Birden çok besin kaynaklarının mikrobiyal metabolizma araştırmaya izotopik izleyici deneyler kombinasyonuna göre iş akışı

Bu prosedürün genel amacı, etiketli substratlar kullanarak çoklu besin kaynaklarının metabolizmasını kantitatif olarak araştırmaktır. Bu iş akışı, tüketilen besinlerin akıbetinin ve mayalar tarafından sentezlenen bileşiklerin metabolik kökeninin belirlenmesini sağlar. Bu yöntem, çevresel koşullara bağlı olarak tüm metabolizmanın nasıl çalıştığı gibi mikrobiyal metabolizma alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, birden fazla kaynaktan besin dağılımı proteininin aydınlatılmasına ve miktarının belirlenmesine izin vermesidir. Bu yöntem, mayanın azot metabolizmasını araştırmak için kullanılmıştır, ancak diğer metabolizmalara ve mikroorganizmalara da uygulanabilir. Bu deneyde başarının anahtarı, fermantasyonların tekrarlanabilirliğinde yatmaktadır.

Kullanıcılar, hücreleri aynı tanımlanmış fizyolojik aşamada toplamaya özellikle dikkat etmelidir. Prosedürü teknik ekibimizden Christian Picou, laboratuvardan doktora öğrencisi Pauline Seguinot ve doktora sonrası araştırmacı Stephanie Rollero gösterecek. Bir otoklavda, her bir nitrojen kaynağı için hazırlanan her bir sentetik ortamı, manyetik bir karıştırma çubuğu içeren bir litrelik bir şişede pastörize edin.

Ortamda istenen nihai konsantrasyona ulaşmak için uygun miktarda etiketli molekülü çözün. Tek kullanımlık bir vakum filtrasyon sistemi kullanarak ortamı sterilize edin. Steril bir ölçüm silindiri kullanarak, ortamı, manyetik bir karıştırma çubuğu içeren ve oksijen girişini önlemek ancak karbondioksit salınımına izin vermek için fermantasyon kilitleriyle donatılmış önceden sterilize edilmiş iki fermentör arasında bölün.

YPD ortamında bir cerevisiae suşu büyüttükten sonra, laminer akış altında bir ön kültür alikotu toplayın ve 100 mikrometrelik bir açıklığa sahip bir elektronik parçacık sayacı kullanarak hücre popülasyonunu ölçün. Ön kültürü santrifüjledikten sonra, mililitre başına 2,5 kat 10 ila 9. hücreler arasında bir nihai konsantrasyon elde etmek için peleti uygun bir hacimde steril suda askıya alın. Daha sonra, her fermentörü bir mililitre hücre süspansiyonu ile aşılayın.

Bunu takiben, fermentörleri 21 konumlu karıştırma plakalarına uygun şekilde yerleştirilmiş destek kılavuzlarına takarak bir fermantasyon platformu hazırlayın ve karıştırma hızını 270 RPM'ye ayarlayın. Her fermantasyonun çevrimiçi izlenmesini başlatmak için robot kontrol uygulamasını başlatın, Testi Başlat düğmesine tıklayın ve gerçekleştirilecek fermantasyon hacmini seçin. Görüntülenen arayüzün platformdaki fermentörlerin sayısının ve konumunun gösterilmesine izin verdiğinden emin olmak için, yuva konumuna sağ tıklayın ve boş konumların izlenmesini devre dışı bırakmak için Devre Dışı Bırak'ı seçin.

Hesaplama yazılımını başlatmak için Başlatıcı düğmesine tıklayın ve OK ile doğrulayın. Ardından, ağırlık alımlarını başlatmak için robot kontrol uygulamasının Başlat düğmesine tıklayın. Daha sonra, fermentörlerden alınan iki adet altı mililitrelik numuneyi 2.000 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüjleyin. Bittiğinde, her donmuş süpernatanı iki tüpe aktarın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Her peleti beş mililitre damıtılmış su ile iki kez yıkayın ve izotopik zenginleştirme ölçümü için eksi 80 santigrat derecede saklayın. Yüksek moleküler ağırlığa sahip molekülleri çıkarmak için 800 mikrolitre numuneye dahili standart olarak 2.5 milimolar norlösin içeren 25% sülfosalisilik asit çözeltisinden 800 mikrolitre ekleyin. İnkübasyon ve santrifüjlemeden sonra, karışımı 0,22 mikrometre gözenek boyutunda nitroselüloz membrandan süzün ve numuneyi bir amino asit analiz sistemine yerleştirin.

Analiz sisteminin programında veya yazılımında, bir katyon değişim sütunu ile donatılmış analizör ile sıvı kromatografi analizlerine başlamak için Çalıştır düğmesine tıklayın. Daha sonra, önceden hazırlanmış etiketli bir hücre peletini 200 mikrolitre performik asit içinde süspanse ederek oksitlenmiş bir ekstrakt hazırlayın. Dört santigrat derecede dört saat inkübe ettikten sonra, 33.6 miligram sodyum sülfat ekleyerek reaksiyonu durdurun.

Oksitlenmiş ekstrakta 800 mikrolitre altı normal hidroklorik asit ekleyin ve numuneyi kuru ısı fırınında 110 santigrat derecede 16 saat boyunca hava geçirmez şekilde kapatılmış bir cam tüp içinde inkübe edin. Numunenin oda sıcaklığına soğumasına izin verdikten sonra, 200 mikrolitre 2.5 milimolar nörolösin ekleyin ve hidrojen klorür gazını bir nitrojen akışı ile çıkarın. Kurutulmuş ekstraktı iki kez 800 mikrolitre damıtılmış su ve ardından 800 mikrolitre etanol ile yıkayın.

Ardından, ekstrakta 800 mikrolitre 200 milimolar lityum asetat tamponu ekleyin. Daha önce açıklanan kromatografik yöntemi kullanarak numunedeki proteinler içindeki amino asitlerin nispi konsantrasyonlarını belirleyin. 1.2 mililitre altı molar hidroklorik asit ekleyerek ve numuneyi kuru ısılı bir fırında sıkıca kapatılmış bir cam tüp içinde 105 santigrat derecede 16 saat inkübe ederek etiketli bir hücre peletini hidrolize edin.

Numunenin oda sıcaklığına soğumasına izin verdikten sonra 1,2 mililitre damıtılmış su ekleyin. Hücresel kalıntıları gidermek için santrifüjlemenin ardından, süpernatanı açık cam tüplerde altı adet 400 mikrolitrelik fraksiyona dağıtın. Fraksiyonları kuru ısıda 105 derece fırında şurup kıvamına gelene kadar dört ila beş saat kurutun.

Biyokütle hidrolizi sırasında, işlem asidini sık sık kontrol ederek fraksiyonu bir şurup kıvamına gelene kadar kurutun. ECF türevlendirmesi için, soğutulmuş kurutulmuş hidrolizatı 200 mikrolitre 20 milimolar hidroklorik asit ve 133 mikrolitre bir ila dört piridin ve etanol karışımı içinde çözün. Amino asitleri türevlendirmek için 50 mikrolitre etil kloroformat ekleyin.

Karbondioksit serbest bırakıldıktan sonra, türetilmiş bileşikleri çıkarmak için karışımı 500 mikrolitre diklorometan içeren santrifüj tüplerine aktarın. Örnekleri 10 saniye boyunca vorteksleyin. 10.000 kez G'de dört dakika santrifüjledikten sonra, her numunenin alt organik fazını bir Pasteur pipeti ile toplayın ve her bir numunenin doğrudan GCMS cihazına enjekte edilebilmesi için konik bir cam ek içeren bir GC otomatik numune alma cihazı şişesine aktarın.

ECF prosedürü için HPLC türevlendirme reaktifleri kullanılır. ECF reaktiflerini sık sık değiştirin. DMF-DMA türevlendirmesi için, kurutulmuş hidrolizatı 50 mikrolitre metanol ve 200 mikrolitre asetonitril içinde çözün.

300 mikrolitre DMF-DMA ekleyin ve numuneyi girdaplayın. Ardından, numuneyi konik bir cam ek içeren bir GC otomatik numune alma cihazı şişesine aktarın. BSTFA türevlendirmesi için, hidrolizatı 200 mikrolitre asetonitril içinde askıya alın.

Numuneye 200 mikrolitre BSTFA ekleyin ve cam tüpü hava geçirmez şekilde kapatın. 135 santigrat derecede dört saat inkübe edildikten sonra, soğutulmuş ekstraktı doğrudan konik bir cam ek içeren bir GC otomatik numune alma cihazı şişesine aktarın. Şimdi, numuneleri bir otomatik numune alma enjektörü ile donatılmış ve bir kütle spektrometresine bağlı bir gaz kromatografı ile analiz edin.

Bilgisayar yazılımı menüsünde Enstrüman'a tıklayın. Sıra sekmesi altında, bir örnek listesi oluşturmak için Örnek Günlük Tablosunu Düzenle'ye tıklayın ve enjeksiyonları başlatmak için Çalıştır ve Sırayı Çalıştır'a tıklayın. Analizler tamamlandıktan sonra, farklı kütle izotopomerlerine karşılık gelen her amino asit için bir yoğunluk kümesi kaydedin.

15 mililitrelik bir cam tüpte beş mililitre süpernatanıma 10 mikrolitre uygun döteryumlu iç standartlar ekleyin. Bir mililitre diklorometan ekleyin, tüpü sıkıca kapatın ve numuneyi 20 dakika boyunca sallanan bir platformda sallayın. Santrifüjlemeden sonra, alt organik fazı 15 mililitrelik bir cam tüpte toplayın.

Diklorometan ekstraksiyonunu tekrarladıktan sonra, organik ekstraktı 500 miligram susuz sodyum sülfat üzerinde kurutun ve sıvı fazı bir Pasteur pipeti ile toplayın. Ekstraktı nitrojen akışı altında dört kat konsantre edin. Ardından, konsantre numuneyi bir GC otomatik numune alma cihazı şişesine aktarın.

GCMS miktar tayini için, 10'a bir bölme oranına sahip iki mikrolitre numune enjekte edin ve ekstrakte edilen uçucu molekülleri uygun fırın sıcaklık profilini kullanarak ayırın. Metin protokolündeki elektronik tabloları kullanarak, hücre dışı amino asitlerin konsantrasyonuna, hücre kuru ağırlığına, hücrelerin protein içeriğine, uçucu moleküllerin konsantrasyonuna ve proteinojenik amino asitlerin ve uçucu moleküllerin izotopik zenginleşmesine karşılık gelen ham veri değerlerini girin. Şarap fermantasyonu sırasında bulunan çoklu nitrojen kaynaklarının maya ile yönetimini araştırmak için iş akışının şematik bir diyagramı burada gösterilmektedir.

Farklı örnekleme noktaları için, biyolojik parametreler fermenasyonlar arasında yüksek bir tekrarlanabilirlik göstermektedir. Azotun üzüm suyundaki kaynaklardan tüm proteinojenik amino asitlere yeniden dağılımına genel bir bakış burada gösterilmektedir. Kütle dengelerinin belirlenmesi ile birlikte, proteinojenik amino asitlerin izotopik zenginleşmesinin ölçümü, azot kaynaklı arginin, glutamin, amonyum ve diğer kaynakların bu bileşiklerin her birinin amin gruplarına katkısının ilk miktar tayinini sağlamıştır.

Doğrudan biyokütleye geri kazanılan tüketilen amino asit miktarı arasında bir karşılaştırma burada gösterilmektedir. Burada tüketilen alifatik amino asitlerin, lösin ve valinin mayadaki metabolik ağda bölünmesi gösterilmiştir. Tüketilen valin ve lösinin% 96'sından fazlası dönüşüm ürünlerinde geri kazanılır.

Şaşırtıcı bir şekilde, valin ve lösinin önemli bir kısmı, bu bileşiklerin ortamdaki mevcudiyeti ile biyokütle içeriği arasındaki önemli bir dengesizliğe rağmen katabolize edilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik beş gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, alt tabakanın etiketleme kısmını bilimsel konulara göre dikkatlice seçmeyi unutmamak önemlidir.

İyi bir biyolojik tekrarlanabilirlik sağlamak için, fermantasyon ve kromatografik analizi iki kez gerçekleştirin. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra mikrobiyoloji alanındaki araştırmacıların, mikroorganizmaların metabolizmasının ve fizyolojisinin çevresel koşullara bağlı olarak nasıl değiştiğini keşfetmelerinin önünü açmıştır. Türevlendirme reaktifleri ve arginin çözücü ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven giymek ve davlumbaz altında çalışmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.