Fare embriyonik kök hücre kullanarak MEK inhibitörü PD0325901 ve C vitamini genomik Hypomethylation korumak için bir alternatif kültür yöntemi

Fare embriyonik kök hücre kültürü çalışmalarının iki kimyasal tabanlı protokol ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu yeni yöntem Tet-aracılı oksidasyon (vitamin C) teşvik ve DNA hypomethylation ve fare embriyonik kök hücreler pluripotent korumak için 5-metilsitozin (PD0325901 tarafından) de novo sentezi bastırmak sinerjik mekanizmaları kullanır.

Bu protokolün genel amacı, fare embriyonik kök hücrelerinde hipometillenmiş ve pluripotent bir durumu korumak için küçük moleküllü bileşikler PD0325901 ve C Vitamini kullanmaktır. Bu yöntem, morfolojideki heterojenite ve dehipermetilasyon gibi FBS kültürlenmiş fare embriyonik kök hücreleri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, fare embriyonik kök hücrelerinin mükemmel morfolojiyi ve hipometillenmiş ve farklılaşmamış durumu sürdürebilmesidir.

Plakaları ve tamponları hazırladıktan sonra, metin protokolüne göre, fare ES hücrelerini, kültür ortamını, tripsin ve PBS'yi 37 santigrat derecede bir su banyosunda önceden ısıtın. Hücreleri geçirmek için, ortamı çanaktan aspire edin ve hücreleri iki kez durulamak için iki mililitre PBS kullanın. Daha sonra PBS'yi çıkarın ve hücrelere 0.3 mililitre tripson EDTA ekleyin ve çözeltideki hücreleri kaplamak için tabağı hızla eğin.

Tripsini hemen çıkarın ve hücreleri ayırmak için plakayı bir dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Tripsini etkisiz hale getirmek için iki mililitre önceden ısıtılmış serum ortamı ekleyin ve hücre kolonilerini 10 kez tek bir hücre süspansiyonuna yeniden süspanse etmek için beş mililitrelik bir pipet kullanın. Hücre çözeltisinin 150 mikrolitresini altı santimetrelik yeni bir jelatin kaplı tabağa koyun ve üç mililitre taze yapılmış VCPD0325901 ortamı ile destekleyin.

Hücreleri 37 santigrat derece ve yüzde beş CO2'de kültürleyin. Vc'nin kararsızlığı nedeniyle, inkübe sırasında her 24 saatte bir, eski kültür ortamını çıkarın ve üç mililitre taze Vcpd0325901 ortamı ekleyin. Yüzde 70 ila 80 birleşmeye ulaştıktan sonra, hücreleri geçirin ve az önce gösterildiği gibi kültürlemeye devam edin.

DNA ekstraksiyonunu gerçekleştirmek için, hücreleri daha önce gösterildiği gibi tripsin ile toplayın ve üreticinin talimatlarını izleyerek bir genomik DNA saflaştırma kiti kullanın. DNA tüpüne 100 mikrolitre ultra saf su ekleyin ve DNA'yı yaklaşık 15 kez pipetleyerek çözün. Ardından, DNA'nın konsantrasyonunu ve kalitesini belirlemek için Od260 ila 280 oranını ölçmek için bir spektrofotometre kullanın.

DNA konsantrasyonu mikrolitre başına yaklaşık 500 nonogram olmalıdır. Daha sonra, beş mikrogram DNA'yı beş mikrolitre 100 milimolar tris hidroklorür PH7.6, iki birim buzağı bağırsak fosfatazı, bir birim Dnase ve 0.005 birim yılan zehiri, fosfodiesteraz bir ile birleştirerek sindirin. Ardından, hacmi 50 mikrolitreye çıkarmak için ultra saf su kullanın.

Reaksiyonu gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi sabah, numuneyi bir dakika boyunca oda sıcaklığında 1.000xg'de santrifüjleme ile toplayın. Daha sonra çözeltiyi ultra filtrasyon tüplerine aktarın ve sindirim enzimlerini çıkarmak için numuneleri 13, 000xg ve 4 santigrat derecede 30 dakika döndürün.

Numuneleri 5HMC analizine hazırlamak için, 36 mikrolitre filtratı bir mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve üç nanomolar nihai konsantrasyon için dört mikrolitre D35HMC ekleyin. 5MC analizi için, 196 mikrolitre ultra saf suyu yeni bir santrifüj tüpüne pipetleyin ve genomik DNA'daki 5MC'nin yüksek yoğunluğu nedeniyle dört mikrolitre filtrat ekleyin. Seyreltilmiş 5MC çözeltisinin 36 mikrolitresini yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve 50 nanomolar nihai konsantrasyon için dört mikrolitre D35MC ekleyin.

Sırasıyla 35HMC ve 35MC'yi kalibre etmek için dahili standartlar olarak D5HMC ve D5MC'yi kullanın. UHPLCMS yazılımında 5MC ve 5HMC'yi analiz etmek için parametreleri ayarladıktan sonra, metin protokolüne göre, MS QQQ'ya tıklayarak QQQMSMS için parametreleri oluşturun. Durma süresi için Limit yok/Pompa Olarak'ı seçin.

İyon kaynağı için ESI'yi seçin. Zaman filtrelemesi için Tepe genişliği'ni işaretleyin ve 0,07 dakika girin. Zaman segmentlerini ayarlamak için, başlangıç zamanı için sıfır'ı seçin.

Sütundaki imayı analiz etmek üzere MRM'de tarama modunu ayarlamak için, tarama türü için MRM'yi seçin. Div Değeri için MS'e'yi seçin. Delta EMV artı için 200 ve Delta EMV eksi için sıfır girin. Önce MSQQQ bir edinime tıklayarak geçişleri izlemek için parametreleri oluşturun.

Tarama segmentlerini ayarlamak için, Duraklama için 90 girin. Fragmentor için parça voltajlarını ayarlamak için 90 girin. Çarpışma Enerjisi için beş girin.

Hücre Hızlandırıcı Voltajı için dört girin. Pozitif iyon modunu ayarlamak için Polarite için pozitifi seçin. Mononükleozitlerin UHPLC ayrımını gerçekleştirmek için, çözelti a için 500 mililitre ultra saf su ile 500 mikrolitre formik asidi karıştırarak 5MC ve sitozin iması için a ve b çözeltilerini hazırlayın.

Daha sonra 500 mililitre yüzde 100 metanol ve çözelti b'yi ölçün. Çözelti a ve çözelti b'yi 5MC ve C'yi elüte etmek için mobil faz olarak 95'e beş hacim / hacim oranında karıştırın. Optimize edilmiş bir gradyan imlaması kullanarak 5HMC'yi ayırın.

Ardından akış hızını dakikada 0,25 mililitre olarak ayarlayın. 5MC, D35MC, DC, 5HMC ve D35HMC için geçişleri izleyin. Kılcal gerilimleri 3.500 volt olarak ayarlayın.

Ardından enjeksiyon hacmini 5 mikrolitreye ayarlayın ve her numuneyi üç kez analiz edin. Metin protokolüne göre 5MC ve 5HMC miktarını değerlendirmek için ilgili standart eğrileri kullanın. UHPLC MSMS ile fare ES hücrelerinde genomik DNA'nın bu analizinde görüldüğü gibi, VcPD0325901 tedavisi DNA metilasyonunda daha hızlı bir düşüşe neden oldu ve beş gün sonra sabit beş MC seviyesine ulaşırken, Vc 2i tedavisi 11. günde karşılaştırılabilir bir seviye ile sonuçlandı.

Bu grafik, Vc içeren tedavinin bir gün sonra 5HMC frekansını önemli ölçüde artırdığını ve daha sonra 5MC substratındaki ilerleyici bir azalmaya bağlı olarak 5HMC seviyelerinin kademeli olarak azaldığını göstermektedir. Western blot analizi, Prdm14'ün önemli ölçüde yükseldiğini, Dnmt3b ve ko-faktörü Dnmt3l'nin, hücreler PD0325901 ile geri çekildiğinde önemli ölçüde aşağı regüle olduğunu gösterdi, bu da PD0325901'nin 5MC'yi silmedeki etkisini gösteriyor. Bu alkalin fosfataz testinde, fare ES hücrelerinin tümü, VcPD032590'da 26 gün boyunca yetiştirildiğinde top benzeri bir morfoloji ile mor renkte boyandı, bu da farklılaşmamış bir durumu gösteriyor.

Buna karşılık, tek başına besiyeri içeren FBS'de yetiştirilen hücreler, kısmi farklılaşmayı gösteren kısmi yayılma ile açık renkli göründü. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa beş saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, FBS'nin önceden taranması gerektiğini hatırlamak önemlidir.

Ayrıca, hücreleri geçiş boyunca aşırı pipetlemekten ve VcPDO325901 kültür ortamını günlük olarak değiştirmekten kaçının. Bu gelişmeden sonra, bu teknik, in vitro embriyoların gelişimini ve süreçlerini ve rejeneratif tıp için tıbbi öneme sahip üretilen hücreleri in vitro olarak fare ES hücrelerinin kültürlenmesi alanındaki araştırmacıların yolunu açmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, MEK inhibitörü PD0325901 olan iki küçük moleküler bileşen kullanarak fare ES hücreleri için büyüme morfolojisinin ve hipermetillenmiş ve çoğul güçlü durumun nasıl korunacağını daha iyi anlamış olmalısınız.

Trisol, DMS veya PMS ve DTT ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken eldiven, maske ve gözlük takmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.