Memeli hücre bölünmesi yılında niceliksel Confocal yansıma mikroskobu ile 3D matrisler

Bu prosedürün genel amacı, memeli hücre bölünmesi ve hücre matrisi etkileşimlerini fizyolojik olarak ilgili bir 3D ortamda incelemektir. Bu tekniğin temel avantajı, memeli hücre bölünmesi ve hücre matrisi etkileşimlerini incelemek için verimli ve genel bir yaklaşım sağlamasıdır. Bu yöntem, normal ve hastalık dokusunun gelişiminin moleküler temeli gibi hücre biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Transfeksiyondan bir gün önce, 10 mililitre normal hücre kültürü ortamında 100 mililitrelik bir hücre kültürü kabında beş milyon HEK-293 T hücresi koyun. Bu hücreleri 37 santigrat derecede 24 saat boyunca% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. Ertesi gün, transfeksiyonlara başlamadan hemen önce, transfeksiyon reaktifinin bir şişesini dört santigrat dereceden çıkarın ve oda sıcaklığına ulaşması için dışarıda bırakın.

Daha sonra başlamak için, steril bir mikrofüj tüpüne bir mililitre azaltılmış serum ortamı ekleyin. Buna, transfeksiyon için kullanılan belirli miktarlarda lentiviral vektör plazmitleri ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Tüpü oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Beş dakika sonra, bu tüpe 48 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin ve pipetleyerek hafifçe karıştırın. Daha sonra, bu karışımı oda sıcaklığında en az 15 dakika inkübe edin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, HEK-293 T hücreleri içeren plakayı inkübatörden çıkarın.

Hazırlanan DNA transfeksiyon reaktif karışımını hücrelerin üzerine damla damla ekleyin ve plaka içinde eşit dağılımı sağlamak için plakayı hafifçe döndürün. Plakayı tekrar inkübatöre yerleştirin. Transfeksiyondan yaklaşık altı saat sonra, plakayı çıkarın ve ortamı aspire edin.

10 mililitre taze kültür ortamı ekleyin ve plakayı tekrar inkübatöre aktarın. Transfeksiyondan 24, 48 ve 72 saat sonra birden fazla zaman noktasında, lentiviral partikülleri içeren kültür ortamını ayrı tüplerde hasat edin. Daha sonra, hücresel kalıntıları gidermek için hasat edilen kültür ortamını steril bir 0.45 mikron filtreden süzün.

Her hasattan sonra taze kültür ortamı ile değiştirin. Lentiviral partikülleri içeren süzüntü, hemen transdüksiyon için kullanılabilir veya eksi 80 santigrat derecede saklanabilir. İnsan meme karsinomu hücreleri MDA-MB-231'i normal kültür ortamında 35 milimetrelik bir kültür kabında plakalayın.

Bu hücreleri 37 santigrat derecede 24 saat boyunca% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. Ertesi gün, kültür ortamını plakadan aspire edin ve bir mililitre taze kültür ortamı ile birlikte bir mililitre lentiviral parçacık ekleyin. Hücreleri inkübatörde yaklaşık 16 saat inkübe edin.

Viral partiküllerle inkübasyon tamamlandıktan sonra, ortamı aspire etmek için plakayı çıkarın. Daha sonra iki mililitre taze ortam ekleyin ve 24 ila 72 saat boyunca inkübatöre geri aktarın. Bir epifloresan mikroskobu kullanarak bu dönüştürülmüş hücrelerde H2B-mCherry ekspresyonunu kontrol edin.

Senkronizasyon deneylerine başlamak için, önce 24 oyuklu bir plakada% 50 ila 60 birleşmede H2B-mCherry eksprese eden MDA-MB-231 hücrelerini plakalayın. Kültürü 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Ertesi gün, kültür ortamını iki milimolar Timidin içeren 0.5 mililitre ortamla değiştirin.

Plakayı 24 saat boyunca inkübatörde bırakın. Kuluçka tamamlandıktan sonra, hücreleri Timidin tedavisinden çıkarmak için PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra hücreleri inkübatörde beş saat boyunca 0.5 mililitre normal kültür ortamında bırakın.

Bundan sonra, bu hücreleri mitozda bloke etmek için, kültür ortamına Nokodazol ekleyin. Hücreleri 12 saat boyunca inkübatörde bırakın. Nokodazol tedavisi tamamlandıktan sonra, plakayı çıkarın ve bir orbital çalkalayıcı kullanarak, mitotik hücreleri serbest bırakmak için hücreleri 45 saniye ila bir dakika boyunca sallayın.

Daha sonra, ekstrakte edilen mitotik hücreleri içeren ortamı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra her oyuğa 0,5 mililitre taze ortam ekleyin. Ardından, hücrelerin çalkalanmasını ve çıkarılmasını iki kez daha tekrarlayın.

Toplanan toplam ortamı bir araya getirin ve ardından mitotik hücreleri peletlemek için santrifüjleyin. Döndürmeden sonra, hücre peletini 0.25 mililitre taze hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Bir hemositometre kullanarak, hücre sayısını sayın.

Bu adımın başında, 50 mililitre 10x DMEM solüsyonu hazırlayın ve filtreyle sterilize edin. Ardından, metin protokolünde belirtildiği gibi 3D kollajen matrisini yapmak için kullanılacak tüm bileşenlerin hacimlerini belirleyin. Kollajenin jelleşmesini yavaşlatmak için tüm bu bileşenleri buz üzerinde önceden soğutun.

Şimdi, önceden soğutulmuş 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne, gerekli sayıda hücreyi ortaya, ardından 10x DMEM, FBS, deiyonize su, kollajen ve son olarak sodyum hidroksit ekleyin. Bir mililitrelik pipet kullanarak dikkatlice karıştırın. Çözelti iyice karıştırıldıktan sonra, 24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 500 mikrolitre karışım ekleyin.

24 oyuklu plakayı 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. 30 dakika sonra plakayı çıkarın ve jelin üzerine 500 mikrolitre önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin. Görüntülemeden önce, faz kontrastı ve konfokal mikroskopların canlı hücre birimlerini açın.

Bölünen hücreleri yakalamak için, kollajen matrislerine gömülü hücreleri içeren 24 oyuklu plakayı floresan mikroskobunun canlı hücre ünitesine yerleştirin. 10X objektifi kullanarak, plakanın altını bulun ve ardından mikroskop plakanın altından yaklaşık 500 mikrometre uzağa odaklanana kadar yukarı hareket ettirin. Mitozun farklı aşamalarındaki hücreleri bulmak için sahneyi hareket ettirin ve görüntüleme için birden fazla konum seçin.

Timelapse deneyini iki dakikalık aralıklarla ayarlayın. Daha sonra, kollajen ağını görüntülemek için, konfokal mikroskobu yalnızca 488 nanometre lazerden yansıyan ışığı yakalayacak şekilde yapılandırın. Daha sonra kollajen matrislerindeki hücreleri içeren plakayı bu mikroskobun canlı hücre ünitesine yerleştirin.

Plakanın altını bulun ve ardından objektif merceği, plakanın altından yaklaşık 100 mikrometreye odaklanana kadar yukarı hareket ettirin. Hücreleri bulmak için sahneyi hareket ettirin ve görüntüleme için birden fazla konum seçin. Timelapse deneyini beş dakikalık aralıklarla ayarlayın.

Kollajen matrisine gömülü MDA-MB-231 hücresini eksprese eden bölünen bir H2B-mCherry hücresinin floresan görüntüleri burada gösterilmektedir. Mitozun farklı aşamaları beklendiği gibi kolayca gözlemlenir. Konfokal yansıma mikroskobu kullanılarak eş zamanlı olarak görüntülenen beyaz renkteki kollajen liflerinin dağılımı, mitoz bölünmesi sırasında çok az değişir.

Hücre senkronize G2-M fazı ve bir kollajen matrisine gömülü hücre bölünmesini ilk iki saat içinde tamamlarken, kontrol asenkron hücreler rastgele bölünür. İnterfaz ve mitotik fazlar sırasında kollajen liflerinin dağılımının ölçülmesi, matris deformasyonunun hücre bölünmesi sırasında minimal olduğunu ve interfaz hücrelerinde daha yüksek olduğunu göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, kararlı hücre hattının oluşturulmasından bir 3D matriste video hücresi bölünmesinin analizine kadar yedi gün içinde tamamlanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, canlı hücre görüntüleme kullanılarak 3B matrislerde memeli hücre bölünmesinin nasıl senkronize edileceğini ve izleneceğini ve konfokal yansıma mikroskobu ve kantitatif görüntüleme analiz tekniklerini kullanarak matris deformasyonunun nasıl belirleneceğini umarız iyi bir anlayışa sahipsinizdir.