Tavşan sklera bir araç olarak ikinci harmonik üretimi sinyalleri tedavi doku (TXL) için miyopi Cross-linking değerlendirilmesi için

Bu protokolün genel amacı, sub-tenonun formaldehit salma ajanı enjeksiyonu ile indüklenen ve diferansiyel taramalı kalorimetri ile doğrulandığı gibi skleral dokudaki kollajen çapraz bağlama etkisini görselleştirmek ve ölçmek için ikinci harmonik nesil mikroskobunun kullanımını göstermektir. Bu yöntem, indüklenen çapraz bağlama etkilerini değerlendirmek için invaziv olmayan bir yöntem sağlayarak terapötik doku çapraz bağlama alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, ikinci harmonik üretilen sinyallerin kollajen fibrillerine oldukça spesifik olması ve bu nedenle antikor boyaması gibi özel bir doku hazırlığına gerek olmamasıdır.

Bu yöntem için bu fikir ilk olarak, terapötik kornea dokusu çapraz bağlamasına uygulanan prosedürü okuduğumuzda aklımıza geldi. Başarılı ikinci harmonik nesil mikroskopi, doku hasarını ve sinyal ölçümünde artefaktları önlemek için dokunun dikkatli bir şekilde yerleştirilmesini ve doğru görüntüleme koşullarının ayarlanmasını gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Tedaviye, metin protokolünde anlatıldığı gibi tavşanın gözbebeklerine alt tenon enjeksiyonu ile başlayın.

Burada alt tenonun enjeksiyon bölgesinin şematik bir temsili gösterilmektedir. Gözün boyutuna göre en uygun boyutta bir spekulum seçin. Üç buçuk saatlik inkübasyondan sonra, küreye erişimi optimize etmek için göz kapağı spekulumunu kullanarak göz kapaklarını geri çekin.

Limbusu çevreleyen konjonktivayı ayırın ve ekstra oküler kasları skleral yerleştirme yerlerinde kesin. Skleranın üst kısmını makas veya bıçak kullanarak kesin ve enjeksiyon bölgesi merkezi olarak bulunan bir santimetrelik bir alan oluşturun. Kalan retina ve koroid katmanlarını kazıyın ve her seferinde parçaları yaklaşık 10 saniye boyunca çözelti içinde bırakarak taze PBS ile iki kez yıkayın.

Dokuyu, görüntüleme tesisine taşınması için PBS çözeltisi ile doldurulmuş bir mililitrelik tüplere yerleştirin. SHG mikroskobu gerçekleştirirken sinyali ve çözünürlüğü en üst düzeye çıkarmak için, kızılötesi ışığı iletmek için optimize edilmiş ve yüksek sayısal diyafram açıklığına sahip bir objektif lens kullanın. Lensin düzeltme bileziğini numunenin derinliğine uyacak şekilde ayarlayın.

Bu durumda, 0.17 milimetre. 25 kez objektif lensi mikroskoba monte edin ve lens yüzeyini kaplamak için bol miktarda su bazlı daldırma jeli ekleyin. Doku görüntülemesinin, numunenin mikroskoba monte edilmesinden itibaren 30 dakika içinde yapılması, dokuyu nemli tutmak ve lens objektifi ile slayt arasındaki daldırma jelinin kurumasını önlemek için önemlidir, çünkü bu, SHG sinyalinde değişikliklere neden olacaktır.

Odanın alt kısmına 25 milimetrelik yuvarlak bir kapak sürgüsü yerleştirerek hücre odasını monte edin. Sklera dokusu parçasını kapak kızağına yerleştirin ve 50 ila 100 mikrolitre tampon ekleyin. Dokuyu ikinci bir yuvarlak kapak kayışı ile örtün ve dokuyu bastırmadan veya düzleştirmeden haznenin üst kısmını vidalayın.

Ardından, doku örneği ile hücre odasını mikroskop aşamasına monte edin. Sahneyi konumlandırın ve objektifin yüksekliğini, numunenin alt yüzeyi, göz merceğinden geçen parlak alan incelemesi ile belirlendiği gibi odakta olacak şekilde ayarlayın. Bilgisayar monitörü dışındaki tüm ışıkları kapatın ve mikroskop tablasına örtülmüş alüminyum folyo levhalarla monitörden gelen ışığı mümkün olduğunca engelleyin.

Yazılımda, Eye Port modunu kapatın. TI Pad panelinde, lens tanımının doğru olduğunu kontrol edin. A1 Kompakt Grafik Kullanıcı Arayüzü panelinde, görüntüleme için kızılötesi lazeri seçin, Taranmamış Dedektörleri seçin ve 400 ila 450 nanometre bant geçiren filtre ile donatılmış DAPI kanalını seçin.

A1 Multi Photon Grafik Kullanıcı Arayüzü panelinde, kızılötesi lazerin dalga boyunu 860 nanometreye ayarlayın ve deklanşörü açın. Emisyon dalga boyu sabit yeşil ışıkla gösterildiği gibi değişene kadar bekleyin. A1 Kompakt Grafik Kullanıcı Arayüzü panelinde lazer tarama koşullarını ayarlamak için Galvano tarayıcıyı, birim yönlü taramayı, 1024 x 1024 piksel çerçeve boyutunu, 6,2 mikrosaniye piksel bekleme süresini ve 2X çizgi ortalamasını seçin.

Ardından, bulma moduyla canlı hayal etmeyi açın ve lazer gücünü ve dedektör kazancını ayarlayarak AI Kompakt Grafik Kullanıcı Arayüzü panelinde hayal koşullarını ayarlayın. Lazer gücünü 50 miliwatt ile 150 miliwatt arasında, yani 860 nanometrede bir lazer için yüzde iki ile yüzde altı arasında ayarlayın. Bu aralığın üzerinde doku hasarı meydana gelebilir.

Geçerli görüntüdeki piksel yoğunluğu değerlerinin histogramını görüntüleyen Arama tablosu panelini açın ve doygunluğu önlerken piksel değerleri aralığını en üst düzeye çıkarmak için HV etiketli çubukta dedektörün kazancını daha fazla ayarlayın. Optimum lazer ve kazanç ayarlarını bulmak için en yüksek SHG sinyaline sahip örneği kullanın. Tek bir deneyde karşılaştırılacak tüm numuneler için aynı ayarları koruyun.

Bu uygulama, deneydeki hiçbir numunenin dedektörü doyurmamasını sağlar. Dokuyu taramak için önizleme modunda, XYZ genel bakış aracını açın. Bu modda görüntü alımını hızlandırmak için görüntülemeyi daha düşük çözünürlüğe ayarlayın.

XYZ genel bakış panelinde, mevcut konuma sağ tıklayın ve beşe beş, üçe üç tara veya tek görünüm yakalama'yı seçin. Tarama bittikten sonra, geçerli önizlenen alanın dışındaki bir alanı çift tıklatarak yeni bir konuma geçin. Canlı Tarama modunu açın, ardından dokunun farklı bölgeleri eksenel yönde biraz farklı konumlara sahip olabileceğinden dokuyu odak noktasına getirin.

Beşe beş, üçe üç veya tek görüş alanlarında yeni bir görünüm alanı yakalayın. Dokunun geniş bir alanı önizlenene kadar bu işlemi tekrarlayın. XYZ genel bakış aracında, sahneyi belirli bir konuma taşımak için kolajen liflerinin tüm görüş alanında görüldüğü bir konuma çift tıklayın.

Görüntülemeyi yüksek çözünürlüğe, 1024 x 1024 piksele ve 2X çizgi ortalamasına ayarlayın. Canlı Bul modunu açın, hedefin konumunu alt düz odakta olacak şekilde ayarlayın ve TI Pad'de optik düzlemi bu alt katmanın 10 mikrometre üzerine hareket ettirmek için Z Sürücüsünü kullanın. Yakala düğmesini kullanarak bir görüntü elde edin, XYZ inceleme aracındaki artı düğmesiyle konumu kaydedin.

Yeni bir konuma çift tıklayın ve derinlik ayarını ve görüntü yakalama işlemini tekrarlayın. Her doku parçası için 10 görüntü yakalayın. Görünüm alanları, XYZ genel bakış aracında kaydedilen konumlarda gösterildiği gibi çakışmamalıdır.

Son olarak, sonraki diferansiyel taramalı kalorimetri analizine hazırlık olarak mikroskopi tamamlandıktan hemen sonra skleral parçaları PBS'li bir mililitrelik tüpe yerleştirin. Başlamak için, kontrolün orta kısmını kesin ve sklerayı makasla tedavi edin. Her skleral kareyi emici bir doku ile kurulayın ve dişli forseps kullanarak bir DSC tavasının dibine düz bir şekilde yerleştirin.

Doku içeride ve dudak kıvrılmış ve örtülmüş durumdayken, doku ıslak ağırlığını elde etmek için tavayı tartın. Ardından, tartılan numuneyi DSC otomatik numune alma tepsisinde belirlenen konumuna yerleştirin. Cihaz yönetim yazılımını kullanarak, dokunun ağırlığını belirterek bir yöntem oluşturun ve metin protokolünde listelenen çevreleri kullanarak termal analizi çalıştırın.

Tamamlandığında, cihaz görüntüleme yazılımını kullanarak termal denatürasyonun meydana geldiği geçiş sıcaklığı tepe noktasını çıkararak her bir numune için verileri analiz edin. Skleranın SHG görüntüleri Fiji'de ortalama piksel parlaklığı açısından analiz edildi. Bir görüntü açıldığında ve analiz menüsü seçildiğinde ve ardından ölçüm seçildiğinde, sinyalin ortalama parlaklığını içeren sonuçları içeren bir tablo açılır.

Alternatif olarak, Çözümle menüsünde, görüntüdeki sinyalin ortalama parlaklığı ve değişimi hakkında bilgi içeren piksel yoğunluğu değerlerinin histogramını oluşturmak için Histogram seçilir. Bu ölçüm, kontrol ve çapraz bağlı numunelerden alınan tüm görüntüler için tekrarlandı. Eşlik eden histogram analizi ile skleranın temsili SHG görüntüleri, ortalama parlaklık da dahil olmak üzere burada gösterilmektedir.

Kontrol numunesi, fibrillerin dalgalı bir düzenlemesi ile karakterize edilir. Burada, daha düz görünen kollajen liflerini ortaya çıkaran, artan piksel yoğunluğuna sahip 400 milimolar SMG ile çapraz bağlanmış bir örnek gösterilmektedir. Termal analizin sonuçları, denatürasyon sıcaklığının daha yüksek zirvesini gösterir ve çapraz bağlama etkisini doğrular.

Kontrol numunesi ve 400 milimolar çapraz bağlı numune denatürasyon eğrisi gösterilir. Bu videoyu izledikten sonra, çapraz bağlı bir numunenin nasıl hazırlanacağını ve skleral numuneler üzerinde SHG mikroskobunun nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, alt tenon boşluğuna hassas enjeksiyonla mücadele eder, enjeksiyon bölgesinin etrafındaki kareyi cerrahi olarak çıkarır ve dokuyu önizleme modunda taramak için görüntü koşullarını ayarlar.

Bu prosedürü takiben, kantitasyon ve morfoloji dahil olmak üzere elastin analizi gibi ek soruları yanıtlamak için otoluorescence gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu çapraz bağlama ajanı uygulama tekniğinin etkileri, skleral stabilizasyon amacıyla arka pole daha kolay erişim sağladığı için yüksek miyopi ve posterior stafilom tedavisine kadar uzanır. Bu mikroskopi tekniğinin etkileri, hastalıklı skleradaki kollajen çapraz bağlanma durumunu ölçerek veya istenen çapraz bağlama prosedürü tamamlandıktan sonra sonucun ölçülmesiyle yüksek miyopi ve kollajen zayıflamasının neden olduğu komplikasyonların teşhisine kadar uzanır.

Bu nedenle, bu çapraz bağlama yöntemi ve ikinci harmonik nesil mikroskobu, skleral çapraz bağlama hakkında fikir verebilir, ayrıca kornea, cilt, kıkırdak, tendon, kalp kapakçığı ve kan damarları gibi diğer dokulara da uygulanabilir.