık. Not: Genellikle 5-10 dk içinde miracidia, ışığa, çekici yüzme çok sayıda Göl suyu (şekil 3A) içinde ilk 2-3 cm odaklanacaktır.</li>
</ol>3. Miracidial hasat ve işleme
<ol><li>10 dakika sonra yüzeyde miracidia topladığı zaman, steril transfer damlalıklı kullanarak ~ 8 mL Göl suyu ve steril 15 mL santrifüj tüpü transfer kaldırın. Miracidia buz üzerinde içeren tüp yerleştirin.</li>
	<li>Sıcak steril Göl suyu volumetric flask iç boyunca arka 8 mL ekleyin ve başka bir 10 dakika bekleyin.</li>
	<li>Her seferinde yeni borular kullanarak, 3.1 ve 3.2 üç kez daha arasındaki adımları yineleyin. 4th toplandıktan sonra buz miracidia yerleşmek izin vermek 10 dakika için son tüp tutun. Tüpler bu dizi ilk hasat oluşmaktadır.</li>
	<li>Miracidia 290 x g 4 oC önceden soğutulmuş soğutmalı santrifüj, 1 dk. için de içeren santrifüj tüpleri.</li>
	<li>Hemen parazit Pelet (şekil 3B) bozmamaya dikkat edin süpernatant (~ 7 mL) çoğunu kaldırın.</li>
	<li>Tüm miracidia gelen bu ilk hasat içine bir tüp, tüm orijinal tüpleri ~ 1 mL steril su birikintisi su ile durulayın ve "havuz" tüp eklemek Havuzu.</li>
	<li>Parazitler buza ~ 5 min için yerleşmek izin verir ve tekrar 290 x g 4 oC., 1 dk. için parazitlere santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Dikkatle süpernatant kaldırın ve 6-8 mL steril Chernin'ın dengeli tuz solüsyonu (CBSS +; bkz: malzemeler tablo) içeren kalem/strep ekleyin.</li>
	<li>Hafifçe miracidia ve onlara bir 24-şey kültür plaka (iyi başına 1 mL), takip tüp 6-8 mL CBSS + durulama ve her şey için durulama 1 mL ekleyerek aliquot askıya alma. 26 oC normoxic koşullar altında parazitlere kuluçkaya. İzole miracidia konsantrasyonları değişir, ancak genellikle ~ 7000/mL ortalamasını alır.</li>
	<li>Parazitler hala ışık kaynağından konsantre oldular adımları 3.1 3.9 için tarama geç miracidia hasat devam etmek için tekrar ancak 15-20 dk koleksiyonları arasındaki zaman aralığını artırın. Not: İkinci hasat tüpler bu yeni kümesini temsil eder. Ancak, miracidial numaraları genellikle düşük olduğundan, larvaları üzerinden tüm tüpler genellikle de 2 mL CBSS + içeren tek bir kültürün içine havuza.</li>
	<li>Yavaşça 24 h hasat sonrası ve yetiştirme, onların Wells sporocysts pipetting tarafından resuspend.</li>
	<li>Parazitler kuyuları altına yerleşmek izin vermek için birkaç dakika bekleyin. Bir kez onlar yerleşmiş, larva dönüştürme sırasında miracidia tarafından döken siliyer epidermal plakaları çoğunu içeren süpernatant (~1.5 mL), dikkatli bir şekilde çıkarın. Bu "dönüşüm" süpernatant ya atılan veya olabilir larva salgı ürünleri takip çalışmaları dahil.</li>
	<li>Taze CBSS + 1,5 mL her şey ve yavaşça pipet sporocysts resuspend ekleyin. Daha fazla yıkama veya farklı bir orta olarak değiştirmek isterseniz 3.12 adımları yineleyin.</li>
</ol>

<ol><li>Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. <a target="_blank" href="http://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(13)61949-2/abstract">Human schistosomiasis.</a> Lancet. 383, 2253-2264 (2014).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%3A+number+of+people+treated+worldwide+in+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Wkly.+Epidemiol.+Rec%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013.</a> Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).</li>
<li>Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A. Schistosoma sporocysts. <a target="_blank" href="https://www.routledge.com/Schistosoma-Biology-Pathology-and-Control/Jamieson/p/book/9781498744256">Schistosoma: biology, pathology and control</a>. Jamieson, B. G. M. , CRC Press. Boca Raton. 118-148 (2017).</li>
<li>Bayne, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+parasitism+of+vector+snail+Biomphalaria+glabrata+by+the+human+blood+fluke+%28trematode%29+Schistosoma+mansoni%3A+a+2009+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).</li>
<li>Yoshino, T. P., Coustau, C. Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYoshino%2C+TP+%22Biomphalaria+snails+and+larval+trematodes%22">Biomphalaria snails and larval trematodes</a>. Toledo, R., Fried, B. , Springer. New York. 159-189 (2011).</li>
<li>Coustau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+gastropod+immunity+from+the+study+of+the+interaction+between+the+snail+Biomphalaria+glabrata+and+its+parasites%3A+A+review+of+research+progress+over+the+last+decade%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade.</a> Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).</li>
<li>Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+molluscan+host+resistance+and+of+parasite+strategies+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival.</a> Parasitology. 123, S159-S167 (2001).</li>
<li>McMullen, D. B., Beaver, P. C. <a target="_blank" href="https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19462900219">Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae).</a> Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).</li>
<li>Voge, M., Seidel, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+in+vitro+of+miracidia+of+Schistosoma+mansoni+and+S.+japonicum+into+young+sprocysts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts.</a> J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).</li>
<li>Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+mortality%2C+pathophysiology%2C+and+susceptibility+differences+in+male+and+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice.</a> Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).</li>
<li>Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Proto+Immunol%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> Curr Proto Immunol. 103, 19.1:19.1.1-19.1.58 (2013).</li>
<li>Basch, P. F., DiConza, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miracidium-sporocyst+transition+in+Schistosoma+mansoni%3A+surface+changes+in+vitro+with+ultrastructural+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation.</a> J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).</li>
<li>Hansen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+daughter+sporocysts+of+Schistosoma+mansoni%3A+their+occurrence+and+cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).</li>
<li>Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosome+sporocyst-killing+amoebae+Isolated+from+Biomphalaria+glabrata%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invertebr.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata.</a> J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).</li>
<li>DiConza, J. J., Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axenic+cultivation+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts.</a> J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).</li>
<li>Hansen, E. L. A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHansen%2C+EL+%22Invertebrate+tissue+culture%3A+Research+applications%22">Invertebrate tissue culture: Research applications</a>. Maramorosch, K. , Academic Press. New York. 75-97 (1976).</li>
<li>Yoshino, T. P., Laursen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts+from+mother+sporocysts+maintained+in+synxenic+culture+with+Biomphalaria+glabrata+embryonic+%28Bge%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells.</a> J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).</li>
<li>Ivanchenko, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+in+vitro+propagation+and+differentiation+of+cultures+of+the+intramolluscan+stages+of+the+human+parasite+Schistosoma+mansoni%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).</li>
<li>Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molluscan+cells+in+culture%3A+primary+cell+cultures+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines.</a> Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).</li>
<li>Coustau, C., Yoshino, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flukes+without+snails%3A+Advances+in+the+in+vitro+cultivation+of+intramolluscan+stages+of+trematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes.</a> Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).</li>
<li>Milligan, J. N., Jolly, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cercarial+transformation+and+in+vitro+cultivation+of+Schistosoma+mansoni+schistosomules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules.</a> J. Vis. Exp. (54), e3191(2011).</li>
<li>Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+Schistosoma+mansoniin+vitro.+II+production+of+infertile+eggs+by+worm+pairs+cultured+from+cercariae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae.</a> J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Miracidia izole ve burada, açıklandığı gibi manipüle S. mansoni, sadece salyangoz ara ana bilgisayar enfekte olabilir ve bu nedenle insan bir biohazard larva gelişme bu aşamada temsil etmemektedir. Ancak, yanlışlıkla pozlama/in helezon bulaşmasını önlemek için duyarlı Biomphalaria salyangoz türleri mevcut veya tutulan nerede olabilir alanlardan farklı bir konumda miracidial izolasyonların gerçekleştirmek için özen gösterilmelidir. BSL2 alanı kayıtlı ayrı bir oda önerilir. Buna ek olarak, tüm yıkama kara...

İnsan flukes Schistosoma spp. kan, şistozomiyazis, ihmal edilen tropikal bir hastalık bir tahmini 230 milyon kişi dünya çapında1etkileyen etken ajanlardır. En yaygın tür, Schistosoma mansoni, Güney Amerika, Karayipler adalar, Orta Doğu ve alt-Sahra Afrika2coğrafi olarak dağıtılır. S. mansonive diğer schistosomes yaşam döngüsünün bir memeli kesin ana bilgisayar ve zorunlu ara konukçu olarak hizmet tatlı su Biomphalaria cinsi salyangoz içeren karmaşık bir şey.
S. mansoni erkek ve dişi yetişkin bağırsak mukoza küçük venüller içinde teslim olmak embryonated yumurta (ova) sürümü sonuçlanan yaşayan memeli ev sahibi çoğaltmak, posterior Mezenterik damarlarında çiftleri solucan. Yumurta sonra tatili gemi duvarları üzerinden Mukozal doku ile göç ve sonunda nerede dışkı ile hükümsüz intestinal Lümen girin. Ova tatlı su ve free-swimming larva (miracidia) kapağı girdiğinizde, onlar kısa sürede yaşam döngüsünün devam edebilmek için bulaştırmak için uygun bir Biomphalaria salyangoz bulmalısınız. Bu enfeksiyon işlem salyangoz'ın dış gövdesi yüzey aktif penetrasyon ve larva giriş ana bilgisayar takip miracidial eki içerir. Yakında girmesinden sonra miracidium sonraki larva sahne alanı, birincil ya da anne sporocyst'ın yeni dış yüzey (tegument) olacak bir syncytium formlar onun dış siliyer epidermal plakaları döken başlar. Eşeysiz üreme, her birincil sporocyst üretir ve ikinci nesil sporocysts, ikincil olarak adlandırdığı veya sırayla, oluşturmak ve son intramolluscan aşaması, cercaria3 çok sayıda yayın kızı sporocysts bültenleri . Salyangoz ana bilgisayardan kaçış, free-swimming cercariae için bağlama ve doğrudan bir insan veya diğer uygun memeli ana cildin derinlemesine yeteneğine sahiptirler. Yeni ev sahibi girdiği, üzerine cercariae parazit schistosomula Sahne Alanı'na dönüştürmek ve damar sistemi istila. Onlar, buna karşılık, akciğer ve sonra nerede yetişkin solucanlar için olgun, erkek ve dişi çiftleri oluşturmak ve onların yaşam döngüsünü tamamlamak için Mezenterik damarların seyahat hepatik ven göç.
Başarılı intramolluscan veya larva schistosomes gelişimi "Salyangoz aşama" için insan ana bilgisayar ana bilgisayar veri aktarımı döngüsünün devamlılık esastır. Salyangoz ev sahibi ve birincil sporocyst sahneye erken dönüştürmenin içine free-swimming miracidium dönem aşağıdaki girdiyi kritik önem taşımaktadır. Fizyolojik ve immünolojik arasında uyumluluğu sağlamak bağlı olarak ev sahibi ve parazit, larva gelişme bu aşamada o ilk başarı veya başarısızlık enfeksiyonlarına eğilimli kararlı4,5,6 kurmak için öyle . Birincil sporocysts sonra insan Enfektif cercariae oluşturmak, ikincil sporocysts eşeysiz üretebilen sonraki gelişimi daha fazla gereken tüm asıl olayın asalağın büyüme için sağlar bir keyfi fizyolojik ana ortamı ve üreme ihtiyacı var.
Bugüne kadar küçük temel hakkında fizyolojik, biyokimyasal bilinir ve moleküler süreçler, paraziti-salyangoz etkileşimleri kontrol özellikle molekülleri ve yollar larva gelişme ve üreme düzenleyen veya oransal olarak dahil ana bilgisayar bağışıklık yanıtı. Larva bu aşamaların deneysel düzenleme izni vitro kültür koşullar altında çok sayıda hazır erişim büyük gelişim yolları keşfi ve hücre büyüme, farklılaşma temel mekanizmaları kolaylaştırmak ve üreme. Kritik parazit yolları veya vitro deneyler tespit mekanizmaları, sonra larva büyüme/üreme salyangoz konak bozabilir ya da salyangoz konak immün mekanizmalar tanıma ve ortadan kaldırılması yer belirlemek için kullanılabilir miracidial veya sporocyst aşamaları.
Bu makale ve video sunumu, free-swimming S. mansoni çok sayıda izole bir yöntem ayrıntılı bir açıklama sağlamak için giriş sonra takip için deneysel tabi vitro kültür içine miracidia manipülasyon (iletişim kuralı iş akışı şematik bir bakış için bkz: şekil 1 ). Her ne kadar benzer yordamlarda açıklandığı daha önce7,8,9, biz ayrıntılı bir protokol bu modeli hala cevaplanmamış soruları ile ilgili gidermek için istihdam etmek isteyen araştırmacılar için yararlı olacağını hissettim intramolluscan larva geliştirme, hücresel proliferasyonu ve paraziti-salyangoz bağışıklık etkileşimleri. Buna ek olarak, bu yaklaşım kolayca mesane-konut S. haematobium, karaciğer flukes veya akciğer kuyruk gibi tıbbi açıdan önemli diğer trematodes yumurtadan yalıtım için adapte.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Chernin'in dengeli tuz çözeltisi (CBSS+)</güçlü></td><td></td><td></td><td><güçlü>1L çözelti için</güçlü></td></tr><tr><td>2,8 g sodyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Kalsiyum klorür hariç tuzları çözün ve&nbsp;</td></tr><tr><td>0.15 g potasyum klorür&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>şekerleri 800 mL ddH2O</td></tr><tr><td>0.07 g sodyum fosfat, dibazik susuz</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>Kalsiyum klorürü 200 nbsp'de ayrı ayrı çözün;</td></tr><tr><td>0.45 g magnezyum sülfat heptahidrat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td>mL ddH2O</td></tr><tr><td>0.53 g kalsiyum klorür dihidrat&nbsp;</td><td>Mallinckrodt</td><td>4160</td><td>Tuz/şeker soluna yavaş yavaş kalsiyum soln ekleyin&nbsp;</td></tr><tr><td>0.05 g sodyum bikarbonat&nbsp; &nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td>sürekli karıştırma ile</td></tr><tr><td>1 g glikoz</td><td>MP Biyomedikal</td><td>152527</td><td>pH 7.2'ye ayarlayın ve a&nbsp kullanarak filtre sterilize edin;</td></tr><tr><td>1 g trehaloz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td>0.22 ve mikro; m tek kullanımlık şişe üstü filtre</td></tr><tr><td>10 mL 100X penisilin / streptomisin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Filtrelenmiş penisilin ve streptomisin soln&nbsp; önceki kullanım</td></tr><tr><td><güçlü>Eksik Bge&nbsp; orta (Ibge)</güçlü></td><td></td><td></td><td><güçlü>900 mL çözelti için</güçlü></td></tr><tr><td>220 mL Schneider' s Drosophila ortamı modifiye</td><td>Lonza</td><td>04-351Q</td><td>Schneider'in ortamını 680 mL ddH2O</td></tr><tr><td>4.5 g laktalbümin enzimatik hidrolizat</td> ile karıştırın <td>Sigma-Aldrich</td><td>L9010</td><td>Laktalbümin hidrolizatı ve galaktoz ekleyin</td></tr><tr><td>1.3 g galaktoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0625</td><td>pH 7.2'ye ayarlayın ve 0.22 & mikro kullanarak filtreyle sterilize edin; m önceden sterilize edilmiş tek kullanımlık şişe üstü filtre</td></tr><tr><td><güçlü>Komple Bge ortamı (cBge)</güçlü><</td><td></td><td></td><td>güçlü>100 mL çözelti için</güçlü</td></tr><tr><td>>90 mL Eksik Bge ortamı</td><td></td><td></td><td>FBS'yi ısıyla etkisiz hale getirmek için: çözülmüş FBS'yi inkübe edin&nbsp;</td></tr><tr><td>9 mL ısı etkisi. fetal sığır serumu (FBS) (Optima)</td> <td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>su banyosu 60 ° C'de; Nazikçe iken 1 saat C&nbsp;</td></tr><tr><td>1 mL 100X penisilin / streptomisin</td><td>Şişeyi</td> her 10 dakikada bir döndürmek <td>SV30010</td><td> Aliquot ısıyla inaktive edilmiş FBS'yi 15 mL'lik tüplere & ve -20°C.&nbsp; Orta + FBS ve filtreyi karıştırın, 0.22 & mikro kullanarak sterilize edin; m önceden sterilize edilmiş&nbsp; tek kullanımlık şişe üstü filtre&nbsp; Kullanmadan önce penisilin ve streptomisin ekleyin</td></tr><tr><td><güçlü>Havuz suyu (stok çözeltisi)</güçlü></td><td></td><td></td><td><güçlü>1L stok çözeltisi</güçlü></td></tr><tr><td>12,5 g kalsiyum karbonat</td><td>Fisher Scientific</td><td>C64-500</td><td>Tüm tuzları 1L ddH2O</td></tr><tr><td>1.25 g magnezyum karbonat</td> ile karıştırın <td>Fisher Scientific</td><td>M27-500</td><td>Tuzların tamamen tükenmeyeceğini unutmayın&nbsp;</td></tr><tr><td>1.25 g&nbsp; sodyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>çözünmüş. Askıya almak için kuvvetlice çalkalayın&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>0.25 g&nbsp; potasyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>tuzları yapılmadan önce soln&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>< güçlü > Havuz suyu (çalışma çözeltisi), < / güçlü ></td><td></td><td></td> <td>< güçlü > 1.5L çözelti< / güçlü</td></tr><tr><td>>0.8 mL stok çözeltisi havuz suyu (önceki kullanımdan önce sallayın) içinde&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td>Stoku ddH2O</td></tr><tr><td>1500 mL ddH2O</td><td></td><td></td> ile karıştırın <td>Havuz suyunu otoklavlayarak sterilize edin (yavaş&nbsp; döngü)</td></tr> <tr><td>1.5 mL 100X penisilin / streptomisin & nbsp;</td><td>Hidroklon</td><td>SV30010</td><td>Önceki kullanımdan önce penisilin ve streptomisin ekleyin</td></tr><tr><td><güçlü>Tuzlu su çözeltisi (% 1.2 NaCl)< / güçlü ></td><td></td><td></td> <td>< güçlü>1.5L çözelti< / güçlü ></td></tr><tr><td>18 g sodyum klorür 1500 mL ddH2O</td> içinde <td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td> 1.5 mL 100X penisilin / streptomisin Hiplin <td>sterilize etmek için otoklav tuzlu su çözeltisi</td></tr><tr><td></td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Kullanmadan önce penisilin ve streptomisin ekleyin</td></tr><tr><td><güçlü>Ek ekipman ve malzeme:&nbsp; </güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-L fare ötenazi odası</td><td></td><td></td><td>Onaylanmış IACUC protokolünün ardından V001551</td></tr><tr><td>Fareler</td><td>Taconic Biosciences</td><td></td><td>Swiss-Webster, dişi, 6 haftalık yaşlı, murin&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>CO2 tankı ve regülatör</td><td></td><td></td><td>patojen içermeyen</td></tr><tr><td>24 oyuklu doku kültürü plakası</td><td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>1-L hacimsel şişeler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Işık kaynağı (150W)</td><td>Chiu Tech Corp</td><td>Model F0-150</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj, soğutmalı, sallanan kova</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj şişeler (250 mL)</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL santrifüj tüpleri, steril</td><td>Corning</td><td>430053</td><td></td></tr><tr><td>Steril tek kullanımlık transfer pipetleri&nbsp;</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>1371120</td><td></td></tr><tr><td>0.22 & M Önceden Sterilize Edilmiş Tek Kullanımlık Şişe Üstü Filtre&nbsp;</td><td>EMD Millipore SCGPS05RE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz çelik blender</td><td>Waring Ticari</td><td>Model 51BL31</td><td></td></tr><tr><td>Blender kabı, 100 mL kapasiteli</td><td>Waring Ticari Ters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bileşik mikroskop</td><td>Nikon Instruments&nbsp;</td><td>Tutulma TE300</td><td></td></tr></tbody></table>

kitle yalıtım ve intramolluscan insan kan fluke schistosoma mansoni aşamalarında vitro ekimi

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

İnsan kan flukes, Schistosoma spp., bir salyangoz ara ve memeli son ev sahibi içinde eşeysiz ve cinsel Gelişim aşamaları sırasıyla içeren karmaşık bir yaşam döngüsü var. İzole etmek ve farklı yaşam döngüsü aşamaları vitro kültür koşullar altında sürdürmek yeteneği büyük ölçüde araştırmalar parazit büyüme, gelişme ve ana bilgisayar düzenleyen hücresel, biyokimyasal ve moleküler mekanizmaları kolaylaştırdı etkileşimler. Sistozomyas iletimini eşeysiz üreme ve gelişme salyangoz ana bilgisayar içinde birden çok larva aşamaları gerektirir; Enfektif miracidium, insanlara infektif son cercarial aşaması için birincil ve ikincil sporocysts aracılığıyla. Bu yazıda biz kitle tarama ve izole Schistosoma mansoni miracidia yumurtadan karaciğerleri virüslü fareler ve onların sonraki giriş vitro kültür içine elde edilmesi için adım adım bir protokolü mevcut. Detaylı iletişim kuralı yeni araştırmacılar meşgul ve bu önemli alan paraziti araştırma genişletmek için teşvik edecek öngörülmektedir.

Miracidia büyük çoğunluğu genellikle ilk iki "Hasat" toplanmış. CBSS + izole miracidia kuluçka (Şekil 4A- C) miracidium sporocyst dönüşüm sürecini tetikler. İlk bir saat içinde CBSS +, yüzme miracidia kes (şekil 4A) çoğunluğu içeren aşağıdaki kültür aktarmak kuyuları. 6 h kültür, miracidia altındadır aktif onların siliyer epidermal plakaları (şekil 4B) dökülme sürecinde. Onlar için b...

Bu makalede büyük ölçekli axenic yalıtım ve insan kan fluke Schistosoma mansoni free-swimming miracidia toplanması için bir protokol ve onların sonraki işlem vitro kültür içine giriş için.

Kitle yalıtım ve Intramolluscan insan kan Fluke Schistosoma Mansoni aşamalarında Vitro ekimi

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

Bu videoda, serbest yüzme Schistosoma mansoni miracidia'nın büyük ölçekli kuluçka ve izolasyonu ve ardından in vitro kültüre giriş için ayrıntılı bir protokol anlatıyoruz. Schistosoma mansoni, dünya çapında iki yüz milyondan fazla insanı enfekte eden ve Schistosomiasis olarak bilinen ihmal edilen tropikal hastalığa neden olan dört ana kan fluke türünden biridir. Şistozom yaşam döngüsü, ara konakçılar olarak salyangozları ve kesin konakçılar olarak insanlar da dahil olmak üzere memelileri içeren karmaşıktır.Larva ve yetişkin şistozomların in vitro yetiştiriciliği, bu paraziter hastalığın kontrolü ve ortadan kaldırılmasına yönelik araştırmaları ilerletmek için paha biçilmez bir araçtır. Bu videoda, salyangozla enfekte olmuş mirasidiyel aşamayı içeren S.mansoni yumurtalarını üretmek için bir fare modeli kullanarak, karaciğerlerden geri kazanılan yumurtalardan ve bunların in vitro kültivasyonundan elde edilen miracidia'nın toplu izolasyonu için adım adım bir prosedür gösteriyoruz. Bu gösteride bana Nathalie Dinguirard ve Codie Heinemann yardımcı oluyorlar.Aşağıda, ekteki videoda ele alınacak üç ana adımı gösteren bir iş akışı şeması yer almaktadır. İlk bölümde, enfekte karaciğerlerin i

mass-isolation-vitro-cultivation-intramolluscan-stages-human-blood

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Cercarial Dönüşüm ve In vitro Yetiştiriciliği Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosoma mansoni yumurta T hücre tip 2 (Th2) immün yanıt, parazit enfeksiyonu karakteristik, astım ve allerjik inflamasyonun güçlü uyarıcılar vardır. Bu protokol S. kullanır CD4 Th2 sitokin bağlı inflamatuar yumurtanın etrafında akciğer granülom oluşumu ile karakterize, akciğerin yanıt, eozinofili ve makrofaj aktivasyonu alternatif oluşturmak için mansoni yumurta enjeksiyon.

Gelen Yumurta kullanma<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Bir şekilde<em&gt; In vivo</emHelmint bağlı Akciğer iltihabı ve&gt; Model

Bir<em&gt; In vitro</emOkumak&gt; Co-enfeksiyon Modeli<em&gt; Plasmodium falciparum</emİnsan İlköğretim Monosit kökenli Bağışıklık Hücrelerde&gt;-HIV-1 Etkileşimleri

Heligmosomoides polygyrus yakından yüksek yaygın insan helmint enfeksiyonu benzeyen güçlü bağışıklık yetenekleri ile bir kemirgen nematod olduğunu. Burada H. uzun vadeli bakım için bir protokol tarif polygyrus yaşam döngüsü.

Yetiştirme<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; Bir immunsupresif Nematodu Parazit ve Salgılanmış Ürünleri

Burada, dev virüslerin asfarvirüs ile ilgili yeni bir soyu olan Faustovirus'un yeni genotiplerinin karakterizasyonu için viral izolasyondaki en son gelişmeleri açıklıyoruz. Bu protokol, virüslerin, özellikle amipleri enfekte eden dev virüslerin yüksek verimli izolasyonuna uygulanabilir.

Kullanımı Çevre Örneklerinde Yeni Faustoviruses İzolasyonunda bir Hızlı Stratejisi<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

Deneysel serebral sıtmanın bir fare modelini tarif ediyoruz ve manyetik rezonans görüntüleme kullanılarak inflamatuar ve mikrovasküler patolojinin in vivo olarak nasıl izlenebileceğini gösteriyoruz.

Manyetik Rezonans Görüntüleme Kullanarak Deneysel Serebral Sıtma Bir Modelinde Ödem Gelişimi ve Mikrovasküler Patolojinin İn Vivo Takibi

Burada, Yetişkin Schistosoma japonicum vitro kültür ortamından izolasyonda ekstraselüler veziküller (EVs) açıklamak için bir iletişim kuralı mevcut.

Yalıtım ve yetişkin Schistosoma japonicum üzerinden ekstraselüler veziküller karakterizasyonu

Burada, sporozoitler veya ikinci nesil merozoitler nükleofekting tavuk Eimeria parazitlerin kararlı transfeksiyon elde etmek için bir yöntem sağladı. Heterolog antijenik genleri ifade eden genetiği değiştirilmiş eimerian parazitler aşı dağıtım aracı olarak kullanılabilir.

Tavuk Eimeria Parazitlerinin Nükleofeksiyon uyup In Vivo Propagation

Kriyo-elektron tomografisi için dalma dondurulmuş biyolojik örneklerden vitreus ızgara üzerinde lamel üretmek için odaklanmış iyon ışını frezeleme kullanımı.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması

Üçüncü nesil lentiviral vektörler kullanılarak Echinococcus granulosus'un farklı gelişim evrelerinde hızlı geçici transdüksiyon tekniğini tanımladık.

Echinococcus granulosus'un Strobilated Formlarının Geçici Transdüksiyonu

Burada, Echinococcus granulosus'tan in vitro kültür koşullarını, izolasyonu ve hücre dışı veziküllerin (EV'ler) artan oluşumunu açıklıyoruz. Küçük EV'ler, dinamik ışık saçılımı ve transmisyon elektron mikroskobu ile karakterize edildi. Kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerin tutulumu ve fenotipik modülasyonları, konfokal mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak incelendi.

Echinococcus granulosus'tan Küçük Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Dendritik Hücre Alımı

Öğrenin Schistosoma mansoni miracidyalarının kitle yalıtımı ve in vitro kültür yöntemini. Bu protokol, şistozomiyaz araştırmalarında parazit biyolojisini anlamak ve hastalık kontrolüne katkı sağlamak için kullanılır.

Kitle yalıtım ve Intramolluscan insan kan Fluke Schistosoma Mansoni aşamalarında Vitro ekimi

Daha fazla video keşfet