Name: Fare embriyonik kök hücre kullanarak MEK inhibitörü PD0325901 ve C vitamini genomik Hypomethylation korumak için bir alternatif kültür yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Keşfedin fare embriyonik kök hücrelerinde PD0325901 ve C vitamini kullanarak hipometile durumu koruma yöntemini. Bu teknik çoğaltma ve plüripotensiyeli sürdürerek hücre morfolojisini geliştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (21435008 ve 21327006 H.W. için) ve stratejik öncelik araştırma programı Çin Bilimler Akademisi tarafından desteklenmiştir (H.W. için XDB14030200).

1. hazırlıkları
<ol><li>
Bir çözüm (MEK inhibitörü) 1.0 mm PD0325901 ve 3.0 mM CHIR99021 (GSK3 inhibitörü).
	<ol>
<li>PD0325901 2 mg tartmak ve bir kehribar cam şişede DMSO 4,15 mL ekleyin.</li>
		<li>CHIR99021 2 mg tartmak ve bir kehribar cam şişede DMSO 1,43 mL ekleyin.</li>
		<li>Aşağıdaki sulandırma, aliquots (50 µL/tüpte 200 µL PCR tüpleri)-20 ° C'de depolayın ve ışıktan korunan. Bir tüp dondurucu ve tezcan, oda sıcaklığında kullanmadan önce dondurulmuş stoktan içeren kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vc 0.0176 g bir santrifüj tüpü 1 mL içine tartmak ve 1 mL 100 mM kullanmadan önce son bir konsantrasyon için steril su ile yeniden oluşturma.</li>
	<li>FBS devre dışı bırakabilirsiniz: FBS 500 mL 30 dk 56 ° C'de bir su banyosunda kuluçkaya.</li>
	<li>
600 mL temel orta fare ES Hücre kültürü çalışmalarının için hazırlayın.
	<ol>
<li>40 mL kaldırmak ve bir şişe DMEM/yüksek glikoz Orta (500 mL) kullanın.</li>
		<li>FBS (120 mL), 1000 U/mL LIF (107 U/mL stok çözüm 60 µL), 0,1 mM non-gerekli amino asitler (NEAA) (6 mL 10 mM stok çözeltisi), 1 mM sodyum pyruvate (6 mL 100 mM stok çözeltisi) ek 460 mL DMEM/yüksek glikoz orta % 20 ile inaktive , 2 mM L-glutamin (6 mL 200 mM stok çözeltisi), 0,1 mM β-mercaptoethanol (100 mM hisse senedi çözüm 600 µL) ve 33 IU/mL penisilin ve 33 µg/mL streptomisin (penisilin-streptomisin çözüm (10.000 IU/mL penisilin ve 10.000 µg/mL streptomisin) karışık 2 mL) . Temel orta serum aracı olarak tanımlayın.</li>
		<li>PD0325901 hisse senedi çözüm 50 µL pipet (1.0 mM) ve Vc (100 mM), sırasıyla, 50 mL serum orta içine (son konsantrasyonu: 1.0 µM PD0325901 ve 100 µM Vc) ve orta Vc/PD0325901 aracı olarak tanımlayın. Not: Vc/PD0325901 orta boy taze Vc istikrarsızlık nedeniyle kullanımdan önce hazırlayın.</li>
		<li>Bir pipet kullanarak transfer PD0325901 hisse senedi çözüm 50 µL (1.0 mM) ve CHIR99021 (3.0 mM), sırasıyla, 50 mL serum orta içine (son konsantrasyonu: PD0325901 1.0 µM ve CHIR99021 3.0 µM) ve orta 2i aracı olarak tanımlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Jelatin kaplı yemekleri hazırlamak.
	<ol>
<li>%0,1 jelatin çözeltisi hazırlamak: 300 mL Cam reaktif şişe bir kap ile Ultrasaf Su içine jelatin 0.3 g dağıtılması ve 121 ° C'de bir Otoklav içinde oda sıcaklığında steril çözüm için 20 dk. mağaza sterilize.</li>
		<li>Hücre kültür yemekleri (6 cm çapında) ile 2 mL % 0,1 jelatin çözeltisi 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya ve jelatin Aspire edin. Bulaşıkları hava kuru ve onları içinde 12 h kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>15 mL santrifüj tüpü ortamda buz gibi fare ES Hücre 10 mL hazırlamak: % 90 FBS (9 mL) ve % 10 DMSO (1 mL). Orta 1 gün içinde kullanın.</li>
	<li>Dondurucu bir kapsayıcı hazırlamak: % 100 izopropil alkol dondurma konteyner dolgu satırına ekleyin ve eski izopropil alkol atın. Yeni izopropil alkol doğrudan beşinci her kullanımdan sonra ekleyin.</li>
	<li>Enzimatik sindirim arabellek olun: tartmak 1.2114 g Tris tozu 100 mL 100 mM Tris çözüm hazırlamak ve eklemek için Ultrasaf Su içine konsantre HCl çözüm (yaklaşık 12 M) Tris çözüm pH 7,6 (yaklaşık 0.6 mL konsantre HCl çözeltisi) için ayarlamak için.</li>
	<li>Radyo immunoprecipitation tahlil arabelleği (RIPA arabellek) 50 mL hazırlamak: 20 mM Tris, pH 7.4, 1 mM MgCl2, 150 mM NaCl, % 20 gliserol, %0,5 NP40, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA. 1 mM ile DTT, proteaz inhibitörü kokteyl X 1 ve 1 mM PMSF kullanmadan önce ek. PMSF eklendikten sonra 30 dk içinde arabellek kullanın.</li>
</ol>2. fare ES hücrelerin jelatin kaplı yemekleri büyümesine
<ol><li>Orta, tripsin ve tamponlanmış fosfat çözümde 37 ° C'de bir su banyosu (PBS) önceden sıcak fare ES hücreleri (vahşi türü, 129 SvEv) kültür</li>
	<li>
Hücreleri geçiş. Ortamından tamamen çanak ve pipet PBS 2 mL hücreleri durulayın yemekleri Aspire edin.
	<ol>
<li>PBS bir pipet ile kaldırmak ve yeniden PBS 2 mL içeren hücreleri yıkayın.</li>
		<li>PBS kaldırmak ve tripsin-EDTA (% 0,25) 0.3 mL her yemek için ekleyin.</li>
		<li>Hızlı bir şekilde tripsin ile bütün çanak kapağı ve hemen kaldırın.</li>
		<li>Çanak çanak hücrelerden ayırmak 1 dk 37 ° C'de bir kuluçka koymak. Kuluçka makinesi yemeklerini çıkar ve sonlandırma tripsin eylemi için önceden ısıtılmış serum Orta 2 mL ekleyin.</li>
		<li>Hücre kolonilerinin bir pipet (5 mL pipet ucu) ile 10 kez resuspending tarafından bir tek hücre süspansiyon ayırmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre çözümü (bir hemasitometre ile sayma tarafından yaklaşık 190.000 hücreleri) 2 mL 150 µL yeni bir jelatin kaplı kabına aktarın ve taze yapılmış Vc/PD0325901 orta 6 cm kültür çanak başına 3 mL ile ek. 37 ° C kuluçka %5 CO2hücre kültür.</li>
	<li>Kuluçka, süre her 24 h eski kültür orta kaldırın ve taze Vc/PD0325901-orta 3 mL Vc. Expect 70-%80 confluency istikrarsızlık nedeniyle kültür çanak içine 2-3 gün sonra ekleyin.</li>
	<li>% 70-80 confluency ulaşan sonra hücreleri geçiş ve onları 2.2-2.4 adımlarda açıklandığı gibi kültür devam ediyor.</li>
</ol>3. donma ve fare ES hücreleri tezcan
<ol><li>
Fare ES hücreleri dondur.
	<ol>
<li>Tripsin bulaşıkta hücrelerden takip adım 2.2 bağlantısını kesin.</li>
		<li>Hücreleri bir 15 mL plastik tüp ve 800 g ve oda sıcaklığında x 3 dk santrifüj içine aktarın.</li>
		<li>Süpernatant yavaşça bir ölçek dökümü ve hücre Pelet ile 1 mL taze dondurma orta yaptı resuspend. Dondurucu orta 30 dk önce kullanmadan önce oda sıcaklığında olduğundan emin olmak için bu adımı hazırlayın.</li>
		<li>1 mL pipet ile 1,8 mL microcentrifuge tüp ortamına dondurma hücreleri aktarmak ve microcentrifuge tüp dondurucu bir konteyner içine yerleştirin. İzopropil alkol dondurma konteyner dolgu satırına ekleyin ve kullanmadan önce oda sıcaklığında saklayın.</li>
		<li>Dondurma kapları gece-80 ° C dondurucuya bırakın.</li>
		<li>Microcentrifuge tüpler için 2-3 yıla kadar bir sıvı azot kaba transfer. Not: Değil tutmak hücreleri dondurucu orta uzun bir zaman ve hızlı bir şekilde hücreleri-80 ° C dondurucu DMSO toksisite nedeniyle transfer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fare ES hücreleri çözülme.
	<ol>
<li>Önceden sıcak 50 mL serum orta 37 ° C su banyosu içinde.</li>
		<li>Bir hücreyi içeren flakon sıvı azot konteyner üzerinden çıkar ve 37 ° C su banyosu kepli şişede bırakın. Hızlı bir şekilde çözülmesi su banyosu salla. Hücreleri 1 mL pipet ile 15 mL tüp içine aktarın. Önceden ısıtılmış serum kültür orta 2 mL dondurucu orta sulandırmak ve 800 x g ve oda sıcaklığında 3 dk santrifüj kapasitesi için tüp içine ekleyin.</li>
		<li>Süpernatant kaldır ve yavaşça hücre topakları ile 3 mL 5 mL pipet kullanarak taze Vc/PD0325901 orta resuspend.</li>
		<li>Hücreleri 15 mL tüp sizden bir jelatin kaplı yemek için aktarmak ve 24 h kültür için hücreleri tekrar 2. adımda açıklandığı gibi hücre kültür.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Toplam Protein hücrelerden hulâsa
<ol><li>Kendine hakim hücre PBS 1 mL ile durulayın ve 800 x g ve oda sıcaklığında 3 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet DTT, proteaz inhibitörü kokteyl ve PMSF ile hafifçe pipetting tarafından desteklenen RIPA arabelleği ile iyice resuspend. RIPA arabellek hücrenin cips yaklaşık 5 x birimdir. Not: cep resuspension buz yerine getirir.</li>
	<li>Hücreleri RIPA arabellek buz ve santrifüj 13.000 x g ve 4 ° C 5 min için 30 dakika tutun.</li>
	<li>Yeni bir tüp süpernatant aktarın ve aliquots-80 ° C'de depolayın</li>
	<li>Bir Bradford protein tahlil kiti ile protein konsantrasyonu belirlemek.</li>
</ol>5. DNA hücre Özet DNA hulâsa--dan ve bir tek nükleozit enzimler kullanarak
<ol><li>Tripsin hücrelerle 3.1.1 ve 3.1.2 adımlarda açıklandığı gibi toplamak.</li>
	<li>DNA ekstraksiyon üreticinin yönergelerini izleyerek bir genomik DNA arıtma kiti ile gerçekleştirin.</li>
	<li>Ayıklanan DNA 1 mL santrifüj tüplerde saklayın. Santrifüj tüpüne 100 µL ultrasaf su ekleyin ve yaklaşık 15 kez pipetting tarafından DNA geçiyoruz. Konsantrasyonu belirlemek ve DNA kalitesi 260 absorbans ölçümü ile değerlendirmek nm ve 280 nm15. DNA yaklaşık 500 ng/µL bölgedir.</li>
	<li>DNA'ın Özeti 5 µg 50 µL çözüm sistemi: 100 mm Tris-HCl bir çözüm, pH 7,6 5 µL ekleyin (son konsantrasyonu: 10 mM), 2 U buzağı bağırsak fosfataz, 1 U DNaz ben 0.005 U yılan zehri fosfodiesteraz ben ve DNA'ın 5 µg (uzaklık göre eklenen hacim hesaplamak Kırmızı DNA toplama, ~ 10 µL) bir santrifüj tüpü ve artış Ultrasaf Su ile 50 µL çözüm hacmi içine. 37 ° C karisimin gecede kuluçkaya. Sindirilir DNA çözüm 1000 g ve oda sıcaklığında çözüm tüpler altına toplamak 1 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Sindirilir DNA çözüm santrifüj tüpleri ultra filtrasyon tüpler içine aktarmak (kesme bir molekül ağırlığı: 3 kDa) ve 13.000 g ve 4 ° C için sindirim enzimleri kaldırmak 30 dk santrifüj.</li>
	<li>
Örnekleri 5mC ve 5hmC analiz için hazırlayın.
	<ol>
<li>5hmC analiz için: damlalıklı 36 µL filtre çözüm için yeni bir santrifüj tüp (1 mL) ve bir 5'-(hydroxymethyl-d3)-2'-deoxycytidine 4 µL ekleyin ([D3]-5hmC) ile 3 son konsantrasyonu nM.</li>
		<li>5mC analiz için: 196 µL Ultrasaf Su içine yeni bir santrifüj tüpü ve damlalıklı 4 µL filtre çözüm tüp (50-fold seyreltme), genomik DNA ' 5mC yüksek yoğunluk nedeniyle ekleyin. Yeni bir santrifüj tüpü seyreltilmiş çözeltinin 36 µL nakletmek ve 4 µL eklemek (5'-(methyl-d3)-2'-deoxycytidine ([D3]-5mC) ile son konsantrasyonu 50 nM. Kullanım [D3]-5hmC ve [D3]-5mC 5hmC ve 5mC, anılan sıraya göre ayarlamak için iç standart olarak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örnek çözüm için ölçüm tüpler aktarın ve 4 ° C'de depolayın 5mC ve 5hmC çoklu-tepki (UHPLC-MS/MS (MRM)) bir önceki rapor15' te açıklandığı gibi izleme ile ultra yüksek performanslı sıvı kromatografi-triple quadrupole kütle spektrometresi ile analiz.</li>
</ol>6. analiz 5mC ve 5hmC UHPLC-MS/MS15 kullanarak
<ol><li>
5mC ve 5hmC analiz etmek için çeşitli parametreleri ayarlamak UHPLC-MS yazılım kullanarak.
	<ol>
<li>Yeni bir yöntem oluşturun. Yazılım açın ve "dosya | Yeni | Yöntem". "Geçerli yöntem için değişiklikleri kaydetmek ister" "Yöntemi Düzenleyicisi" ileti kutusu içeriği ile sergi ve "Hayır"'ı tıklatın.</li>
		<li>Örnekleyiciyi parametrelerini oluşturun. Tıklatın "örnekleyici | Kurulum | Enjeksiyon". "Standart enjeksiyon" seçin ve "enjeksiyon ses seviyesinde 5 µL" girişi.</li>
		<li>UHPLC içinde pompa parametrelerini oluşturun.<ol>
<li>Tıklayın "BinPump2 | Pompa parametreleri oluşturmak için kurulum". "Akış" "0.25 mL/dk" ve "işlem", "15 dakika" ayarlayın.</li>
			<li>"Solvent B % 5" ayarlayın ve "sınırları"Max 600 barda"basınç".</li>
			<li>Tıklayın "BinPump2 | Uçus tarifesi"isocratic 5mC analiz için elüsyon parametreleri oluşturmak için. Bir satır eklemek için "Ekle" seçeneğini tıklatın. Giriş "0.00" "Zaman" ve "5.0" "B %". Bir kez daha yeni bir satır eklemek için "Ekle" seçeneğini tıklatın. Giriş "15.00" "Zaman" ve "5.0" "B %".</li>
			<li>Tıklayın "BinPump2 | Uçus tarifesi"5hmC analiz için degrade elüsyon parametreleri oluşturmak için. "Bir satır eklemek için Append. tıklatın 0.00 zaman ve 5.0 "B %" giriş. Bir kez daha yeni bir satır eklemek için "Ekle" seçeneğini tıklatın. Giriş "3.00" "Zaman" ve "5.0" "B %". "Başka bir 6 kere 6 satır eklemek Ekle" seçeneğini tıklatın. "Zaman" ve "5.0" "B %", "3.01" "Zaman" ve "15,0", "B %", "6,00"Zaman"," ve "15,0" "B %", "6,01" "Zaman" ve "100", "B %", "10.00" "Zaman" ve "100,0", "B %", "10,01"Zaman"," ve "5.0" "B %", "15.00" sırada girdi. Not: 5mC ve 5hmC ayrı ayrı UHPLC farklı ayırma şartları nedeniyle analizi gerçekleştirin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>UHPLC sütun kompartımanda (TCC) sıcaklığı parametrelerini oluşturun. Tıklatın "TCC | Kurulum | sıcaklık (solda) "ve"30 ° C"girdi.</li>
		<li>QQQ-MS/MS parametrelerini kurun.<ol>
<li>Tıklatın "MS QQQ | Durma zamanı | Hayır limit/olarak pompa"," İyon kaynağı | ESI"," zaman filtreleme | En yüksek Genişlik: 0,07 min ". Kurmak "zaman kesimleri: başlangıç saati: 0"; "Tarama türü: MRM"; "Div değeri: MS"; "Delta EMV (+): 200" ve "Delta EMV (-): 0".</li>
			<li>5mC, D3geçişler izleme parametreleri oluşturmak-5mC, dC, 5hmC ve D3-5hmC<ol>
<li>Tıklatın "MS QQQ | Edinme | Kesimleri taramak: durmak: 90"; "Fragmentor: 90"; "Çarpışma enerji: 5"; "Hücre Hızlandırıcı voltajı: 4" ve "polarizasyon: pozitif".</li>
				<li>"5mC" "Bileşik ad?", "242" "Öncü iyon", "126" "Ürün iyon" adlı 5mC analiz için giriş. Sağ tuşuna tıklayın ve "satır ekle" seçin Yeni bir satır eklemek için. Giriş "D3-5mC", "Bileşik ad?", "Öncü iyon", D3için "Ürün iyon", "129", "245"-5mC analizi.</li>
				<li>Başka bir üç satır aynı modunu kullanarak ek. "DC" "Bileşik ad?", "228" "Öncü iyon", "112", "Ürün iyon" dC analiz için giriş. "5hmC" "Bileşik ad?", "258" "Öncü iyon", "142" "Ürün iyon" adlı 5hmC analiz için giriş. Giriş D3-adı, "261", "Öncü iyon", D3için "Ürün iyon", "145" bileşik, 5hmC-5hmC analizi.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Gaz kaynak parametrelerini oluşturun. Tıklatın "MS QQQ | Kaynak | Kaynak parametreleri: gaz Temp: 300 ° C "; "Gaz akışı: 11 L/min"; "Nebulizatör: 15 psi"; "Pozitif-kılcal: 3500 V".</li>
			<li>Önerilen yöntem kaydedin. Tıklatın "MS QQQ | Araç | «««Kaydet"yöntemi olarak. "Dizin" tarafından önerilen yöntem için bir yol seçin ve "Yöntem", içeriğindeki örneğin girerek yöntemi için bir ad verin: 5mC ve 5hmC analizi.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
UHPLC ayırma ve mononucleosides MS/MS Analizi
	<ol>
<li>Mobil faz 5mC ve sitozin için hazırlamak (C) Analizi: mobil faz çözüm A ve B. çözüm A: 500 mL Ultrasaf Su 500 µL formik asit ile (son konsantrasyonu: % 0,1) ve % 100 metanol çözüm B: 500 mL. Çözüm A ve B 95:5 (v: v) 5mC ve (6.1.3.3 adımda ayarla) C elute için mobil faz olarak karıştırın. 0.25 mL/dk (6.1.3.1 adımda ayarla) akış hızını ayarlayın.</li>
		<li>Çözelti A ve B tarafından mobil faz 5hmC analiz için hazırlayın. Çözelti A olduğunu 2.0 mM NH4HCO3 sulu çözüm (pH 9.0) (500 mL), ve solvent B % 100 metanol (500 mL). En iyi duruma getirilmiş bir degrade elüsyon tarafından ayrı 5hmC: 0-3 dk, %5,0 B ve % 95 A (v: v); 3-6 dk, %15,0 B ve % 85'a; 6-10 min, %100 B; 10-15 dk, %5,0 B ve % 95'a (6.1.3.4 adımda ayarla). 0.25 mL/dk (6.1.3.1 adımda ayarla) akış hızını ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Electrospray MS/MS elüsyon sütun çözümlemek ve (6.1.5.2.1 adımda ayarla) pozitif iyon modu evlat edinmek için MRM modu (adım 6.1.5.1 ayarlandığında) kullanmaktadır.
	<ol>
<li>Geçişleri izlemek: 5mC, m/z 242→126 (çarpışma enerji, 5 eV); [D3]-5mC, m/z 245→129 (5 eV); dC, m/z 228→112 (5 eV); 5hmC, m/z 258→142 (5 eV); [D3]-5hmC, m/z 261→145 (5 eV) (adım 6.1.5.2.2 kümesinde).</li>
		<li>+3,500 V (6.1.5.3 adımda ayarla) kılcal ve parça gerilimleri set verin ve 90 V (içinde 6.1.5.2.1, sırasıyla).</li>
		<li>Enjeksiyon 5 µL ayarlamak ve 3 kez (6.1.2 adımda ayarla) her örneğini analiz. 5mC ve 5hmC miktarını değerlendirmek için karşılık gelen standart eğrileri kullanır.<ol>
<li>5mC standart eğri kurmak: 1 – 50 nM transfer (1, 5, 10, 20, 50 nM, son konsantrasyonu) standart çözüm 5mC içine santrifüj tüpleri ve 50 ekleyin nM [D3]-borular için 5mC. Ek için 50 µL. toplam hacim talimatları 5mC örnek (adım 6) için standart 5mC analizini gerçekleştirin.</li>
			<li>5hmC standart eğri oluşturmak: 1 – 20 nM transferi (1, 2, 5, 10, 20 nM, son konsantrasyonu) tüpler santrifüj kapasitesi ve 3 eklemek için 5hmC standart çözüm nM [D3]-tüpler için 5hmC. Ek için 50 µL. toplam hacim talimatları 5hmC örnek (adım 6) için standart 5hmC analizini gerçekleştirin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. analiz istatistiksel anlamlılık
<ol><li>
İstatistiksel analiz yazılımı kullanarak gerçekleştirin.
	<ol>
<li>Yazılımını açın ve "Sütun" "yeni tablo ve grafik içinde" seçin. Parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: "örnek veri | Başlangıç bir boş veri tablosu"; "Bir grafik ilk modu seçin"; "Çoğaltır veya hata çubukları grafik | Arsa | «««Demek"SEM ile.</li>
		<li>"Sırasıyla"A"ve"B"doğrultusunda Vc/PD0325901-tedavi ve kontrol grubunun üç çoğaltır girişine oluştur" u tıklayın. Altı verileri seçin ve "Analiz" "Analiz"'ı tıklatın.</li>
		<li>"T testleri (ve parametrik olmayan testler)" "İçinde sütun analizleri" seçin ve sonraki arayüzü girmek için "Tamam"'ı tıklatın.</li>
		<li>Parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: "Seç testi | Test adı | Unpaired t testi; Seçenekleri | İki kuyruklu"; "Güven aralıkları: % 95"; "Basamak | «««Show"4 basamak. Denetim ve Vc/PD0325901 tedavi arasında p değeri elde etmek için "Tamam" düğmesini tıklatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Denetim ve unpaired iki kuyruklu öğrenci tistihdam deneysel grupları arasında istatistiksel anlamlılık değerlendirmek-16test. Not: p < 0,05 istatistiksel önemi haiz fark gösterir. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.</li>
</ol>

<ol><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li>
<li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo-derived+stem+cells%3A+of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Eiselleova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+mouse+and+human+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.</a> Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).</li>
<li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).</li>
<li>Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+protocols+for+mouse+embryonic+stem+cell+culturing%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing.</a> Plos One. 8 (12), e81156(2013).</li>
<li>Yamaji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRDM14+ensures+naive+pluripotency+through+dual+regulation+of+signaling+and+epigenetic+pathways+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).</li>
<li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+inhibition+in+ESCs+drives+rapid+genome-wide+demethylation+to+the+epigenetic+ground+state+of+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).</li>
<li>Smith, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+regulatory+phase+of+DNA+methylation+in+the+early+mammalian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo.</a> Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).</li>
<li>Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+induction+of+Id+proteins+suppresses+differentiation+and+sustains+embryonic+stem+cell+self-renewal+in+collaboration+with+STAT3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3.</a> Cell. 115 (3), 281-292 (2003).</li>
<li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Leitch, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+pluripotency+is+associated+with+global+DNA+hypomethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).</li>
<li>Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+low-dose+toxicity+of+the+universal+solvent+DMSO%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO.</a> FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).</li>
<li>Yin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+enhances+Tet-mediated+5-methylcytosine+oxidation+and+promotes+DNA+demethylation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).</li>
<li>Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+modulates+NF%CE%BAB+phosphorylation+and+enhances+antimicrobial+activity+against+Staphylococcus+aureus+in+mesenchymal+stromal%2Fstem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">Minocycline modulates NFκB phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells.</a> Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171(2017).</li>
<li>Blaschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+induces+Tet-dependent+DNA+demethylation+and+a+blastocyst-like+state+in+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells.</a> Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+Tet+protein-mediated+5-methylcytosine+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation.</a> Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).</li>
<li>Inoue, A., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-dependent+loss+of+5-hydroxymethylcytosine+in+mouse+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos.</a> Science. 334 (6053), 194(2011).</li>
<li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li>
<li>Maiti, A., Drohat, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymine+DNA+glycosylase+can+rapidly+excise+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine%3A+Potential+implications+for+active+demethylation+of+CpG+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites.</a> J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).</li>
<li>Habibi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+bisulfite+sequencing+of+two+distinct+interconvertible+DNA+methylomes+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).</li>
<li>von Meyenn, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+DNA+methylation+maintenance+is+the+main+cause+of+global+demethylation+in+naive+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells.</a> Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).</li>
<li>Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEK+inhibitor+PD0325901+and+vitamin+C+synergistically+induce+hypomethylation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells.</a> Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).</li>
<li>Hackett, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+mechanisms+of+DNA+demethylation+during+transition+to+ground-state+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency.</a> Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).</li>
<li>Nakaki, F., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRDM14%3A+a+unique+regulator+for+pluripotency+and+epigenetic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming.</a> Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).</li>
<li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22855723">Pluripotency in the embryo and in culture.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir potansiyel çıkar çatışmaları ifşa.

Çalışma, biz Vc ve PD0325901 fare ES hücreleri de novo DNA bastırmak ve DNA demethylation Vc tarafından teşvik sinerjik bir eylem tarafından elde edildi bir farklılaşmamış ve hypomethylated devlet sürdürebilmek için birleştirme bir roman yöntemi gösterdi metilasyon tarafından PD0325901. Ayrıca, fare ES hücreleri Vc/PD0325901 kültür sistemi altında büyük morfoloji gösterdi.
Daha iyi fare ES hücreleri durumunu Vc/PD0325901 kültür sistemi içinde sürdürmek için bazı önemli adımlar vardır....

ES hücreler blastosist1ICM kökenli. Hücreler pluripotent durumdadır ve tüm somatik soy ve germline hücreleri2oluşabilir. Kuruluş ES Hücre geliştirme araştırmak için fırsat vitro işler ve hücreler için onların pluripotency3dayalı rejeneratif tıp tıbbi konu ile ilgili-ebilmek oluşturmak sağlar.
İki grup seminally fare ES hücre hatları 1981 yılında kurulan ve ne zaman erken fare embriyo elde edilen hücreleri (FBS) fetal Sığır serum kültürlü-orta fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) ile besleyici katman1,4 içeren . MEFs mitotically inaktive ve yemekleri ES Hücre kültürü çalışmalarının önce önceden yetiştirilmiştir. MEFs fare ES Hücre eki için destek sağlar ve yayma teşvik ve farklılaşma5, FBS temel trofik faktörler ve hormonlar hücre çoğalması için sunarken bastırmak için büyüme faktörleri üretmek. Sonraki çalışmalar besleyici hücreler tarafından üretilen LIF kendini yenileme ve fare ES hücrelerdeki pluripotency için anahtar sitokin yapıldı ve LIF yanı sıra Orta içine için besleyici hücreler6yerine olabilir göstermiştir. Şu anda, fare ES hücrelerde besleyiciler FBS/LIF ortamda sustainment hala pek çok araştırmacı tarafından kabul edilen standart yöntemdir. Ancak, bazı sorunlar ile bu klasik kültür yaklaşım ortaya. İlk olarak, besleyici hücreler aşırı ve kontrolsüz faktör salgılar ve patojen bulaşma7neden olabilir. Yemekleri jelatin ile yüzeyi ve LIF eklenmesi serum içeren kaplama bu girişimi engellemek için orta besleyici katmanlı hücre olmadan fare ES hücreleri korumak için alternatif yöntemler vardır. Ayrıca, fare ES hücreleri serum/LIF koşullar altında yetiştirilen morfolojik heterojenite hücre popülasyonlarının ve hatta pluripotency ile ilgili faktörler8ifade düzeyini sergi. Son yıllarda yapılan çalışmalarda serum/LIF koşullar altında LIF ve WNT sinyal aracılığıyla pluripotency (SOX2, MicroRNAs ve OCT4 dahil) pluripotency ilgili çekirdek transkripsiyon faktörleri ayakta olabilir öneririz; Ancak, özellikle, onlar da farklılaşma8tetiklemek için fibroblast büyüme faktörü (FGF) sinyal etkinleştirin. Çekirdek transkripsiyon faktörleri kararsız çift eylem nedeniyle, fare ES hücre içinde serum kültürlü ICM ve astarlanmalıdır epiblast devlet8benzeyen başka bir benzer bir iki değiştirilebilir nüfus oluşan heterojen, mevcut. Ayrıca, ICM ve PGCs onların pluripotency9,10ile yakından bağlantılı bir küresel hypomethylated durumda ise serum hücrelerde fare ES kez küresel hipermetilasyon9, sergi.
Fare ES Hücre kültürü çalışmalarının için yeni yöntemler geliştirmek için önemli bir talep var. Birkaç gelişmiş protokol 200311 ' den beri kurduk ama orada bazı sınırlamalar ve eksiklikleri7olmaya devam ediyor. 2008, iki küçük molekülü kinaz inhibitörleri, PD0325901 kombine kullanımı (inhibitörü olan mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) / hücre dışı sinyal düzenlenir kinaz (ERK) (MEK)) ve CHIR99021 (inhibitörü olan glikojen sentaz kinaz 3 (GSK3)), N2B27 ' Orta LIF ve serum olmadan kodlamayla fare ES12hücreleri için yeni perspektifler açtı. Bu yeni tanımlanmış orta iki inhibitörleri (2i) kullanımı ile karakterizedir. 2i/LIF ortamda kültürlü fare ES Hücre popülasyonlarının ve pluripotency faktörler ifade daha homojen hücrelerdir. Buna ek olarak, 2i/LIF-kültürlü fare ES hücre DNA hypomethylation genel olarak ICM benzeri hücreler9,13için daha yakın olan sergi. Öyle olsa bile, 2i kültür kendi dezavantajları vardır. PD0325901 ve CHIR99021 suda çözünmez ve genellikle dimetil sülfoksit (DMSO) çözülür-kültür ortamında eklemek için hisse senedi çözüm tabanlı. Çalışmalar bu uzun vadeli gösterdi ve hücre düşük doz maruz DMSO sitotoksisite14' e neden olabilir.
Burada, iki küçük molekül bileşikler kullanılan ve fare ES Hücre yeni bir kültür yöntemi geliştirdi. Roman kültür yöntemi DNA hypomethylation hızla tanıtmak için Vc ve MEK inhibitörü PD0325901 birleştirir ve etkili bir şekilde PGC karşılaştırılabilir düzeyde için Vc/PD0325901 kodlamayla protokolü olarak adlandırılmış. Vc/PD0325901-eklendi serum içeren orta fare ES hücrelerde homojenliği morfoloji içinde sergilemek ve bir yere durumda sürekli. 2i kültür için karşılaştırıldığında, Vc/PD0325901 koşullar altında kültürlü fare ES hücre DNA demethylation daha hızlı kinetik sergi ve hypomethylation düzeyi PGC karşılaştırılabilir ulaşabilirsiniz. Buna ek olarak, tek inhibitörü (PD0325901) kullanımı giriş DMSO ile karşılaştırıldığında 2i içinde kullanılan orta içine azaltır (PD0325901/CHIR99021) ve hücrelere zarar azaltır.

<table><tbody><tr><td>fetal sığır serumu Avustralya kaynak</td><td>Corning</td><td>35-076-CV</td><td>Fare ES hücre ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>DMEM/yüksek glikoz</td><td>Hyclone</td><td>SH30022</td><td>Fare ES hücre ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Millipore ESG1107</td><td></td><td>Fare ES hücre ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>esansiyel olmayan amino asitler (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>Fare ES hücre ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>sodyum piruvat</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Fare ES hücre ortamının</td></tr><tr><td>bileşeni L-glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>Fare ES hücre ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>penisilin streptomisin çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Fare ES hücre ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td>Hücreler durulama</td></tr><tr><td>tripsin</td><td>Hipon</td><td>SH30042</td><td>Hücre ayrışması</td></tr><tr><td>jelatin</td><td>Sigma</td><td>48722</td><td>Hücre</td></tr><tr><td></td> kültürü için <td>Stemolekül</td><td>04-0006-10</td><td>küçük moleküllü kimyasal</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemolekül</td><td>04-0004</td><td>hücre kültürü için küçük moleküllü kimyasal</td></tr><tr><td>PD0325901 çanak kaplama C vitamini</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd&nbsp;</td><td>Hücre</td><td>kültürü için XW00508171 küçük moleküllü kimyasal</td></tr><tr><td>Ultra Bioscience su arıtma sistemi</td><td>Purelab</td><td>Ultra</td><td>Ultra su</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Hücre dondurma ortamı</td></tr><tr><td>santrifüjleyici</td><td>Eppendorf</td><td>5427R</td><td>DNA ve protein ekstraksiyon</td></tr><tr><td>proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>RIPA tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>PMSF Proteaz İnhibitörü</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>36978</td><td>RIPA tamponunun</td></tr> bileşeni <tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>RIPA tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td>RIPA tamponunun</td></tr> bileşeni <tr><td>Genomik DNA Saflaştırma Kiti&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A1125</td><td>Genomik DNA ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>DNA konsantrasyonunun belirlenmesi</td></tr><tr><td>buzağı bağırsak fosfatazı</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290</td><td>DNA sindirimi</td></tr><tr><td>DNaz I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303</td><td>DNA sindirimi</td></tr><tr><td>yılan zehiri fosfodiesteraz I</td><td>Sigma</td><td>P4506</td><td>DNA sindirimi</td></tr><tr><td>Nanosep 3K Omega</td><td>Pall</td><td>OD003C35</td><td>sindirilmiş DNA</td></tr><tr><td>1290 UHPLC sisteminin</td> filtrasyonu <td>Agilent&nbsp;</td><td>1290</td><td>UHPLC ayırma</td></tr><tr><td>G6410B üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>G6410B</td><td>MS/MS analizi</td></tr><tr><td>Zorbax Eclipse Plus C18 sütunu</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>UHPLC ayırma için</td> <td>Zorbax Eclipse Plus</td> sütunu</tr><tr><td>5-metilsitozin</td><td>Solarbio Yaşam Bilimleri</td><td>SM8900&nbsp;</td><td>standart 5mC</td></tr><tr><td>5-hidroksimetilsitozin (standart)</td><td>Toronto Araştırma Kimyasalları</td><td>M295900</td><td>standardı 5hmC</td></tr><tr><td>Prdm14 antikor</td><td>biyodünya</td><td>BS7634</td><td>Western blot analizi-birincil antikor</td></tr><tr><td>Dnmt3a antikoru</td><td>bioworld</td><td>BS6587</td><td>Western blot analizi-birincil antikor</td></tr><tr><td>Dnmt3b antikoru</td><td>abcam</td><td>ab13604</td><td>Western blot analizi-birincil antikor</td></tr><tr><td>Dnmt3l antikoru</td><td>abcam</td><td>ab3493</td><td>Western blot analizi-birincil antikor</td></tr><tr><td>Dnmt1 antikoru</td><td>abcam</td><td>ab13537</td><td>Western blot analizi-birincil antikor</td></tr><tr><td>&beta;-tubulin antikoru</td><td>bioworld</td><td>BS1482MH</td><td>Western blot analizi-birincil antikor</td></tr><tr><td>keçi anti-tavşan IgG</td><td>abcam</td><td>ab6721</td><td>Western blot analizi-ikincil antikor</td></tr><tr><td>keçi anti-fare IgG</td><td>abcam</td><td>ab6789</td><td>Western blot analizi-ikincil antikor</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>RNA ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>ters transkripsiyon sistemi</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td>RNA ters transkripsiyon</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6001</td><td>RT-PCR</td></tr><tr><td>StemTAG alkalin fosfataz boyama ve aktivite test kiti</td><td>Hücreler Biyolaboratuvarlar A.Ş.</td><td>CBA-302&</td><td>nbsp; alkalin fosfataz boyama analizi</td></tr><tr><td>fare ES hücreleri: WT, 129 SvEv</td><td>Profesör Guoliang Xu (Şanghay Biyolojik Bilimler Enstitüleri, Çin Bilimler Akademisi, Şangay, Çin)</td><td></td> tarafından sağlanmıştır) <td>fare ES hücrelerinin hücre</td></tr><tr><td>suşu mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td>hücre gözlemi</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5.0</td><td>GraphPad Prism Software Inc.</td><td>5.0</td><td>İstatistiksel Analiz</td></tr></tbody></table>

fare embriyonik kök hücre kullanarak mek inhibitörü pd0325901 ve c vitamini genomik hypomethylation korumak için bir alternatif kültür yöntemi

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

Embriyonik kök (ES) hücre katmanlardan herhangi birini üç germ (endoderm, mesoderm veya ektoderm) ayırt etmek için potansiyel var ve rejeneratif tıp için birçok soy oluşturabilir. ES hücre kültür vitro uzun yaygın kaygıları konu olmuştur. Klasik, fare ES hücreleri serum ve lösemi inhibitör faktörü (LIF) korunur-orta içeren. Ancak, serum/LIF koşullarda hücreleri heterojen Morfoloji ve pluripotency ilgili genlerin ifade profil göster ve çoğunlukla bir metastable durumdadır. Ayrıca, kültürlü ES hücreleri küresel hipermetilasyon sergi, ama saf ES hücrelerinin iç hücre kütlesi (ICM) ve primordial germ hücreleri (PGCs) bir küresel hypomethylation durumdadır. ICM ve PGCs hypomethylated devlet onların pluripotency ile yakından ilişkilidir. Fare ES hücre kültür yöntemleri geliştirmek için biz son zamanlarda iki küçük molekül bileşikler DNA hypomethylated ve pluripotent durumunu korumak için seçmeli olarak kombine kullanımı dayalı yeni bir yöntem geliştirdi. Burada, biz bu vitamin C (Vc) eş tedavisi mevcut ve PD0325901 5-metilsitozin (5mC) yaklaşık yüzde 90'ını fare ES hücrelerde 5 gün silebilirsiniz. Oluşturulan 5mC içerik PGCs içinde için karşılaştırılabilir olduğunu. Mekanik soruşturma PD0325901 up-Prdm14 ifade Dnmt3b bastırmak için düzenleyen olduğunu gösterir (de novo DNA metiltransferaz) ve Dnmt3l (Dnmt3b kofaktör), de novo 5mC sentezini azaltarak. VC pasif ve aktif DNA demethylations tutulumu gösteren 5-Tet1 ve Tet2, esas katalize arasında bakterilerde görülen (5hmC) 5mC dönüşümünü kolaylaştırır. Ayrıca, Vc/PD0325901 koşullar altında fare ES hücreleri homojen Morfoloji ve pluripotent durumu gösterir. Topluca, biz bir roman ve DNA hypomethylation ve pluripotency fare ES hücrelerdeki bakım ulaşmak için kimyasal-synergy kültür yöntemi öneriyoruz. Küçük molekül kimyasal bağımlı yöntem serum kültür ve daha fazla klinik uygulamaları ve araştırmalar için homojen ES hücreler üretmek için tutar söz önemli eksiklikleri üstesinden gelir.

VC/PD0325901 sinerjik fare ES Hücre küresel silme indüklenen. Serum fare ES hücrelerde DNA hipermetilasyon, süre pluripotent ICM hücreler ve PGCs DNA metilasyon küresel silme göstermek ve hypomethylated devlet onların pluripotency9,10ile yakından ilişkilidir sergi.
Daha önce biz ve diğerleri Vc Tet-aracılı 5mC demethylation15,<sup class...

Fare embriyonik kök hücre kültürü çalışmalarının iki kimyasal tabanlı protokol ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu yeni yöntem Tet-aracılı oksidasyon (vitamin C) teşvik ve DNA hypomethylation ve fare embriyonik kök hücreler pluripotent korumak için 5-metilsitozin (PD0325901 tarafından) de novo sentezi bastırmak sinerjik mekanizmaları kullanır.

Fare embriyonik kök hücre kullanarak MEK inhibitörü PD0325901 ve C vitamini genomik Hypomethylation korumak için bir alternatif kültür yöntemi

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

Bu protokolün genel amacı, fare embriyonik kök hücrelerinde hipometillenmiş ve pluripotent bir durumu korumak için küçük moleküllü bileşikler PD0325901 ve C Vitamini kullanmaktır. Bu yöntem, morfolojideki heterojenite ve dehipermetilasyon gibi FBS kültürlenmiş fare embriyonik kök hücreleri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, fare embriyonik kök hücrelerinin mükemmel morfolojiyi ve hipometillenmiş ve farklılaşmamış durumu sürdürebilmesidir.Plakaları ve tamponları hazırladıktan sonra, metin protokolüne göre, fare ES hücrelerini, kültür ortamını, tripsin ve PBS'yi 37 santigrat derecede bir su banyosunda önceden ısıtın. Hücreleri geçirmek için, ortamı çanaktan aspire edin ve hücreleri iki kez durulamak için iki mililitre PBS kullanın. Daha sonra PBS'yi çıkarın ve hücrelere 0.3 mililitre tripson EDTA ekleyin ve çözeltideki hücreleri kaplamak için tabağı hızla eğin.Tripsini hemen çıkarın ve hücreleri ayırmak için plakayı bir dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Tripsini etkisiz hale getirmek için iki mililitre önceden ısıtılmış serum ortamı ekleyin ve hücre kolonilerini 10 kez tek bir hücre süspansiyonuna yeniden süspanse etmek için beş mililitrelik bir pipet kullanın. Hücre çözeltisinin 150 mikrolitresini altı santimetrelik yeni bir jelatin kaplı tabağa koyun ve üç mililitre taze yapılmış VCPD0325901 ortamı ile destekleyin.Hücreleri 37 santigrat derece ve yüzde beş CO2'de kültürleyin. Vc'nin kararsızlığı nedeniyle, inkübe sırasında her 24 saatte bir, eski kültür ortamını çıkarın ve üç mililitre taze Vcpd0325901 ortamı ekleyin. Yüzde 70 ila 80 birleşmeye ulaştıktan sonra, hücreleri geçirin ve az önce gösterildiği gibi kültürlemeye devam edin.DNA ekstraksiyonunu gerçekleştirmek için, hücreleri daha önce gösterildiği gibi tripsin ile toplayın ve üreticinin talimatlarını izleyerek bir genomik DNA saflaştırma kiti kullanın. DNA tüpüne 100 mikrolitre ultra saf su ekleyin ve DNA'yı yaklaşık 15 kez pipetleyerek çözün. Ardından, DNA'nın konsantrasyonunu ve kalitesini belirlemek için Od260 ila 280 oranını ölçmek için bir spektrofotometre kullanın.DNA konsantrasyonu mikrolitre başına yaklaşık 500 nonogram olmalıdır. Daha sonra, beş mikrogram DNA'yı beş mikrolitre 100 milimolar tris hidroklorür PH7.6, iki birim buzağı bağırsak fosfatazı, bir birim Dnase ve 0.005 birim yılan zehiri, fosfodiesteraz bir ile birleştirerek sindirin. Ardından, hacmi 50 mikrolitreye çıkarmak için ultra saf su kullanın.Reaksiyonu gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi sabah, numuneyi bir dakika boyunca oda sıcaklığında 1.000xg'de santrifüjleme ile toplayın. Daha sonra çözeltiyi ultra filtrasyon tüplerine aktarın ve sindirim enzimlerini çıkarmak için numuneleri 13, 000xg ve 4 santigrat derecede 30 dakika döndürün.Numuneleri 5HMC analizine hazırlamak için, 36 mikrolitre filtratı bir mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve üç nanomolar nihai konsantrasyon için dört mikrolitre D35HMC ekleyin. 5MC analizi için, 196 mikrolitre ultra saf suyu yeni bir santrifüj tüpüne pipetleyin ve genomik DNA'daki 5MC'nin yüksek yoğunluğu nedeniyle dört mikrolitre filtrat ekleyin. Seyreltilmiş 5MC çözeltisinin 36 mikrolitresini yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve 50 nanomolar nihai konsantrasyon için dört mikrolitre D35MC ekleyin.Sırasıyla 35HMC ve 35MC'yi kalibre etmek için dahili standartlar olarak D5HMC ve D5MC'yi kullanın. UHPLCMS yazılımında 5MC ve 5HMC'yi analiz etmek için parametreleri ayarladıktan sonra, metin protokolüne göre, MS QQQ'ya tıklayarak QQQMSMS için parametreleri oluşturun. Durma süresi için Limit yok/Pompa Olarak'ı seçin.İyon kaynağı için ESI'yi seçin. Zaman filtrelemesi için Tepe genişliği'ni işaretleyin ve 0,07 dakika girin. Zaman segmentlerini ayarlamak için, başlangıç zamanı için sıfır'ı seçin.Sütundaki imayı analiz etmek üzere MRM'de tarama modunu ayarlamak için, tarama türü için MRM'yi seçin. Div Değeri için MS'e'yi seçin. Delta EMV artı için 200 ve Delta EMV eksi için sıfır girin. Önce MSQQQ bir edinime tıklayarak geçişleri izlemek için parametreleri oluşturun.Tarama segmentlerini ayarlamak için, Duraklama için 90 girin. Fragmentor için parça voltajlarını ayarlamak için 90 girin. Çarpışma Enerjisi için beş girin.Hücre Hızlandırıcı Voltajı için dört girin. Pozitif iyon modunu ayarlamak için Polarite için pozitifi seçin. Mononükleozitlerin UHPLC ayrımını gerçekleştirmek için, çözelti a için 500 mililitre ultra saf su ile 500 mikrolitre formik asidi karıştırarak 5MC ve sitozin iması için a ve b çözeltilerini hazırlayın.Daha sonra 500 mililitre yüzde 100 metanol ve çözelti b'yi ölçün. Çözelti a ve çözelti b'yi 5MC ve C'yi elüte etmek için mobil faz olarak 95'e beş hacim / hacim oranında karıştırın. Optimize edilmiş bir gradyan imlaması kullanarak 5HMC'yi ayırın.Ardından akış hızını dakikada 0,25 mililitre olarak ayarlayın. 5MC, D35MC, DC, 5HMC ve D35HMC için geçişleri izleyin. Kılcal gerilimleri 3.500 volt olarak ayarlayın.Ardından enjeksiyon hacmini 5 mikrolitreye ayarlayın ve her numuneyi üç kez analiz edin. Metin protokolüne göre 5MC ve 5HMC miktarını değerlendirmek için ilgili standart eğrileri kullanın. UHPLC MSMS ile fare ES hücrelerinde genomik DNA'nın bu analizinde görüldüğü gibi, VcPD0325901 tedavisi DNA metilasyonunda daha hızlı bir düşüşe neden oldu ve beş gün sonra sabit beş MC seviyesine ulaşırken, Vc 2i tedavisi 11. günde karşılaştırılabilir bir seviye ile sonuçlandı.Bu grafik, Vc içeren tedavinin bir gün sonra 5HMC frekansını önemli ölçüde artırdığını ve daha sonra 5MC substratındaki ilerleyici bir azalmaya bağlı olarak 5HMC seviyelerinin kademeli olarak azaldığını göstermektedir. Western blot analizi, Prdm14'ün önemli ölçüde yükseldiğini, Dnmt3b ve ko-faktörü Dnmt3l'nin, hücreler PD0325901 ile geri çekildiğinde önemli ölçüde aşağı regüle olduğunu gösterdi, bu da PD0325901'nin 5MC'yi silmedeki etkisini gösteriyor. Bu alkalin fosfataz testinde, fare ES hücrelerinin tümü, VcPD032590'da 26 gün boyunca yetiştirildiğinde top benzeri bir morfoloji ile mor renkte boyandı, bu da farklılaşmamış bir durumu gösteriyor.Buna karşılık, tek başına besiyeri içeren FBS'de yetiştirilen hücreler, kısmi farklılaşmayı gösteren kısmi yayılma ile açık renkli göründü. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa beş saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, FBS'nin önceden taranması gerektiğini hatırlamak önemlidir.Ayrıca, hücreleri geçiş boyunca aşırı pipetlemekten ve VcPDO325901 kültür ortamını günlük olarak değiştirmekten kaçının. Bu gelişmeden sonra, bu teknik, in vitro embriyoların gelişimini ve süreçlerini ve rejeneratif tıp için tıbbi öneme sahip üretilen hücreleri in vitro olarak fare ES hücrelerinin kültürlenmesi alanındaki araştırmacıların yolunu açmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, MEK inhibitörü PD0325901 olan iki küçük moleküler bileşen kullanarak fare ES hücreleri için büyüme morfolojisinin ve hipermetillenmiş ve çoğul güçlü durumun nasıl korunacağını daha iyi anlamış olmalısınız.Trisol, DMS veya PMS ve DTT ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken eldiven, maske ve gözlük takmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

an-alternative-culture-method-to-maintain-genomic-hypomethylation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Fare embriyonik fibroblast (MEFS) kalitesi, CF-1 gibi farenin sağ suşu tarafından dikte edilir. Bu elde edilen Pluripotency destekleyici MEFS ve klimalı ortam (CM) işbirliği içinde kendini yenileyen ve pluripotency korumak için aktivin / Düğüm ve FGF yolları için gerekli aktivin A, Gremlin ve Tgfβ1 optimal konsantrasyonu içermelidir.

Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması

Burada, ayrışmış tek hücrelerin koloni dışı tip tek tabakalı (NCM) büyümesine dayanan insan pluripotent kök hücre (hPSC) kültür protokollerini sunuyoruz. Rho ile ilişkili kinaz inhibitörleri veya laminin izoform 521 (LN-521) kullanan bu yeni yöntem, büyük miktarlarda homojen hPSC'lerin üretilmesi, genetik manipülasyon ve ilaç keşfi için uygundur.

İnsan Pluripotent için alternatif Kültürleri Hücre Üretim, Bakım ve Genetik Analizi Kök

Burada açıklanan protokol, minimal bir transkripsiyon faktörü setinin aşırı ekspresyonu yoluyla fare embriyonik fibroblastlarında bir hemojenik programın indüksiyonunu detaylandırır. Bu teknoloji, hematopoez, hematolojik hastalık ve hematopoietik kök hücre nakli ile ilgili gelecekteki çalışmalar için platformlar sağlamak üzere insan sistemine çevrilebilir.

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

Bu protokol, serumdan türetilmiş fare embriyonik kök hücrelerin içinde (Mesc) -conditioned ortamı (Mesc-CM) için bir yöntem sağlar (fetal inek serumu, FBS) - ve besleyici (fare embriyonik fibroblastlar, MEF'ler) bir hücrenin içermeyen koşullar -ücretsiz yaklaşım. Bu yaşlanma ve yaşlanma ile ilişkili hastalıkların tedavisi için uygun olabilir.

Serum- toplanması ve Besleyici serbest Fare Embriyonik Hücre içermeyen Yaklaşım Hücre klimalı Orta Kök

Proteinler genellikle farklı hücresel fonksiyonları sarf edebilirsiniz birden çok etki içerirler. Gen irtibat kutusu kapağı (KO) bu işlevsel çeşitliliği dikkate almaz. Burada, çeşitli işlevsel etki alanları veya bir proteinin varyantlarının moleküler diseksiyon sağlar KO embriyonik kök hücrelerin bir rekombinasyon aracılı kaset değişimi (RMCE) tabanlı bir yapı-işlev yaklaşım sunulmuştur.

Recombinase aracılı Kaset Değişimi Kullanarak Fare Embriyonik Kök Hücre yapı-fonksiyon Çalışmaları

Bu makalede, verimli bir şekilde elde ve pluripotent kök hücre satırlarından fare embriyoların blastosist aşamasında kültür için bir protokol.

Fare Preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarından türetme

Biz fare klonlama trichostatin A, C vitamini ve deiyonize sığır serum albümin kullanarak büyük ölçüde geliştirilmiş bir yöntem açıklanmaktadır. Verimli klonlanmış embriyo gelişimini destekleyen bir basitleştirilmiş, tekrarlanabilir protokol gösteriyoruz. Bu nedenle, bu yöntemi fare klonlama için standart bir prosedür haline gelebilir.

Kombinasyon tedavisi Trichostatin A ve C vitamini fareler somatik hücre nükleer Transfer tarafından klonlama daha etkili olmasını sağlar.

Kromatin çevre düzenlenmesi uygun gen ekspresyonu için gerekli temel bir işlemdir. Burada, biz gen ekspresyonu kromatin değiştirme alımı yoluyla kontrol etmek için bir yöntem tarif gene özgü ve geri dönüşümlü bir şekilde makine.

Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak

Burada, rastgele olmayan X kromozom inactivation ile uygulanabilir bir kadın duvar modeli oluşturmak için bir protokol tarif, yani, maternally miras X kromozom hücrelerde% 100 ' de aktif değildir. Ayrıca, pasif X kromozom in vivo farmakolojik reaktivasyonunun fizibilite, tolerabilite ve güvenliğini test etmek için bir protokol açıklanmaktadır.

Pasif X kromozom üzerinde Mecp2 farmakolojik yeniden aktivasyonu için rasgele olmayan bir fare modeli

Burada, gen transfeksiyonuna veya retroviral vektörlere ihtiyaç duymadan, memeli pluripotent hücrelerini verimli bir şekilde üretmek için kimyasal epigenetik silme kullanımını mekanosensing ile ilgili ipuçlarıyla birleştiren bir yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, bu strateji translasyonel tıp için umut vericidir ve kök hücre organoid teknolojisinde kayda değer bir ilerlemeyi temsil etmektedir.

Memeli Pluripotent Hücreleri Üretmek için Epigenetik Modifikasyonu ve Biyomekanik İpuçlarını Birleştiren İki Adımlı Bir Strateji

Keşfedin fare embriyonik kök hücrelerinde PD0325901 ve C vitamini kullanarak hipometile durumu koruma yöntemini. Bu teknik çoğaltma ve plüripotensiyeli sürdürerek hücre morfolojisini geliştirir.

Fare embriyonik kök hücre kullanarak MEK inhibitörü PD0325901 ve C vitamini genomik Hypomethylation korumak için bir alternatif kültür yöntemi (Video) | JoVE Journal

Fare embriyonik kök hücre kullanarak MEK inhibitörü PD0325901 ve C vitamini genomik Hypomethylation korumak için bir alternatif kültür yöntemi

Daha fazla video keşfet