Name: Memeli hücre bölünmesi yılında niceliksel Confocal yansıma mikroskobu ile 3D matrisler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Öğrenin, canlı hücre görüntüleme ve konfokal yansıma mikroskobu kullanarak 3D kollajen matrislerde memeli hücre bölünmesini ve hücre-matriks etkileşimlerini nasıl inceleyeceğinizi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser NIH tarafından desteklenen R01CA174388 ve U54CA143868 verir. Yazarlar Wei-tong Chen desteği için Johns Hopkins Üniversitesi'nden PURA ödülü kabul etmek istiyorum. Bu malzeme Ulusal Bilim Vakfı yüksek lisans araştırma bursu Grant No 1232825 altında tarafından desteklenen çalışma üzerine kuruludur.

Gelen doğrulama kuralları, Homewood kurumsal inceleme Kurulu (HIRB) izler.
1. H2B-mCherry hücre mitoz için sabit ifadesi bir Marker olarak
<ol><li>
İnsan embriyonik böbrek 293T lentiviral parçacıkları (HEK 293T) nesil hücreleri
	<ol>
<li>Bir 10 cm hücre kültür yemek 5 x 106 hücreler/çanak hücre kültür orta (Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) içeren yüksek glikoz (4,5 g/M), sodyum pyruvate, %10 Fetal sığır Serum (FBS) ve % 1 yoğunluğu, HEK 293T hücrelerdeyse plaka penisilin-streptomisin (kalem/Strep)). 37 ° C ve %5 karbondioksit (CO2), 24 h için kuluçkaya. İstenen confluency hücre transfection gününde yaklaşık 70-%80 olduğunu. Not: HEK 293T hücreler burada daha sonra MDA-MB-231 hücre transduce stabil H2B-mCherry ifade bir hücre satırı oluşturmak için kullanılacak viral parçacıkların üretmek için kullanılır. Hücreleri plaka eşit olarak dağıtılır emin olun. Ek hücre plaka bilge bırak ve yavaşça hareket ileri geri plaka bile dağıtım yardımcı olabilir. Hücreleri de tabak veya viral parçacıkların farklı birimler koleksiyonda neden olur diğer boyutlarda şişeler numaralı seribaşı.</li>
		<li>Transfection reaktifi (lentiviral vektör, CMV ΔR 8.91 ve pMDG-VSVG) üç Plasmid'ler ile kullanarak HEK 293T hücre transfect. H2B-mCherry kodlama plazmid phosphoglycerate kinaz organizatörü (PGK) ile lentiviral bir vektör klonlanmış. CMV ΔR 8.91 üç gerekli HIV genleri, gag, polve reviçerir. pMDG-VSVG VSV-G zarf gen içerir. Not: Ajanlar seçim için birden fazla transfection.<ol>
<li>Oda sıcaklığında (RT) ulaşmak için transfection reaktif şişe önce kullanılsın. Ters Çevir'i veya girdap şişeyi kısaca.</li>
			<li>Mix 16 µg H2B-mCherry plazmid 6 µg, CMV ΔR 8.91 8 µg ve pMDG-VSVG, düşük serum medya 1 ml 2 µg oluşan DNA. RT 5 min için kuluçkaya. Not: Miktar ve oran üç vektörlerin çeşitli ve farklı lentiviral transfer vektörel çizimler için en iyi duruma getirilmiş.</li>
			<li>48 µL ekleyin (DNA oranı 1:3 kullanın: transfection reaktif) Yukarıdaki DNA çözüm içine transfection reaktif ve en az 15 dakikadır RT kuluçkaya. Not: DNA transfection reaktif vs oranını çeşitli ve farklı lentiviral transfer vektörel çizimler için en iyi duruma getirilmiş. Transfection reaktif 1,5 mL santrifüj tüpü tarafında ile değil emin olun.</li>
			<li>1.1.2.3. adımda drop-wise hücrelere yapılan DNA-lipid karmaşık çözüm ekleyin. Yavaşça plaka da komplekse eşit dağılımı sağlamak için plaka girdap.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Yaklaşık 6 h transfection sonra orta Aspire edin ve taze hücre kültür orta ekleyin (DMEM yüksek glikoz (4,5 g/M), sodyum pyruvate, %10 FBS ve % 1 kalem/Strep).</li>
		<li>Hasat süpernatant 24, 48 ve 72 h sonrası transfection. Her hasat sonrası orta yerine (DMEM, 4,5 g/M glikoz, %10 FBS ve % 1 ile sodyum pyruvate kalem/Strep).</li>
		<li>Lentiviral parçacıklar hücresel enkaz kaldırmak için 0,45 µm filtre ile filtre. Alternatif olarak, hücre artıkları ayırmak için süpernatant aşağı spin. Süpernatant iletim için hemen kullanılabilir veya-80 ° C'de depolanan</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücre nesil stabil ifade H2B-mCherry hatları Not: Bu protokol MDA-MB-231 hücreler için ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Deneyinde kullanmadan önce insan meme Karsinomu hücre MDA-MB-231 (fiziksel bilimler Onkoloji Merkezi, NIH) yüksek glikoz (4,5 g/M), sodyum pyruvate, %10 FBS ve % 1'i içeren DMEM kültürlü kalem/Strep.<ol>
<li>MDA-MB-231 hücre yoğunluğu 1 x 105 hücre bir 35 mm kültür tabak, plaka. Not: Farklı hücre hatları için kaplama yoğunluğu optimize edilmelidir ve bu nedenle MDA-MB-231 hücre için en uygun yoğunluğu farklı olabilir.</li>
		<li>hücreleri, kaplama sonra 24 h eklemek virüs ve taze orta 1 mL 1 mL (DMEM, yüksek glikoz (4,5 g/L), sodyum pyruvate, %10 FBS ve % 1 kalem/Strep).</li>
		<li>Hücreleri bir gecede 6 h dönem için kuluçkaya. Not: Her iki virüs ve hacmi kuluçka süresi farklı hücre hatları için optimize edilmiş olması gerekir. Hücreleri bir kaç saat sonra virüs ilavesi sağlıklı görünmüyor, örneğin, 1 mL virüs ve 2 mL taze orta kullanın (DMEM, yüksek glikoz (4,5 g/L), sodyum pyruvate, %10 FBS ve % 1 kalem/Strep) için adım 1.2.2. 1.2.3. adımda kuluçka süresini de azalır.</li>
		<li>Orta Aspire edin ve taze orta 10 mL ekleyin (DMEM, yüksek glikoz (4,5 g/M), sodyum pyruvate, %10 FBS ve % 1 kalem/Strep). CO237 ° C ve %5 24-72 saat arasında için kuluçkaya.</li>
		<li>H2B-mCherry bir epifluorescence mikroskop kullanarak hücrelerdeki ifade denetleyin. Not: iletim verimliliği hücrelerde düşükse, virüs adım 2.2 ve adım 2.3 kuluçka zamanında hacmi artmış.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. stabil H2B-mCherry ifade hücreleri eşitlenmesi
<ol><li>50-%60 confluency, Yani plaka 2 x 104 MDA-MB-231 hücre hücreleri 24-şey plaka her kuyuya plaka.</li>
	<li>Kültür 37 ° C ve % 5 CO2 24 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Büyüme orta orta 0.5 mL ile değiştirin (DMEM, yüksek glikoz (4,5 g/L), sodyum pyruvate, %10 FBS ve % 1 kalem/Strep) 2 mM timidin içeren ve 24 saat için kuluçka bırakın. Not: timidin için maruz hücreleri hücre büyümesini (G1) aşamasında tutuklandı / DNA sentezi (S) geçiş ve S-faz DNA sentezi inhibisyonu nedeniyle boyunca. Kuluçka süresini çeşitli ve farklı hücre hatları için optimize edilmiştir.</li>
	<li>Timidin pozlama hücrelerden fosfat tamponlu tuz (PBS) ile üç kez yıkayarak serbest bırakın. O zaman, normal hücre kültür orta hücrelerde kuluçkaya (DMEM, yüksek glikoz (4,5 g/M), sodyum pyruvate, %10 FBS ve % 1 kalem/Strep) 5 h için. Not: Sağlar hücreleri serbest timidin maruz kalma hücrelere hücre büyümesini (G2) ilerleme / Mitotik (M) faz hücreler için daha önce G1/S aşamasında tutuklandı ve daha önce tutuklandı S hücreler için G1 aşama aşama. Yayın süreyi çeşitli ve farklı hücre hatları için optimize edilmiştir.</li>
	<li>Nocodazole 12 h için 250 ng/mL hücrelerle engelleyin. Not: Nocodazole için maruz hücrelerin tümünü G2/M aşamasında tutuklandı. Nocodazole sitotoksik. Uzun süre maruz kalmak nocodazole apoptosis neden olabilir. Hücre ölüm gözlenen nokta veya pozlama farklı hücre hatları için konsantrasyon ayarlayın. Başarılı bir şekilde eşitlenir hücreleri küresel bir Morfoloji sergileyecek.</li>
	<li>45 için hücreleri sallamayın s 1 dk 150 ila 200 devir / dakikada bir orbital Çalkalayıcı kullanarak. Not: küçük substrat bağlılığı var, Mitotik hücre işlemi sırasında sarsılmış.</li>
	<li>Hücreleri, bir santrifüj tüpüne orta pipetting tarafından ayıklamak için orta kaldırın ve sonra 0.5 mL taze orta ekleyin (DMEM, yüksek glikoz (4,5 g/L), sodyum pyruvate, %10 FBS ve % 1 kalem/Strep) plaka için her şey.</li>
	<li>2.6 ve 2.7 üç kez arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>800 x g 3 dk de Mitotik hücre içeren toplanan orta santrifüj kapasitesi. Not: Bu adımı nocodazole hücre ortamından kaldırmak için kullanılır.</li>
</ol>3. birleşme eşitlenmiş hücreleri kollajen ben matrisler
Not: Tip ı kollajen insan vücudu ve bağ dokusu ECM en bol protein ve bu nedenle yaygın olarak nasıl ökaryotik hücre fonksiyonları bir 3D çevre17,23tarafından,24 modülasyonlu araştırmak için kullanılır . Kollajen Asetik asit çözünür. Nötralize ve kollajen çözüm 20-37 ° c ısınma sonra kollajen monomerleri kollajen liflerinde meshwork polimerize.
<ol><li>10 x DMEM çözüm DMEM toz, sodyum bikarbonat (NaHCO3) 3.7 g ve 1 g 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES) 50 mL distile su içinde bir paket çözülerek hazırlayın. Çözüm filtre uygulamak ve sonra sodyum hidroksit (NaOH) 1 M 2 g NaOH Pelet 50 ml distile su ile çözülerek hazırlamak. Filtre ve aliquot çözüm 1.5 mL santrifüj tüpleri içine. Not: Bu adımda Normal DMEM çözüm kullanılmamalıdır. Kollajen çözümün önemli toplu ilavesi orta seyreltik. Bu nedenle konsantre DMEM çözüm DMEM kollajen matris son konsantrasyonu normal DMEM aynı olmasını sağlamak amacıyla hazırlanmıştır.</li>
	<li>Adım 2,9 toplanan hücre ile çalışmaya devam. Orta ve yeniden askıya alma hücrelerinin yaklaşık 0,25 - 0,5 mL taze hücre kültür ortamının Aspire edin (DMEM, yüksek glikoz (4,5 g/L), sodyum pyruvate, %10 FBS ve % 1 kalem/Strep). Not: belirli hücre yoğunluğu kollajen matris ulaşmaya, süspansiyon hücrelerde ilk yoğunluğu çok düşük olamaz. Böylece, hücreleri yeniden askıya alma için kullanılan orta hacmi toplam kullanılabilir hücre sayısına bağlı olacaktır.</li>
	<li>Bir hemasitometre ve sayısı çözüm hücrelerde yoğunluğu 3.2. adımdaki yeniden askıya alınan hücre çözümü yer 10 µL.</li>
	<li>
3D kollajen matris yapmak tüm bileşenler için gerekli birimleri belirleyin. 2 µg/µL kollajen jel 500 µL kullanılır burada örnek olarak.
	<ol>
<li>40.000 hücre/mL (veya kollajen jel 500 µL için 20.000 hücreleri) elde etmek için gereken hücre çözümü hacmi hesaplamak. X. 50 µL 10 x DMEM gerekli µL bu sayısıdır. FBS 50 µL gerekli olacaktır.</li>
		<li>Ben stok kollajen hacmi hesaplamak. Kollajen konsantrasyonu ben 4 µg/µL olduğunu. Kollajen µL içinde Y miktarıdır.</li>
		<li>Sodyum hidroksit hacmi gereksinimini kollajen çözümde Asetik asit nötralize etmek hesaplamak: Y µL kollajen * 0.023 * 1000 = Z µL NaOH gerekli.</li>
		<li>Dolgu çözüm hacmi belirlemek: (500 µL toplam jel - X µL hücreleri - 50 µL 10 X DMEM - FBS 50 µL - Y µL kollajen - Z µL NaOH) R µL = Not: Dolgu çözüm distile su. Dolgu çözüm hesaplanan birim negatif bir sayı ise, özgün hücre yoğunluğu hücre süspansiyon çok düşüktür. Hücreleri aşağı tekrar döndü ve orta küçük bir hacim içinde yeniden askıya gerekir (DMEM, yüksek glikoz (4,5 g/L), sodyum pyruvate, %10 FBS ve % 1 kalem/Strep).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bileşenleri aşağıdaki sırayla temiz 1.5 mL santrifüj tüpü ekleyin: Orta, 10 x DMEM, FBS, deiyonize su (DI), kollajen, NaOH hücrelerde. Tüm bileşenleri kollajen çözüm jelleşme yavaş Buza koyun. Kabarcıklar oluşumunu önlemek için uygun pipetting tekniklerini kullanın.</li>
	<li>NaOH ekledikten sonra çözüm ile 1 mL damlalıklı dikkatlice karıştırın. Not: Kollajen jelleşme hemen NaOH eklenmesinden sonra doğru başlar. Karıştırma dikkatli ve hızlı bir şekilde yapılmalıdır.</li>
	<li>Çözüm de karışınca çözümün 500 µL 24-şey plaka her şey için ekleyin. 24-şey plaka 37 ° C kuluçka makinesine koyun. Taze hücre kültür ortamın 37 ° C su banyosu içinde. Not: Plastik alt plaka düşük-büyütme canlı hücre microcopy çalışma mesafesi lensin cam plakalar yüksek büyütme yaşamak-cep mikroskobu yüksek kısa çalışma mesafesi nedeniyle kullanılan 1 mm. alt yukarıda olduğu için kullanılır büyütme objektif.</li>
	<li>Önceden ısıtılmış orta 500 µL ekleyin (DMEM, yüksek glikoz (4,5 g/M), sodyum pyruvate, %10 FBS ve % 1 kalem/Strep) jel adım 3.7 tamamladıktan sonra 30 dk dön.</li>
</ol>4. canlı hücre görüntüleme 3D kollajen matrisler (düşük büyütme) bölünmesi hücre
Not: Görüntü hücre 2 dk aralıklarla 10 X amacı ile donatılmış ve görüntüleme yazılımı tarafından kontrollü faz kontrast mikroskop monte bir ücret eşleşmiş cihaz (CCD) kamera ile toplanır.
<ol><li>Üstünde tepe-in objektif lens monte canlı hücre birimi açın. Sıcaklığı 37 ° C'de stabilize, CO2 konsantrasyonu % 5 ve nem % 75 kadar bekleyin.</li>
	<li>Mikroskop canlı hücre biriminde jelleri 24-şey tabak koyun. Alt plaka ve plaka derinliklerinden gelen yaklaşık 500 µm, mikroskop odaklanır kadar objektif lens hareket ettirin. Not: yakın alt plaka değil tamamen gömülü 3D Matris hücreleri kollajen matris. Alt plaka uzak 500 µm olan hücreler Imaging hücrelerin kenar efektleri16tarafından,17,25etkilenmez sağlayacaktır.</li>
	<li>Civarında hücreleri bulmak için sahne taşımak ve görüntüleme için çoklu konumlarını seçin.</li>
	<li>2-dk aralıklarla hızlandırılmış deneme ayarlayın. Not: En fazla 2 dk aralığında alınabilir konum sayısı motorlu sahne hareket hızını ve esir alma imge için pozlama süresi uzunluğu ile sınırlıdır.</li>
</ol>5. kollajen ağ deformasyon hücre bölünmesi (yüksek büyütme mikroskobu) sırasında
<ol><li>Üstünde tepe-in objektif lens monte canlı hücre birimi açın. Sıcaklığı 37 ° C'de stabilize, CO2 konsantrasyonu % 5 ve nem % 75 kadar bekleyin.</li>
	<li>Günahı 3D kollajen matrisler kollajen lifler görselleştirmek için yalnızca yansıyan ışık (488-nm) örnek aydınlatmak için kullanılan 488-nm lazer yakalamak için confocal mikroskop yapılandırın. Lazer bir 60 X su-daldırma amaç, NA kullanır = 1.2, WD = 200 µm ve görüntüleme yazılımı tarafından kontrol edilir.</li>
	<li>Örnek (kollajen Matris hücrelerinde) canlı hücre birim içine koymak. Alt plaka ve plaka derinliklerinden gelen yaklaşık 100 µm, mikroskop odaklanır kadar objektif lens hareket ettirin. Alt plaka uzak 100 µm olan hücreler Imaging hücrelerin kenar efektleri tarafından etkilenmez sağlayacaktır. Not: su-daldırma amaç burada bir petrol-daldırma lens yerine çalışma mesafesi petrol-daldırma lens sadece yaklaşık 100 µm olduğu için kullanılır. Cam alt plaka kalınlığı normalde yaklaşık 100 µm olarak petrol-daldırma lens kullanımı bir sorun teşkil etmektedir.</li>
	<li>Civarında hücreleri bulmak için sahne taşımak ve görüntüleme için çoklu konumlarını seçin. Not: Confocal mikroskobu optik örnek kesitler ve sadece odak düzlemi sinyallerini yakalar. Canlı hücreleri hızlandırılmış deneme sırasında odak içinde ve dışında hareketli olabilir. Hücre görüntülerini uzun bir süre içinde yakalama etkinleştirmek için Z-yığın görüntüleri izleyen dilimleri 5 µm aralıklarla toplamak için kullanılır. Toplam 25 µm kapsayan 5 dilim görüntüsü.</li>
	<li>5 dk aralıklarla hızlandırılmış deneme ayarlayın. Not: 5 dakika kullanılır burada 2 dk Floresans H2B-mCherry, yansıma kollajen için tarama ve Z-yığın tarama, için tarama dahil olmak üzere birden fazla tarama modu her konuma uygulandığından 4 bölümde kullanılan yerine aralığı olarak. Birden fazla tarama modu kullanımı düşük büyütme Imaging'e karşılaştırıldığında bir pozisyon tarama hızını azaltır.</li>
	<li>Kollajen matris bir hücre parçacık velosimetri (PIV) alt piksel çözünürlük20Imaging kullanarak bu hücre tarafından sarf güçleri nedeniyle civarında deformasyon ölçmek. 2D görüntülerde bu çözümlemesini H2B mCherry ve kollajen lifler her iki sinyali Açık görselleştirme için sağlar. Kollajen ağ20sinyal artırmak için filtreleme anisotropic düşük geçiş uygulayın.</li>
	<li>İlgi (x,y) yer alan bir görüntü alt bölgesinin yerel deplasman çerçeve k k+ 1 çerçeve, 15 × 15 bölgesel bir pencere ayıklamak için ölçmek için piksel kare k(x,y) merkezli. En iyi Mekanlar (x,y) eşleşen belirlemek * maksimum normalleştirilmiş çapraz korelasyon katsayısı çerçeve k+ 1 elde edilen görüntü özelliği mekanlar arasında. Deformasyon vektör (x,y) hesaplanır *-(x,y).</li>
</ol>

<ol><li>Ly, D. H., Lockhart, D. J., Lerner, R. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+misregulation+and+human+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitotic misregulation and human aging.</a> Science. 287 (5462), 2486-2492 (2000).</li>
<li>Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+anti-mitotic+drugs+kill+cancer+cells%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?</a> J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).</li>
<li>Brinkley, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+the+centrosome+numbers+game%3A+from+chaos+to+stability+in+cancer+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Managing the centrosome numbers game: from chaos to stability in cancer cell division.</a> Trends Cell Biol. 11 (1), 18-21 (2001).</li>
<li>Phillip, J. M., Aifuwa, I., Walston, J., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanobiology+of+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">The Mechanobiology of Aging.</a> Annu Rev Biomed Eng. 17, 113-141 (2015).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Martin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ablation+or+inhibition+of+stromal+matrix+metalloproteinase-9+on+lung+metastasis+in+a+breast+cancer+model+is+dependent+on+genetic+background%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of ablation or inhibition of stromal matrix metalloproteinase-9 on lung metastasis in a breast cancer model is dependent on genetic background.</a> Cancer Res. 68 (15), 6251-6259 (2008).</li>
<li>Knox, J. J., Hotte, S. J., Kollmannsberger, C., Winquist, E., Fisher, B., Eisenhauer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+II+study+of+Triapine+in+patients+with+metastatic+renal+cell+carcinoma%3A+a+trial+of+the+National+Cancer+Institute+of+Canada+Clinical+Trials+Group+%28NCIC+IND.161%29%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+New+Drugs%22%5BJournal%5D)">Phase II study of Triapine in patients with metastatic renal cell carcinoma: a trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group (NCIC IND.161).</a> Invest New Drugs. 25 (5), 471-477 (2007).</li>
<li>Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D. L., Fojo, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+targeting+mitosis%3A+tales+of+how+great+drugs+against+a+promising+target+were+brought+down+by+a+flawed+rationale%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibitors targeting mitosis: tales of how great drugs against a promising target were brought down by a flawed rationale.</a> Clin Cancer Res. 18 (1), 51-63 (2012).</li>
<li>Tong, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+and+pharmacologic+study+of+SNS-032%2C+a+potent+and+selective+Cdk2%2C+7%2C+and+9+inhibitor%2C+in+patients+with+advanced+chronic+lymphocytic+leukemia+and+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I and pharmacologic study of SNS-032, a potent and selective Cdk2, 7, and 9 inhibitor, in patients with advanced chronic lymphocytic leukemia and multiple myeloma.</a> J Clin Oncol. 28 (18), 3015-3022 (2010).</li>
<li>Matulonis, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+II+study+of+MLN8237+%28alisertib%29%2C+an+investigational+Aurora+A+kinase+inhibitor%2C+in+patients+with+platinum-resistant+or+-refractory+epithelial+ovarian%2C+fallopian+tube%2C+or+primary+peritoneal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase II study of MLN8237 (alisertib), an investigational Aurora A kinase inhibitor, in patients with platinum-resistant or -refractory epithelial ovarian, fallopian tube, or primary peritoneal carcinoma.</a> Gynecol Oncol. 127 (1), 63-69 (2012).</li>
<li>Boss, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+evaluation+of+AZD1152%2C+an+i.v.+inhibitor+of+Aurora+B+kinase%2C+in+patients+with+solid+malignant+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinical evaluation of AZD1152, an i.v. inhibitor of Aurora B kinase, in patients with solid malignant tumors.</a> Ann Oncol. 22 (2), 431-437 (2011).</li>
<li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+complex+3D+tissue+physiology+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Capturing complex 3D tissue physiology in vitro.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 211-224 (2006).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li>
<li>Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix%3A+a+dynamic+niche+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression.</a> J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).</li>
<li>Giri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arp2%2F3+complex+mediates+multigeneration+dendritic+protrusions+for+efficient+3-dimensional+cancer+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The Arp2/3 complex mediates multigeneration dendritic protrusions for efficient 3-dimensional cancer cell migration.</a> FASEB J. 27 (10), 4089-4099 (2013).</li>
<li>Fraley, S. I., Feng, Y., Giri, A., Longmore, G. D., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimensional+and+temporal+controls+of+three-dimensional+cell+migration+by+zyxin+and+binding+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dimensional and temporal controls of three-dimensional cell migration by zyxin and binding partners.</a> Nat Commun. 3, 719(2012).</li>
<li>Fraley, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinctive+role+for+focal+adhesion+proteins+in+three-dimensional+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility.</a> Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).</li>
<li>Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+forces+regulate+cell+division+in+three-dimensional+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments.</a> J Cell Biol. 205 (2), 155-162 (2014).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+3D+matrix+confinement+determines+division+axis+through+cell+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Local 3D matrix confinement determines division axis through cell shape.</a> Oncotarget. 7 (6), 6994-7011 (2016).</li>
<li>Held, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellCognition%3A+time-resolved+phenotype+annotation+in+high-throughput+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">CellCognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging.</a> Nat Methods. 7 (9), 747-754 (2010).</li>
<li>Fallica, B., Maffei, J. S., Makin, G., Zaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+cellular+behavior+and+response+to+PI3K+pathway+inhibition+by+culture+in+3D+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Alteration of cellular behavior and response to PI3K pathway inhibition by culture in 3D collagen gels.</a> PLoS One. 7 (10), e48024(2012).</li>
<li>Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+a+three-dimensional%2C+microarray+environment+on+human+Cell+culture+in+drug+screening+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems.</a> Biomaterials. 33 (35), 9087-9096 (2012).</li>
<li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+in+three-dimensional+collagen+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cells in three-dimensional collagen matrix.</a> Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-20 (2010).</li>
<li>Gunzer, M., Kampgen, E., Brocker, E. B., Zanker, K. S., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+dendritic+cells+in+3D-collagen+lattices.+Visualisation+of+dynamic+interactions+with+the+substratum+and+the+distribution+of+surface+structures+via+a+novel+confocal+reflection+imaging+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Migration of dendritic cells in 3D-collagen lattices. Visualisation of dynamic interactions with the substratum and the distribution of surface structures via a novel confocal reflection imaging technique.</a> Adv Exp Med Biol. 417, 97-103 (1997).</li>
<li>Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+cytoskeletal+organization+of+invasive+cancer+cells+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D.</a> J Vis Exp. (80), e50763(2013).</li>
<li>Lleres, D., James, J., Swift, S., Norman, D. G., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+chromatin+compaction+in+living+cells+using+FLIM-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of chromatin compaction in living cells using FLIM-FRET.</a> J Cell Biol. 187 (4), 481-496 (2009).</li>
<li>Poincloux, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+of+the+cell+rear+drives+invasion+of+breast+tumor+cells+in+3D+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Contractility of the cell rear drives invasion of breast tumor cells in 3D Matrigel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (5), 1943-1948 (2011).</li>
<li>Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+control+of+invasive+tumor+cell+behavior+by+extracellular+matrix+microarchitecture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture.</a> Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).</li>
<li>Langan, T. J., Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+mammalian+cell+cultures+by+serum+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation.</a> Methods Mol Biol. 761, 75-83 (2011).</li>
<li>Jackman, J., O'Connor, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+synchronizing+cells+at+specific+stages+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for synchronizing cells at specific stages of the cell cycle.</a> Curr Protoc Cell Biol. 8, (2001).</li>
<li>Zwanenburg, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+shake-off+to+synchronize+cultured+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Standardized shake-off to synchronize cultured CHO cells.</a> Mutat Res. 120 (2-3), 151-159 (1983).</li>
<li>Harper, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+cell+populations+in+G1%2FS+and+G2%2FM+phases+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle.</a> Methods Mol Biol. 296, 157-166 (2005).</li>
<li>Kihara, T., Ito, J., Miyake, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+biomolecular+diffusion+in+extracellular+matrix+condensed+by+fibroblasts+using+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Measurement of biomolecular diffusion in extracellular matrix condensed by fibroblasts using fluorescence correlation spectroscopy.</a> PLoS One. 8 (11), e82382(2013).</li>
<li>Ramanujan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+and+convection+in+collagen+gels%3A+implications+for+transport+in+the+tumor+interstitium%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium.</a> Biophys J. 83 (3), 1650-1660 (2002).</li>
<li>Harjanto, D., Maffei, J. S., Zaman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+effect+of+cancer+invasiveness+and+collagen+concentration+on+3D+matrix+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the effect of cancer invasiveness and collagen concentration on 3D matrix remodeling.</a> PLoS One. 6 (9), e24891(2011).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li>
<li>Petroll, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+interference+contrast+and+confocal+reflectance+imaging+of+collagen+organization+in+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Differential interference contrast and confocal reflectance imaging of collagen organization in three-dimensional matrices.</a> Scanning. 28 (6), 305-310 (2006).</li>
<li>Fraley, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+matrix+fiber+alignment+modulates+cell+migration+and+MT1-MMP+utility+by+spatially+and+temporally+directing+protrusions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional matrix fiber alignment modulates cell migration and MT1-MMP utility by spatially and temporally directing protrusions.</a> Sci Rep. 5, 14580(2015).</li>
<li>Ikeda, Y., Collins, M. K., Radcliffe, P. A., Mitrophanous, K. A., Takeuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transduction+efficiency+in+cells+of+different+species+by+HIV+and+EIAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene transduction efficiency in cells of different species by HIV and EIAV vectors.</a> Gene Ther. 9 (14), 932-938 (2002).</li>
<li>Ma, H. T., Poon, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of HeLa cells.</a> Methods Mol Biol. 761, 151-161 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Hücre bölünmesi 3D önceki çalışmada deneysel sınırlamalar ve teknik sorunlar18,19nedeniyle verimli değildi. Memeli hücre bölünmesi 3D kollajen matrisler içinde verimli çalışması için kritik adımlar şunlardır: (1) birleşme Floresans etiketli Mitotik işaretleri hücrelere; (2 eşitlenmesi hücre bölünmesi; ve (3) 3D matrisler canlı hücre görüntüleme tekniği, confocal yansıması zaman çözüldü mikroskobu ve nicel görüntüleme analizi kullanarak bölümü olayları izleme....

Hücre mitoz hangi tür ile doku ve organ gelişiminde çok önemli rol oynar hücresel hayatında önemli bir olay var. Anormal mitoz doğal genetik varyasyonları, insan yaşlanma süreçlerini ve kanser1,2,3,4,5ilerlemesini karıştığı. Normal hücreleri ile karşılaştırıldığında tümör hücrelerinin çoğalması artış oranı kanser hücre davranışları oldukça heterojen değişik tümörler arasında ve hastalar arasında bile aslında rağmen işaretlerinden biridir. Preklinik umut verici sonuçlar rağmen klinik6,7,8,9,10 ' etkili olabilmesi için bazı yeni geliştirilen antimitotic ilaçlar gösterememiştir ,11. Deneysel ve Preklinik modellerin ilgisi dikkate alınması gereken vardır. Üç boyutlu (3D) matrisler, fibroblastlar ve kollajen bakımından zengin 3D bağ doku hücrelerinde Fibrosarkom ve 3D stromal hücre dışı Matriks (ECM) metastatik kanser hücreleri gibi içinde adl tip-in normal memeli ve kanser hücreleri bölün. Ancak, memeli hücre bölünmesi deneyleri ve deneyleri büyük çoğunluğu iki boyutlu (2D) yüzeyler üzerinde kültürlü hücreleri üzerinde gerçekleştirilmiş. Bir mühendislik 3D matris daha iyi Mikroyapı, mekanik özellikleri ve her iki normal ve patolojik doku12,13,14, 3D ECM biyokimyasal sinyalleri özetlemek 15,16,17.
Nasıl memeli hücre bölünmesi çalışmanın düzenlenmiştir 3D ortamlar fizyolojik alaka ve terapötik önemi18,19rağmen büyük ölçüde keşfedilmemiş kalır. Teknik sorunlar ve deneysel zorluklar 3D matris hücre bölünmesi eğitimi ile ilişkili olası nedenler. Hücre mitoz bütün hücre döngüsü20küçük bir zamansal bölümü kabul ettiğiniz anlamına gelir. Önceki çalışma olduğunu göstermiştir bu insan meme adenokarsinom MCF-7, insan osteosarkom U2OS ve insan karaciğer gibi birçok memeli hücrelerinin proliferasyonu oranı HepG2, çok daha düşük 2D yüzeylerde21, onların meslektaşları ile karşılaştırıldığında 3D matris içinde 22. Ayrıca, 3D matris içinde gömülü hücreler odak içinde ve dışında canlı hücre görüntüleme sırasında geçiş yapar. Tüm bu faktörlerin hücre bölünmesi olayları görüntüleme teknikleri kullanarak 3D kültüründe yakalama son derece düşük verimlilik katkıda bulunur.
ECM ve hücreler arasındaki etkileşimler hücre bölünmeler düzenlenmesinde önemli rol oynarlar. Burada, verimli bir şekilde 3D kollajen matrisler memeli hücre bölünmesi çalışmaya bir yaklaşımı açıklamak. Hücreleri, hücre bölünmesi eşitlenmesi yanı sıra 3B matrisleri kullanarak canlı hücre görüntüleme tekniği, confocal yansıması zaman çözüldü mikroskobu, bölünme olayları izleme Mitotik işaretleri birleşme yöntemi içerir ve nicel analiz görüntüleme. Floresans etiketli Histon protein H2B ilk hücrelere Mitotik ayırt etmek ve hücreleri Interphase bir işareti olarak tanıtıldı. Sonra hücreleri timidin engelleme ve nocodazole tedavi, bir mekanik sallamak-off tekniği ile takip birleşimini kullanarak eşitlenir. Eşitlenmiş hücreleri sonra doğrudan 3D kollajen matrisler kapsüllü. Birden çok hücre hücre bölünmesi olaylar verimli bir şekilde düşük-büyütme hızlandırılmış canlı hücre Imaging'i kullanma izlenir. Hangi hücre-matris etkileşim bir göstergesidir, deformasyon kollajen liflerinin confocal yansıma mikroskobu yüksek-büyütme oranında kullanarak izlenir.
Biz daha önce önce sırasında ve sonrasında iki metastatik kanser hücre hatları, insan invaziv duktal Karsinom MDA-MB-231 ve 3D kollajen insan Fibrosarkom HT1080 hücrelerinde mitoz hücre-matris etkileşim ölçmek ve izlemek için bu teknik kullandık matrisler19. Burada sunulan yöntemleri her iki memeli hücre bölünmesi 3D çevre ve hücre-matris etkileşimleri çalışmaya verimli ve genel bir yaklaşım sağlar. MDA-MB-231 hücre satırı kağıt boyunca bir örnek olarak kullanılır. Bu iletişim kuralı gelişimi normal doku ve hastalıkların moleküler temeli yeni anlayışlar sağlar ve ayrıca yeni tanı ve tedavi yaklaşımları tasarımı için izin verebilir.

<table><tbody><tr><td>İnsan embriyonik böbrek 293T</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>Fiziksel Bilimler Onkoloji Merkezi, NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM tozu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12100-046</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin 100X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>11668-07</td><td></td></tr><tr><td>Bir lentiviral vektörde H2B-mCherry'yi kodlayan plazmid</td><td>Addgene</td><td>plazmidi 21217</td><td></td></tr><tr><td>Timidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895</td><td></td></tr><tr><td>Nokodazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>GibcoBRL</td><td>11810-025</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>113375-100</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T. Bake</td><td>3722-01</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV şırınga filtre ünitesi, 0.45-&mu; m, PVDF, 33 mm</td><td>Kırlangıç</td><td>SLHVM33RS</td><td></td></tr><tr><td>Nikon TE2000E epifloresan mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>TE2000E</td><td></td></tr><tr><td>Cascade 1K CCD kamera</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements AR görüntüleme yazılımı</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1 konfokal mikroskop</td><td>Nikon</td><td>A1</td><td></td></tr></tbody></table>

memeli hücre bölünmesi yılında niceliksel confocal yansıma mikroskobu ile 3d matrisler

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

Nasıl memeli hücre bölünmesi çalışmanın düzenlenmiş bir 3D çevre onun fizyolojik alaka ve tedavi edici öneme rağmen büyük ölçüde keşfedilmemiş kalır. Keşif eksikliği için olası nedenler deneysel sınırlamalar ve hücre bölünmesi çalışma 3D kültüründe verimsiz hale teknik zorluklar nelerdir. Burada, verimli bir şekilde çalışma memeli hücre bölünmesi ve 3D kollajen matrisler etkileşimlerde hücre-matris bir görüntüleme tabanlı yöntemi açıklanmaktadır. Floresan H2B ile etiketli hücreleri timidin engelleme ve nocodazole tedavi, bir mekanik sallamak-off tekniği ile takip birleşimini kullanarak eşitlenir. Eşitlenmiş hücreleri sonra 3D kollajen matris gömülür. Hücre bölünmesi yaşamak-cep mikroskobu kullanılarak izlenir. Deformasyon sırasında ve sonra hücre bölünmesi, hücre-matris etkileşim bir göstergesidir, kollajen liflerinin izlenebilir ve nicel confocal yansıma mikroskobu kullanılarak sayılabilir. Memeli hücre bölünmesi ve hücre-matris etkileşimleri fizyolojik ilgili 3D ortamında çalışmaya verimli ve genel bir yaklaşım yöntemdir. Bu yaklaşım sadece gelişimi normal doku ve hastalıkların moleküler temeli roman ilgili bilgiler sağlar, ama aynı zamanda yeni tanı ve tedavi yaklaşımları tasarımı için sağlar.

Bu makalenin amacı 3D matris işlemlerinde memeli hücre bölünmesi çalışmaya ve sırasında ve sonra hücre bölünmesi hücre ve 3D hücre dışı matriks arasındaki etkileşimler ölçmek için görüntüleme tabanlı yöntem sunmaktır. Hücre mitoz görüntüleme kolaylaştırmak için biz lentiviral iletim kullanarak MDA-MB-231 hücrelere H2B-mCherry dahil. Floresan proteinler ile Birleşik H2B Mitotik bir işareti olarak Mitotik hücre Interphase hücrelerden ayırt etmek ve farklı aşamaları sırasında hücre mitoz<sup...

Bu iletişim kuralı verimli çalışmalar 3D kollajen matrisler memeli hücre bölünmesi hücre bölünmesi, eşitlenmesi entegre ederek 3B matrisleri canlı hücre görüntüleme tekniği, confocal yansıması zaman çözüldü mikroskobu kullanarak bölümü olayların izlenmesi ve nicel analiz görüntüleme.

Memeli hücre bölünmesi yılında niceliksel Confocal yansıma mikroskobu ile 3D matrisler

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Bu prosedürün genel amacı, memeli hücre bölünmesi ve hücre matrisi etkileşimlerini fizyolojik olarak ilgili bir 3D ortamda incelemektir. Bu tekniğin temel avantajı, memeli hücre bölünmesi ve hücre matrisi etkileşimlerini incelemek için verimli ve genel bir yaklaşım sağlamasıdır. Bu yöntem, normal ve hastalık dokusunun gelişiminin moleküler temeli gibi hücre biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Transfeksiyondan bir gün önce, 10 mililitre normal hücre kültürü ortamında 100 mililitrelik bir hücre kültürü kabında beş milyon HEK-293 T hücresi koyun. Bu hücreleri 37 santigrat derecede 24 saat boyunca% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. Ertesi gün, transfeksiyonlara başlamadan hemen önce, transfeksiyon reaktifinin bir şişesini dört santigrat dereceden çıkarın ve oda sıcaklığına ulaşması için dışarıda bırakın.Daha sonra başlamak için, steril bir mikrofüj tüpüne bir mililitre azaltılmış serum ortamı ekleyin. Buna, transfeksiyon için kullanılan belirli miktarlarda lentiviral vektör plazmitleri ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Tüpü oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Beş dakika sonra, bu tüpe 48 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin ve pipetleyerek hafifçe karıştırın. Daha sonra, bu karışımı oda sıcaklığında en az 15 dakika inkübe edin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, HEK-293 T hücreleri içeren plakayı inkübatörden çıkarın.Hazırlanan DNA transfeksiyon reaktif karışımını hücrelerin üzerine damla damla ekleyin ve plaka içinde eşit dağılımı sağlamak için plakayı hafifçe döndürün. Plakayı tekrar inkübatöre yerleştirin. Transfeksiyondan yaklaşık altı saat sonra, plakayı çıkarın ve ortamı aspire edin.10 mililitre taze kültür ortamı ekleyin ve plakayı tekrar inkübatöre aktarın. Transfeksiyondan 24, 48 ve 72 saat sonra birden fazla zaman noktasında, lentiviral partikülleri içeren kültür ortamını ayrı tüplerde hasat edin. Daha sonra, hücresel kalıntıları gidermek için hasat edilen kültür ortamını steril bir 0.45 mikron filtreden süzün.Her hasattan sonra taze kültür ortamı ile değiştirin. Lentiviral partikülleri içeren süzüntü, hemen transdüksiyon için kullanılabilir veya eksi 80 santigrat derecede saklanabilir. İnsan meme karsinomu hücreleri MDA-MB-231'i normal kültür ortamında 35 milimetrelik bir kültür kabında plakalayın.Bu hücreleri 37 santigrat derecede 24 saat boyunca% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. Ertesi gün, kültür ortamını plakadan aspire edin ve bir mililitre taze kültür ortamı ile birlikte bir mililitre lentiviral parçacık ekleyin. Hücreleri inkübatörde yaklaşık 16 saat inkübe edin.Viral partiküllerle inkübasyon tamamlandıktan sonra, ortamı aspire etmek için plakayı çıkarın. Daha sonra iki mililitre taze ortam ekleyin ve 24 ila 72 saat boyunca inkübatöre geri aktarın. Bir epifloresan mikroskobu kullanarak bu dönüştürülmüş hücrelerde H2B-mCherry ekspresyonunu kontrol edin.Senkronizasyon deneylerine başlamak için, önce 24 oyuklu bir plakada% 50 ila 60 birleşmede H2B-mCherry eksprese eden MDA-MB-231 hücrelerini plakalayın. Kültürü 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Ertesi gün, kültür ortamını iki milimolar Timidin içeren 0.5 mililitre ortamla değiştirin.Plakayı 24 saat boyunca inkübatörde bırakın. Kuluçka tamamlandıktan sonra, hücreleri Timidin tedavisinden çıkarmak için PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra hücreleri inkübatörde beş saat boyunca 0.5 mililitre normal kültür ortamında bırakın.Bundan sonra, bu hücreleri mitozda bloke etmek için, kültür ortamına Nokodazol ekleyin. Hücreleri 12 saat boyunca inkübatörde bırakın. Nokodazol tedavisi tamamlandıktan sonra, plakayı çıkarın ve bir orbital çalkalayıcı kullanarak, mitotik hücreleri serbest bırakmak için hücreleri 45 saniye ila bir dakika boyunca sallayın.Daha sonra, ekstrakte edilen mitotik hücreleri içeren ortamı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra her oyuğa 0,5 mililitre taze ortam ekleyin. Ardından, hücrelerin çalkalanmasını ve çıkarılmasını iki kez daha tekrarlayın.Toplanan toplam ortamı bir araya getirin ve ardından mitotik hücreleri peletlemek için santrifüjleyin. Döndürmeden sonra, hücre peletini 0.25 mililitre taze hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Bir hemositometre kullanarak, hücre sayısını sayın.Bu adımın başında, 50 mililitre 10x DMEM solüsyonu hazırlayın ve filtreyle sterilize edin. Ardından, metin protokolünde belirtildiği gibi 3D kollajen matrisini yapmak için kullanılacak tüm bileşenlerin hacimlerini belirleyin. Kollajenin jelleşmesini yavaşlatmak için tüm bu bileşenleri buz üzerinde önceden soğutun.Şimdi, önceden soğutulmuş 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne, gerekli sayıda hücreyi ortaya, ardından 10x DMEM, FBS, deiyonize su, kollajen ve son olarak sodyum hidroksit ekleyin. Bir mililitrelik pipet kullanarak dikkatlice karıştırın. Çözelti iyice karıştırıldıktan sonra, 24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 500 mikrolitre karışım ekleyin.24 oyuklu plakayı 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. 30 dakika sonra plakayı çıkarın ve jelin üzerine 500 mikrolitre önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin. Görüntülemeden önce, faz kontrastı ve konfokal mikroskopların canlı hücre birimlerini açın.Bölünen hücreleri yakalamak için, kollajen matrislerine gömülü hücreleri içeren 24 oyuklu plakayı floresan mikroskobunun canlı hücre ünitesine yerleştirin. 10X objektifi kullanarak, plakanın altını bulun ve ardından mikroskop plakanın altından yaklaşık 500 mikrometre uzağa odaklanana kadar yukarı hareket ettirin. Mitozun farklı aşamalarındaki hücreleri bulmak için sahneyi hareket ettirin ve görüntüleme için birden fazla konum seçin.Timelapse deneyini iki dakikalık aralıklarla ayarlayın. Daha sonra, kollajen ağını görüntülemek için, konfokal mikroskobu yalnızca 488 nanometre lazerden yansıyan ışığı yakalayacak şekilde yapılandırın. Daha sonra kollajen matrislerindeki hücreleri içeren plakayı bu mikroskobun canlı hücre ünitesine yerleştirin.Plakanın altını bulun ve ardından objektif merceği, plakanın altından yaklaşık 100 mikrometreye odaklanana kadar yukarı hareket ettirin. Hücreleri bulmak için sahneyi hareket ettirin ve görüntüleme için birden fazla konum seçin. Timelapse deneyini beş dakikalık aralıklarla ayarlayın.Kollajen matrisine gömülü MDA-MB-231 hücresini eksprese eden bölünen bir H2B-mCherry hücresinin floresan görüntüleri burada gösterilmektedir. Mitozun farklı aşamaları beklendiği gibi kolayca gözlemlenir. Konfokal yansıma mikroskobu kullanılarak eş zamanlı olarak görüntülenen beyaz renkteki kollajen liflerinin dağılımı, mitoz bölünmesi sırasında çok az değişir.Hücre senkronize G2-M fazı ve bir kollajen matrisine gömülü hücre bölünmesini ilk iki saat içinde tamamlarken, kontrol asenkron hücreler rastgele bölünür. İnterfaz ve mitotik fazlar sırasında kollajen liflerinin dağılımının ölçülmesi, matris deformasyonunun hücre bölünmesi sırasında minimal olduğunu ve interfaz hücrelerinde daha yüksek olduğunu göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, kararlı hücre hattının oluşturulmasından bir 3D matriste video hücresi bölünmesinin analizine kadar yedi gün içinde tamamlanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, canlı hücre görüntüleme kullanılarak 3B matrislerde memeli hücre bölünmesinin nasıl senkronize edileceğini ve izleneceğini ve konfokal yansıma mikroskobu ve kantitatif görüntüleme analiz tekniklerini kullanarak matris deformasyonunun nasıl belirleneceğini umarız iyi bir anlayışa sahipsinizdir.

mammalian-cell-division-3d-matrices-via-quantitative-confocal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Hücre göçü gibi hücresel süreçleri, geleneksel iki boyutlu, sert plastik yüzeyler üzerinde çalışılmıştır. Bu rapor doğrudan protein lokalizasyon görselleştirme ve daha fizyolojik ilgili üç boyutlu bir matris içinde göç eden hücrelerin protein dinamiklerini analiz etmek için bir teknik anlatılmaktadır.

Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Biz bakteriyel FtsZ-ring yapısal organizasyonu, hücre bölünmesi için gerekli bir aparat soruşturma için görüntüleme yöntemi bir süper-çözünürlük tarif. Bu yöntem, fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) kantitatif görüntü analizi dayanır ve diğer bakteri sitoskeletal proteinleri ile uygulanabilir.

Bakteriyel Bölümü Makine Super çözünürlüklü Görüntüleme

Nöral progenitör mitoz nöron kritik bir parametredir. Nöral progenitör mitoz anlayışımızın çok sabit doku analizine dayanmaktadır. Embriyonik beyin dilimleri Canlı görüntüleme, kontrollü bir ortamda, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile mitoz değerlendirmek için çok yönlü bir tekniktir.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Bu makalede, meme kanseri hücre istilasını ölçmek için üç boyutlu (3D) tahlillerin kullanımı için ayrıntılı yöntemler sağlar. Özellikle, biz hücreleri istila oluşur membran bütünlüğünün kaybı incelemek için bu tür deneyleri kurmak için gerekli prosedürleri, ölçümlerini ve veri analizi gibi yöntemleri tartışmak.

Üç boyutlu (3D) Modeli Kullanılarak Meme Kanseri Hücre invazivliğinin Kantitasyonu

Burada sunulan yöntem, memeliyle ilgili kültürlerin içinde uzamsal organizasyon ortaya çıkarmak için nicel görüntüleme ile birlikte micropatterning kullanır. Teknik standart bir hücre biyoloji laboratuarında kurmak kolaydır ve in vitro desen çalışması için bir uysal sistemi sunar.

Meme hücrelerinin Mikrodesenler ve nicel görüntüleme kullanarak acil uzamsal organizasyonu haritalama

Hücre bölünmeleri floresan etiketli proteinler ve zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir. Burada sunulan protokolü kullanarak, kullanıcılar hücre bölünmesi zamanlama dinamiklerini, mitotik mil montajını ve kromozom kongresini ve segregasyonlarını analiz edebilirler. RNA girişimini (RNAi) aracılı gen nakavtı sonrası bu olaylardaki kusurlar değerlendirilebilir ve ölçülebilir.

Hücre Bölünmesi Canlı Görüntüleme için Drosophila S2 Hücrelerinin Kullanımı

Bu protokol, canlı üç boyutlu görüntüleme için bakteri örneklerinin nasıl hazırlanacağını ve monte edilebildiğini ve bu görüntülerden E. coli'nin üç boyutlu şeklinin nasıl yeniden yapılandırılabildiğini açıklar.

Doğru Hücresel Temsiller ve Hassas Protein Lokalizasyonu için Bakteri Hücrelerinin Üç Boyutlu Görüntülemesi

Ex vivo canlı görüntüleme, canlı dokulardaki hücresel hareketlerin ve etkileşimlerin dinamik süreçlerini incelemek için güçlü bir tekniktir. Burada, kültürlenmiş tüm yetişkin fare kesici dişlerinde diş epitel hücrelerini canlı izlemek için iki foton mikroskobu uygulayan bir protokol sunuyoruz.

Fare Diş Yenileme Sırasında Hücre Bölünmelerini ve Hareketlerini Araştırmak için Ex Vivo Canlı Görüntülemeyi Kullanma

Çok boyutlu mikroskopi verilerinin doğru analizi, karmaşık iş akışları gerektirir. Bu makalede Cell-ACDC yazılımının nasıl kullanılacağı gösterilmektedir. Segmentasyon, izleme, hücre soyağacı analizi ve mikroskopi verilerinin nicelleştirilmesi için en son teknolojiye sahip yapay zeka destekli modellerden yararlanır. En önemlisi, bu modelleri, modellerin çıktısının yarı otomatik olarak düzeltilmesi için yenilikçi bir çerçeveyle tamamlıyor.

Hücre-ACDC Kullanılarak Çok Boyutlu Mikroskopi Verilerinin Analizi

Özel, gerçek zamanlı bir konfokal tarama görüntüleme sistemi komple inşaat açıklanmıştır. Video hızı mikroskopi ve mikroendoskopi için kolayca kullanılabilen bu sistem, maliyetinin bir kısmını, standart ticari konfokal sistemlerini kullanarak erişilebilir değil görüntüleme geometrileri ve uygulamaları bir dizi sağlar.

Video-rate Tarama Konfokal Mikroskop ve Mikroendoskopi

Öğrenin, canlı hücre görüntüleme ve konfokal yansıma mikroskobu kullanarak 3D kollajen matrislerde memeli hücre bölünmesini ve hücre-matriks etkileşimlerini nasıl inceleyeceğinizi.

Memeli hücre bölünmesi yılında niceliksel Confocal yansıma mikroskobu ile 3D matrisler

Daha fazla video keşfet