Name: Birden çok besin kaynaklarının mikrobiyal metabolizma araştırmaya izotopik izleyici deneyler kombinasyonuna göre iş akışı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Öğrenin, izotopik izleyici deneyleriyle mikrobiyal metabolizmayı nicel olarak incelemeyi. Bu yöntem, besin kaynaklarının metabolik kaderini ve sentezlenen bileşiklerin kökenini belirler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jean-Roch Mouret, Sylvie Dequin ve Jean-Marie fermantasyon robot destekli sistem anlayışı katkıda bulunmak için Sabalyrolles ve Martine Pradal, Nicolas Bouvier ve Pascale Brial teknik desteklerinden dolayı teşekkür ederiz. Bu proje Recherche et Ministère de l'Education Nationale, de la tarafından sağlanan için finansman de la Technologie.

<ol><li>Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fifteen+years+of+large+scale+metabolic+modeling+of+yeast%3A+developments+and+impacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts.</a> Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).</li>
<li>Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+identification+and+flux+quantification+in+the+central+metabolism+of+Saccharomyces+cerevisiae+under+different+conditions+of+glucose+repression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression.</a> J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).</li>
<li>Wiechert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">13C metabolic flux analysis.</a> Metab Eng. 3, 195-206 (2001).</li>
<li>Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+metabolic+flux+analysis+based+on+gas+chromatography-mass+spectrometry+derived+13C+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints.</a> Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).</li>
<li>Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analytic+and+systematic+framework+for+estimating+metabolic+flux+ratios+from+13C+tracer+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments.</a> BMC Bioinformatics. 9, 266(2008).</li>
<li>Zamboni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C+metabolic+flux+analysis+in+complex+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">13C metabolic flux analysis in complex systems.</a> Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).</li>
<li>Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+plant+metabolic+networks+from+steady-state+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis.</a> Biochimie. 91, 697-702 (2009).</li>
<li>Quek, L. -E., Dietmair, S., Krömer, J. O., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+flux+analysis+in+mammalian+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">Metabolic flux analysis in mammalian cell culture.</a> Metab Eng. 12, 161-171 (2010).</li>
<li>Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/279893606_Uptake_of_amino_acids_during_beer_production_The_concept_of_a_critical_time_value">Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value.</a> J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).</li>
<li>Magasanik, B., Kaiser, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+regulation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene. 290, 1-18 (2002).</li>
<li>Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+amino+acid%2C+nucleotide%2C+and+phosphate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190, 885-929 (2012).</li>
<li>Cooper, T. G. Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCooper%2C+TG+%22The+molecular+biology+of+the+yeast+Saccharomyces%3A+Metabolism+and+gene+expression%22">The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression</a>. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 39-99 (1982).</li>
<li>Jones, E. W., Fink, G. R. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJones%2C+EW+%22The+molecular+biology+of+the+yeast+Saccharomyces%3A+Metabolism+and+gene+expression%22">The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression</a>. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 182-299 (1982).</li>
<li>Hazelwood, L. A., Daran, J. -M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ehrlich+pathway+for+fusel+alcohol+production%3A+a+century+of+research+on+Saccharomyces+cerevisiae+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism.</a> Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).</li>
<li>Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0922338X90900574">Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions.</a> J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).</li>
<li>Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+reconstruction+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+metabolic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network.</a> Genome Res. 13, 244-253 (2003).</li>
<li>Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IsoCor%3A+correcting+MS+data+in+isotope+labeling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments.</a> Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bileşikler metabolik ağlarına izotopik izleyici deneyler kullanarak bölümleme miktarının mikrobiyal metabolizma işleyişini anlamak için umut verici bir yaklaşımdır. Bu yöntemi başarıyla uygulanan bir ya da iki etiketli yüzeyler ile iken şu anda birden çok etiketli elemental izotoplar (Yani, birden fazla iki yüzeylerde) kullanarak çeşitli kaynaklardan metabolizma çalışmaya uygulanması olamaz. Nitekim, mevcut analitik teknikler etiketleme desenleri proteinogenic amino asitler ve moleküllerin doğru belirlenmesi sad...

Mikrobiyal metabolizma çalışır nasıl anlayış fermantasyon süreçlerini geliştirmek ve fermantatif bileşiklerin üretimi modüle için etkili stratejiler tasarımı için önemli bir konudur. Gelişmeler genomik ve fonksiyonel genomik bu son iki yıl içinde büyük ölçüde birçok mikroorganizmaların metabolik ağların topolojisi bilgi genişletilmesi için katkıda bulunmuştur. Bu bilgilere erişimi hücresel işlev1kapsamlı bir genel bakış için amaç yaklaşımlar gelişmesine yol açtı. Bu metodolojileri çoğunlukla bir modeli tabanlı yorumlanması ölçülebilir parametreler üzerinde kullanır. Bu deneysel veriler, bir yandan metaboliti alımı ve üretim fiyatlarına dahildir ve öte yandan, izotop izleyici elde edilen nicel hücre içi bilgi deneyler. Bu veriler tanımlanmış metabolik ağ2,3,4farklı yollar içinde vivo aktivitesi kesinti için gerekli bilgileri sağlar. Şu anda, mevcut analitik teknikler sadece bir tek öğeli izotop kullanırken desenleri moleküllerin etiketleme, doğru algılamasını etkinleştirmek ve muhtemelen iki izotopik öğelerle birlikte etiketleme zaman. Ayrıca, çoğu büyüme koşullar altında karbon kaynağı yalnızca bir veya iki-bileşikler oluşur. Sonuç olarak, 13C-izotopik izleyiciler karbon yüzeyler üzerinden göre yaklaşımlar yaygın ve başarılı bir şekilde karbon metabolik ağ işlemleri5,6,7 tam bir anlayış geliştirmek için uygulanan ,8.
Buna ek olarak, pek çok doğal ve endüstriyel ortamlarda, mikrobiyal büyüme destekler kullanılabilir azot kaynağı kez molekülleri çok çeşitli oluşur. Örneğin, şarap ya da bira fermantasyon sırasında azot 18 amino asitler ve amonyum değişken konsantrasyonları9karışımı sağlanır. Bu dizi anabolizma için erişilebilir N bileşiklerin ikinci azot, genellikle amonyum benzersiz bir kaynak kullanarak elde edilir bu karmaşık medya koşullar büyük ölçüde yaygın olarak fizyolojik çalışmaları için kullanılan farklı yapar.
Genel olarak, azot bileşikleri olabilir doğrudan proteinlerin dahil ya da catabolized içselleştirilmiş. Maya Saccharomyces cerevisiae' de dahil olmak üzere birçok mikroorganizmalar azot metabolizması ağ yapısını yüzeylerde çeşitlilik uygun olarak çok karmaşıktır. Şematik, glutamin, Glutamat ve α-ketoglutarate10,11, enzimleri ve deaminases şekilde tromboksan azot metabolizması merkezi çekirdek bu sistem dayanmaktadır. Bu ağ üzerinden amonyum veya diğer amino asitlerin Amin grupları bir araya geldik ve α-keto asit serbest. Bu ara da synthetized Merkezi karbon metabolizması (CCM)12,13arası vardır. Bu sayıda dallı reaksiyonlar ve ara ürün, eksojen azot kaynakları katabolizma ve proteinogenic amino asitler, anabolizma dahil hücreleri anabolik gereklerini yerine getirir. Aktivite bu farklı birbirine bağlı yolları da metabolitleri atılımı sonuçlanır. Özellikle, α-keto asit yüksek alkoller ve onların asetat ester türevleri14, önemli katkıda bulunan ürünlerin duyusal profiller üretmeye Ehrlich yolu aracılığıyla yönlendirilebilirsiniz. Daha sonra çalışma şeklini azot metabolizması biyokütle üretimi ve uçucu moleküllerin (aroma) oluşumu içinde önemli bir rol oynar.
Tepkiler, enzim ve gen azot üretimiyle literatürde yaygın olarak açıklanmıştır. Ancak, birden fazla azot kaynakları metabolik bir ağ genelinde dağılımı sorunu henüz giderilmiş değil. Bu bilgi eksikliği açıklamak iki ana nedeni vardır. İlk olarak, azot metabolizması ağ önemli karmaşıklığı içinde görüş-in, nicel veri büyük miktarda kullanılamaz faaliyete tam bir anlayış için gerekli şimdiye kadar. İkinci, birçok deneysel kısıtlamaları ve sınırlamaları analitik yöntemleri CCM işlevi aydınlatma için daha önce kullanılan yaklaşımların uygulanması engelledi.
Bu sorunların üstesinden gelmek için mutabakat veri izotopik izleyici deneyler bir dizi dayalı bir sistem düzeyinde yaklaşım geliştirmek seçtik. İş akışı içeren: -Her seferinde farklı bir seçili besin kaynağı (substrat) etiketli iken fermentations kümesi aynı çevre koşullarında yürütülmüştür. -Bir arada etiketli substrat ve konsantrasyonu kalan konsantrasyon ve izotopik zenginlik üzerinden elde edilen bileşiklerin fermantasyon farklı aşamalarında bir doğru belirlenmesi için analitik işlemleri (HPLC, GC-MS) katabolizma etiketli molekülünün türetilmiş biyokütle dahil olmak üzere. -Bir hesaplama her kitle ve izotopik dengesinin etiketli molekül ve akı oranları belirlenmesi yoluyla mikroorganizmalar tarafından birden çok besin kaynaklarının yönetimi genel bir bakış elde etmek için veri kümesi bir daha fazla entegre analiz tüketilen .
Bu yöntemi uygulamak için dikkat zorlanma/mikroorganizma kültürler arası tekrarlanabilir davranışındaki ödenmelidir. Ayrıca, farklı kültürlerden gelen örnekleri aynı iyi tanımlanmış fermantasyon devam ederken alınması gerekir. Bu el yazması bildirdi deneysel çalışmalarında bir robot destekli sistem fermentations online izlemek için bu kısıtlamalar için hesap için kullanılır.
Ayrıca, çalışmanın bilimsel sorunla ilgili olarak uygun etiketli yüzeylerde (bileşik, doğa ve konumu maddelerinin etiketlenmesi) kümesi seçmek önemlidir. Burada, 15N etiketli amonyum, glutamin ve arginin üzüm suyu bulunan üç büyük azot kaynağı olarak seçilmiştir. Bu üzerinden tüketilen bileşikler azot yeniden dağıtım proteinogenic amino asitler için desen değerlendirmek izin verdi. Ayrıca tüketilen amino asitler ve uçucu moleküllerin üretimini yaptıkları katkı karbon omurgası kaderi araştırmak amaçladık. Bu amaç, liflerin düzenli bir biçimde 13lösin C harfiyle karşılamak için isoleucine, treonin ve Valin çalışmada Ehrlich yolu büyük ara ürün elde edilen amino asitler olarak dahil edilmiştir.
Genel olarak, biz kantitatif Maya fermantasyon Ayrıca karbon öncüleri fazlalığı çıkarmadan süre boyunca anabolik gereksinimleri yerine getirmek için eksojen azot kaynakları yeniden dağıtma tarafından bir karmaşık azot kaynağı nasıl yönettiğini araştırdı uçucu moleküllerin. Bu gazetede bildirdi deneysel işlemin diğer mikroorganizma tarafından kullanılan diğer birden çok besin kaynaklarını araştırmak için uygulanabilir. Bu mikroorganizmaların metabolik davranışını genetik arka plan veya çevre koşullarının etkisi analizi için uygun bir yaklaşım gibi görünüyor.

<table><tbody><tr><td>D-Glikoz</td><td>PanReac</td><td>141341.0416</td><td></td></tr><tr><td>D-Fruktoz</td><td>PanReac</td><td>142728.0416</td><td></td></tr><tr><td>DL-Malik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0875</td><td></td></tr><tr><td>Sitrik asit monohidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7129</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum sülfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0772</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat heptahidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4514</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Manganez sülfat monohidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td></td></tr><tr><td>Çinko sülfat heptahidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>Bakır (II) sülfat pentahidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7631</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum iyot</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4286</td><td></td></tr><tr><td>Kobalt (II) klorür hekzahidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3169</td><td></td></tr><tr><td>Borik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum heptamolibdat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7302</td><td></td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>D-Pantotenik asit hemikalsiyum tuzu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>21210</td><td></td></tr><tr><td>Tiamin, hidroklorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4625</td><td></td></tr><tr><td>Nikotinik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4126</td><td></td></tr><tr><td>Piridoksin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5669</td><td></td></tr><tr><td>Biyotin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Ergonomi ve Eacute; rol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6510</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Etanol mutlak</td><td>VWR Kimyasalları</td><td>101074F</td><td></td></tr><tr><td>Demir (III) klorür hekzahidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>L-Aspartik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>L-Sistein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-İzolösin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-Lösin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-Lizin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>L-Metionin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-Fenilalanin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>L-Prolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>L-Serin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-Treonin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>L-Triptofan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>L-Tirozin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>L-Valin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>13C5-L-Valin</td><td>Eurisotop</td><td>CLM-2249-H-0.25</td><td></td></tr><tr><td>13C6-L-Lösin</td><td>Eurisotop</td><td>CLM-2262-H-0.25</td><td></td></tr><tr><td>15N-Amonyum klorür</td><td>Eurisotop</td><td>NLM-467-1</td><td></td></tr><tr><td>ALPHA-15N-L-Glutamin</td><td>Eurisotop</td><td>NLM-1016-1</td><td></td></tr><tr><td>U-15N4-L-Arginin</td><td>Eurisotop</td><td>NLM-396-PK</td><td></td></tr><tr><td>Etil asetat</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>270989</tr><tr><td>Etil propanoat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>112305</td><td></td></tr><tr><td>Etil 2-metilpropanoat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>246085</td><td></td></tr><tr><td>Etil bütanoat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E15701</td><td></td></tr><tr><td>Etil 2-metilbütanoat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>306886</td><td></td></tr><tr><td>Etil 3-metilbutanoat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8.08541.0250</td><td></td></tr><tr><td>Etil hekzanoat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>148962</td><td></td></tr><tr><td>Etil oktanoat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244910</td><td></td></tr><tr><td>Etil dekanoat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W243205</td><td></td></tr><tr><td>Etil dodekanoat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244112</td><td></td></tr><tr><td>Etil laktat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244015</td><td></td></tr><tr><td>Dietil süksinat</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>W237701</tr><tr><td>2-metilpropil asetat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W217514</td><td></td></tr><tr><td>2-metilbütil asetat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W364401</td><td></td></tr><tr><td>3-metil bütil asetat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>287725</td><td></td></tr><tr><td>2-feniletil asetat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>290580</td><td></td></tr><tr><td>2-metilpropanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>294829</td><td></td></tr><tr><td>2- metilbutanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>133051</td><td></td></tr><tr><td>3-metilbutanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>309435</td><td></td></tr><tr><td>Heksanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>128570</td><td></td></tr><tr><td>2-feniletanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77861</td><td></td></tr><tr><td>Propanoik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94425</td><td></td></tr><tr><td>Butanoik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>19215</td><td></td></tr><tr><td>2-metilpropanoik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>58360</td><td></td></tr><tr><td>2-metilbütanoik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>193070</td><td></td></tr><tr><td>3-metilbütanoik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W310212</td><td></td></tr><tr><td>Heksanoik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>153745</td><td></td></tr><tr><td>Oktanoik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W279900</td><td></td></tr><tr><td>Decanoik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W236403</td><td></td></tr><tr><td>Dodekanoik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L556</td><td></td></tr><tr><td>Fermentör 1L</td><td>Legallais</td><td>AT1357</td><td>Fermantasyon için el yapımı fermentör</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık vakum filtrasyon sistemi</td><td>Dominique Deutscher</td><td>029311</td><td></td></tr><tr><td>Fermentörler (250 ml)</td><td>Legallais</td><td>AT1352</td><td>Fermantasyon için el yapımı fermentör</td></tr><tr><td>Steril tüpler</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Fermantasyon kilitleri</td><td>Legallais</td><td>AT1356</td><td>Fermantasyon için el yapımı Fermetasyon kilitleri</td></tr><tr><td>BactoYeast Özü</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>BactoPeptone</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör çalkalayıcı</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Partikül Sayacı</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605697</td><td>Multisizer 3 Coulter Sayaç</td></tr><tr><td>Santrifüjü</td><td>Jouan</td><td></td><td>GR412</td></tr><tr><td>Plaka Uşak Robotik sistem</td><td>Laboratuvar Hizmetleri BV</td><td>PF0X-MA</td><td>Otomatik alet</td></tr><tr><td>Plaka Uşak Yazılımı</td><td>Laboratuvar Hizmetleri BV</td><td></td><td>Robot monitör yazılımı</td></tr><tr><td>RobView</td><td></td><td></td><td>Şirket içi geliştirilen hesaplama yazılımı</td></tr><tr><td>My SQL</td><td></td><td></td><td>Uluslararası kaynak veritabanı</td></tr><tr><td>Cimarec i Telesystem Çok Noktalı Karıştırıcılar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50088009</td><td>String Drive 60</td></tr><tr><td>BenchBlotter platform rocker</td><td>Dutscher</td><td>60903</td><td></td></tr><tr><td>Amonyak enzimatik kiti</td><td>R-Biopharm AG</td><td>5390</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre küvetleri</td><td>VWR</td><td>634-0678</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre UviLine 9400</td><td>Secomam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amino asit standartları fizyolojik - asidik ve nötrler</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6407</td><td></td></tr><tr><td>Amino asit standartları fizyolojik - temel bilgiler</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6282</td><td></td></tr><tr><td>Sitrat lityum tamponları - Ultra ninhidrin reaktifi</td><td>Biochrom</td><td>BC80-6000-06</td><td></td></tr><tr><td>Sülfosalisilik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2130</td><td></td></tr><tr><td>Norlösin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N1398</td><td></td></tr><tr><td>Biochrom 30 AAA</td><td>Biochrom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZChrom Elite</td><td>Biochrom</td><td></td><td>Enstrüman kontrol ve Veri analizi yazılımı</td></tr><tr><td>Ultropac 8 reçine Lityum</td><td>Biochrom</td><td>BC80-6002-47</td><td>Lityum Yüksek Çözünürlüklü Fizyolojik Sütun</td></tr><tr><td>Filtresi Millex GV</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGVX13NL</td><td>Millex GV 13mm (gözenek boyutu 0.22 & mikro; m)</td></tr> <tr><td>Membran filtre PALL</td><td>VWR</td><td>514-4157</td><td>Supor-450 47mm 0.45 & mikro; m</td></tr><tr><td>Vakum pompası Millivac Mini</td><td>Millipore</td><td>XF5423050</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum pürüzsüz tartı kabı 70mm</td><td>VWR</td><td>611-1380</td><td></td></tr><tr><td>Hassas terazi</td><td>Mettler</td><td></td><td>Teknik Özellikleri AE163</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksid kurutulmuş</td><td>Merck</td><td>1029310161</td><td>(maks. %0,025 H2O) SeccoSolv</td></tr><tr><td>Yanma fırını</td><td>Legallais</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA protein test kiti</td><td>Interchim</td><td>UP40840A</td><td></td></tr><tr><td>Formik asit</td><td>Fluka</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit Dumanlı% 37 Emsure</td><td>Merck</td><td>1003171000</td><td>Sınıf ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Lityum asetat tamponu</td><td>Biochrom</td><td>80-2038-10</td><td></td></tr><tr><td>Hidrolize amino asitlerin ticari çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AAS18</td><td></td></tr><tr><td>L-Metionin sülfon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0876</td><td></td></tr><tr><td>L-Sisteik asit monohidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30170</td> Pyrex cam kültür tüpleri Sigma Aldrich Z653586 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piridin</td><td>Acros Organics</td><td>131780500</td><td>%99 Ekstra Saf</td></tr><tr><td>Etil kloroformat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23131</td><td></td></tr><tr><td>Diklorometan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32222</td><td></td></tr><tr><td>Şişeler</td><td>Sigma Aldrich</td><td>854165</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml şişeler için mikroinsertler</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SU860066</td><td></td></tr><tr><td>GC / MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>5890 GC / 5973 MS</td><td></td></tr><tr><td>Chemstation</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Enstrüman kontrol ve veri analiz yazılımı</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td>Chromasolv, HPLC</td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Sigma Aldrich</td><td>için 34998</td><td>ChromasolvPlus, HPLC</td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformamid dimetil asetal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>394963</td><td></td></tr> <tr><td>içinBSTFA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>33024</td><td></td></tr><tr><td>DB-17MS sütunu</td><td>Agilent Technologies</td><td>122-4731</td><td>30m * 0.25mm * 0.15 & mikro; m</td></tr><tr><td>Sodyum sülfat, susuz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238597</td><td></td></tr><tr><td>Teknik nitrojen</td><td>Hava ürünleri</td><td>14629</td><td></td></tr><tr><td>Zebron ZB-WAX sütunu</td><td>Phenomenex</td><td>7HG-G007-11</td><td>30m * 0.25mm * 0.25 & mikro; m</td></tr><tr><td>Helyum BIP</td><td>Hava ürünleri</td><td>26699</td><td></td></tr><tr><td>Cam Pastör pipetleri</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td></td></tr></tbody></table>

birden çok besin kaynaklarının mikrobiyal metabolizma araştırmaya izotopik izleyici deneyler kombinasyonuna göre iş akışı

Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

Mikrobiyoloji alanında çalışmalar çok çeşitli yöntemleri uygulanması konusunda güveniyor. Özellikle, uygun yöntem geliştirme önemli ölçüde benzersiz azot ve karbon kaynakları içeren kimyasal olarak tanımlanan medya içinde büyüyen mikroorganizmaların metabolizması kapsamlı bilgi sunmak için katkıda bulunur. Buna ek olarak, metabolizma ile yönetimi geniş varlıklarını doğal veya endüstriyel ortamlarda rağmen birden çok besin kaynaklarının hemen hemen keşfedilmemiş kalır. Bu durum hangi soruşturma engel esas olarak uygun yöntemleri nedeniyle olmaması.
Biz nicelik ve kapsamlı bir besin karışımı farklı molekül, Yani, karmaşık bir kaynak olarak sağlandığında metabolizma nasıl çalıştığını keşfetmek için deneysel bir strateji raporu. Burada, Maya metabolik ağ üzerinden birden çok azot kaynakları bölümleme değerlendirmek için uygulanması açıklanmaktadır. İş akışını seçilen 13C - ya da 15N etiketli yüzeylerde kullanarak kararlı izotop izleme deneyleri sırasında elde edilen bilgilerle birleştirir. İlk paralel ve tekrarlanabilir fermentations N içeren moleküllerin karışımı içeren aynı ortamda oluşur; Ancak, seçilen azot kaynağı her zaman taşır. Analitik işlemleri (HPLC, GC-MS) bir arada hedeflenen bileşikler etiketleme şekillerinin değerlendirmek için ve tüketimi ve diğer metabolitler yüzeylerde kurtarılması ölçmek için uygulanır. Tam veri kümesi tümleşik bir analizini tüketilen yüzeylerde hücrelerin içindeki kaderi genel bakış sağlar. Bu yaklaşım doğru bir iletişim kuralı örnekleri – kolaylaştırdı koleksiyon için online fermentations izleme için bir robot destekli sistem tarafından gerektirir- ve çok sayıda zaman alan analizleri başarı. Bu kısıtlamaları rağmen bu anlayış, ilk kez birden fazla azot kaynakları Maya metabolik ağ genelinde bölümleme izin. Biz diğer N-bileşikler doğru daha bol kaynaklardan gelen azot dağıtılması aydınlatılmamıştır ve uçucu moleküllerin ve proteinogenic amino asit metabolik kökenleri belirledi.

Şekil 3 şematik diyagramı yönetimi araştırmak için maya şarap fermantasyon sırasında bulunan birden fazla azot kaynakları tarafından uygulanan iş akışı sunar. Örnekleme, biyolojik parametreler-büyüme özellikleri, azot tüketim kalıpları ve gösterinin proteinogenic amino asitler – fermentations (şekil 4) arasında yüksek bir tekrarlanabilirlik profil farklı noktaları için. Bu tutarlılık 14 bağımsız fermentations bir dizi sırasınd...

Bu iletişim kuralı metabolizma birden çok besin kaynaklarının nicelik ve kapsamlı bir şekilde araştırmak için deneysel bir işlem açıklanır. İzotopik izleyici deneyleri ve analitik bir yordam, bir kombinasyonuna göre bu iş akışı, tüketilen besin kaderi ve molekülleri synthetized metabolik kökenli mikroorganizmalar tarafından belirlenecek sağlar.

Birden çok besin kaynaklarının mikrobiyal metabolizma araştırmaya izotopik izleyici deneyler kombinasyonuna göre iş akışı

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...

Bu prosedürün genel amacı, etiketli substratlar kullanarak çoklu besin kaynaklarının metabolizmasını kantitatif olarak araştırmaktır. Bu iş akışı, tüketilen besinlerin akıbetinin ve mayalar tarafından sentezlenen bileşiklerin metabolik kökeninin belirlenmesini sağlar. Bu yöntem, çevresel koşullara bağlı olarak tüm metabolizmanın nasıl çalıştığı gibi mikrobiyal metabolizma alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.Bu tekniğin temel avantajı, birden fazla kaynaktan besin dağılımı proteininin aydınlatılmasına ve miktarının belirlenmesine izin vermesidir. Bu yöntem, mayanın azot metabolizmasını araştırmak için kullanılmıştır, ancak diğer metabolizmalara ve mikroorganizmalara da uygulanabilir. Bu deneyde başarının anahtarı, fermantasyonların tekrarlanabilirliğinde yatmaktadır.Kullanıcılar, hücreleri aynı tanımlanmış fizyolojik aşamada toplamaya özellikle dikkat etmelidir. Prosedürü teknik ekibimizden Christian Picou, laboratuvardan doktora öğrencisi Pauline Seguinot ve doktora sonrası araştırmacı Stephanie Rollero gösterecek. Bir otoklavda, her bir nitrojen kaynağı için hazırlanan her bir sentetik ortamı, manyetik bir karıştırma çubuğu içeren bir litrelik bir şişede pastörize edin.Ortamda istenen nihai konsantrasyona ulaşmak için uygun miktarda etiketli molekülü çözün. Tek kullanımlık bir vakum filtrasyon sistemi kullanarak ortamı sterilize edin. Steril bir ölçüm silindiri kullanarak, ortamı, manyetik bir karıştırma çubuğu içeren ve oksijen girişini önlemek ancak karbondioksit salınımına izin vermek için fermantasyon kilitleriyle donatılmış önceden sterilize edilmiş iki fermentör arasında bölün.YPD ortamında bir cerevisiae suşu büyüttükten sonra, laminer akış altında bir ön kültür alikotu toplayın ve 100 mikrometrelik bir açıklığa sahip bir elektronik parçacık sayacı kullanarak hücre popülasyonunu ölçün. Ön kültürü santrifüjledikten sonra, mililitre başına 2,5 kat 10 ila 9. hücreler arasında bir nihai konsantrasyon elde etmek için peleti uygun bir hacimde steril suda askıya alın. Daha sonra, her fermentörü bir mililitre hücre süspansiyonu ile aşılayın.Bunu takiben, fermentörleri 21 konumlu karıştırma plakalarına uygun şekilde yerleştirilmiş destek kılavuzlarına takarak bir fermantasyon platformu hazırlayın ve karıştırma hızını 270 RPM'ye ayarlayın. Her fermantasyonun çevrimiçi izlenmesini başlatmak için robot kontrol uygulamasını başlatın, Testi Başlat düğmesine tıklayın ve gerçekleştirilecek fermantasyon hacmini seçin. Görüntülenen arayüzün platformdaki fermentörlerin sayısının ve konumunun gösterilmesine izin verdiğinden emin olmak için, yuva konumuna sağ tıklayın ve boş konumların izlenmesini devre dışı bırakmak için Devre Dışı Bırak'ı seçin.Hesaplama yazılımını başlatmak için Başlatıcı düğmesine tıklayın ve OK ile doğrulayın. Ardından, ağırlık alımlarını başlatmak için robot kontrol uygulamasının Başlat düğmesine tıklayın. Daha sonra, fermentörlerden alınan iki adet altı mililitrelik numuneyi 2.000 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüjleyin. Bittiğinde, her donmuş süpernatanı iki tüpe aktarın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.Her peleti beş mililitre damıtılmış su ile iki kez yıkayın ve izotopik zenginleştirme ölçümü için eksi 80 santigrat derecede saklayın. Yüksek moleküler ağırlığa sahip molekülleri çıkarmak için 800 mikrolitre numuneye dahili standart olarak 2.5 milimolar norlösin içeren 25% sülfosalisilik asit çözeltisinden 800 mikrolitre ekleyin. İnkübasyon ve santrifüjlemeden sonra, karışımı 0,22 mikrometre gözenek boyutunda nitroselüloz membrandan süzün ve numuneyi bir amino asit analiz sistemine yerleştirin.Analiz sisteminin programında veya yazılımında, bir katyon değişim sütunu ile donatılmış analizör ile sıvı kromatografi analizlerine başlamak için Çalıştır düğmesine tıklayın. Daha sonra, önceden hazırlanmış etiketli bir hücre peletini 200 mikrolitre performik asit içinde süspanse ederek oksitlenmiş bir ekstrakt hazırlayın. Dört santigrat derecede dört saat inkübe ettikten sonra, 33.6 miligram sodyum sülfat ekleyerek reaksiyonu durdurun.Oksitlenmiş ekstrakta 800 mikrolitre altı normal hidroklorik asit ekleyin ve numuneyi kuru ısı fırınında 110 santigrat derecede 16 saat boyunca hava geçirmez şekilde kapatılmış bir cam tüp içinde inkübe edin. Numunenin oda sıcaklığına soğumasına izin verdikten sonra, 200 mikrolitre 2.5 milimolar nörolösin ekleyin ve hidrojen klorür gazını bir nitrojen akışı ile çıkarın. Kurutulmuş ekstraktı iki kez 800 mikrolitre damıtılmış su ve ardından 800 mikrolitre etanol ile yıkayın.Ardından, ekstrakta 800 mikrolitre 200 milimolar lityum asetat tamponu ekleyin. Daha önce açıklanan kromatografik yöntemi kullanarak numunedeki proteinler içindeki amino asitlerin nispi konsantrasyonlarını belirleyin. 1.2 mililitre altı molar hidroklorik asit ekleyerek ve numuneyi kuru ısılı bir fırında sıkıca kapatılmış bir cam tüp içinde 105 santigrat derecede 16 saat inkübe ederek etiketli bir hücre peletini hidrolize edin.Numunenin oda sıcaklığına soğumasına izin verdikten sonra 1,2 mililitre damıtılmış su ekleyin. Hücresel kalıntıları gidermek için santrifüjlemenin ardından, süpernatanı açık cam tüplerde altı adet 400 mikrolitrelik fraksiyona dağıtın. Fraksiyonları kuru ısıda 105 derece fırında şurup kıvamına gelene kadar dört ila beş saat kurutun.Biyokütle hidrolizi sırasında, işlem asidini sık sık kontrol ederek fraksiyonu bir şurup kıvamına gelene kadar kurutun. ECF türevlendirmesi için, soğutulmuş kurutulmuş hidrolizatı 200 mikrolitre 20 milimolar hidroklorik asit ve 133 mikrolitre bir ila dört piridin ve etanol karışımı içinde çözün. Amino asitleri türevlendirmek için 50 mikrolitre etil kloroformat ekleyin.Karbondioksit serbest bırakıldıktan sonra, türetilmiş bileşikleri çıkarmak için karışımı 500 mikrolitre diklorometan içeren santrifüj tüplerine aktarın. Örnekleri 10 saniye boyunca vorteksleyin. 10.000 kez G'de dört dakika santrifüjledikten sonra, her numunenin alt organik fazını bir Pasteur pipeti ile toplayın ve her bir numunenin doğrudan GCMS cihazına enjekte edilebilmesi için konik bir cam ek içeren bir GC otomatik numune alma cihazı şişesine aktarın.ECF prosedürü için HPLC türevlendirme reaktifleri kullanılır. ECF reaktiflerini sık sık değiştirin. DMF-DMA türevlendirmesi için, kurutulmuş hidrolizatı 50 mikrolitre metanol ve 200 mikrolitre asetonitril içinde çözün.300 mikrolitre DMF-DMA ekleyin ve numuneyi girdaplayın. Ardından, numuneyi konik bir cam ek içeren bir GC otomatik numune alma cihazı şişesine aktarın. BSTFA türevlendirmesi için, hidrolizatı 200 mikrolitre asetonitril içinde askıya alın.Numuneye 200 mikrolitre BSTFA ekleyin ve cam tüpü hava geçirmez şekilde kapatın. 135 santigrat derecede dört saat inkübe edildikten sonra, soğutulmuş ekstraktı doğrudan konik bir cam ek içeren bir GC otomatik numune alma cihazı şişesine aktarın. Şimdi, numuneleri bir otomatik numune alma enjektörü ile donatılmış ve bir kütle spektrometresine bağlı bir gaz kromatografı ile analiz edin.Bilgisayar yazılımı menüsünde Enstrüman'a tıklayın. Sıra sekmesi altında, bir örnek listesi oluşturmak için Örnek Günlük Tablosunu Düzenle'ye tıklayın ve enjeksiyonları başlatmak için Çalıştır ve Sırayı Çalıştır'a tıklayın. Analizler tamamlandıktan sonra, farklı kütle izotopomerlerine karşılık gelen her amino asit için bir yoğunluk kümesi kaydedin.15 mililitrelik bir cam tüpte beş mililitre süpernatanıma 10 mikrolitre uygun döteryumlu iç standartlar ekleyin. Bir mililitre diklorometan ekleyin, tüpü sıkıca kapatın ve numuneyi 20 dakika boyunca sallanan bir platformda sallayın. Santrifüjlemeden sonra, alt organik fazı 15 mililitrelik bir cam tüpte toplayın.Diklorometan ekstraksiyonunu tekrarladıktan sonra, organik ekstraktı 500 miligram susuz sodyum sülfat üzerinde kurutun ve sıvı fazı bir Pasteur pipeti ile toplayın. Ekstraktı nitrojen akışı altında dört kat konsantre edin. Ardından, konsantre numuneyi bir GC otomatik numune alma cihazı şişesine aktarın.GCMS miktar tayini için, 10'a bir bölme oranına sahip iki mikrolitre numune enjekte edin ve ekstrakte edilen uçucu molekülleri uygun fırın sıcaklık profilini kullanarak ayırın. Metin protokolündeki elektronik tabloları kullanarak, hücre dışı amino asitlerin konsantrasyonuna, hücre kuru ağırlığına, hücrelerin protein içeriğine, uçucu moleküllerin konsantrasyonuna ve proteinojenik amino asitlerin ve uçucu moleküllerin izotopik zenginleşmesine karşılık gelen ham veri değerlerini girin. Şarap fermantasyonu sırasında bulunan çoklu nitrojen kaynaklarının maya ile yönetimini araştırmak için iş akışının şematik bir diyagramı burada gösterilmektedir.Farklı örnekleme noktaları için, biyolojik parametreler fermenasyonlar arasında yüksek bir tekrarlanabilirlik göstermektedir. Azotun üzüm suyundaki kaynaklardan tüm proteinojenik amino asitlere yeniden dağılımına genel bir bakış burada gösterilmektedir. Kütle dengelerinin belirlenmesi ile birlikte, proteinojenik amino asitlerin izotopik zenginleşmesinin ölçümü, azot kaynaklı arginin, glutamin, amonyum ve diğer kaynakların bu bileşiklerin her birinin amin gruplarına katkısının ilk miktar tayinini sağlamıştır.Doğrudan biyokütleye geri kazanılan tüketilen amino asit miktarı arasında bir karşılaştırma burada gösterilmektedir. Burada tüketilen alifatik amino asitlerin, lösin ve valinin mayadaki metabolik ağda bölünmesi gösterilmiştir. Tüketilen valin ve lösinin% 96'sından fazlası dönüşüm ürünlerinde geri kazanılır.Şaşırtıcı bir şekilde, valin ve lösinin önemli bir kısmı, bu bileşiklerin ortamdaki mevcudiyeti ile biyokütle içeriği arasındaki önemli bir dengesizliğe rağmen katabolize edilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik beş gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, alt tabakanın etiketleme kısmını bilimsel konulara göre dikkatlice seçmeyi unutmamak önemlidir.İyi bir biyolojik tekrarlanabilirlik sağlamak için, fermantasyon ve kromatografik analizi iki kez gerçekleştirin. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra mikrobiyoloji alanındaki araştırmacıların, mikroorganizmaların metabolizmasının ve fizyolojisinin çevresel koşullara bağlı olarak nasıl değiştiğini keşfetmelerinin önünü açmıştır. Türevlendirme reaktifleri ve arginin çözücü ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven giymek ve davlumbaz altında çalışmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

workflow-based-on-combination-isotopic-tracer-experiments-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Kararlı izotop profil aracı metabolik akı gaz kromatografisi kütle spektrometrik analizi, nematod...

Kararlı İzotopik Profil geliştirilmesi ve Yetişkin Sahne Aracı Metabolik Akı Caenorhabditis elegans</em

13 C-izotop etiketleme çeşitli türleri için mikroorganizmaların hücre merkezi metabolizma belirlenmesi için yararlı bir tekniktir. Hücreleri belirli bir substrat ile etiketli kültüre edildikten sonra, GC-MS ölçüm aminoasittir benzersiz etiketleme desen dayalı işlevsel metabolik yollar ortaya çıkarabilir.

Sayesinde Metabolik Pathway Onay ve Keşif 13</supAminoasittir> C-etiketleme

Spodoptera littoralis gut ile ilişkili aktif bakteriyel topluluk, piro sıralamadır bağlanmış kararlı-izotop-tarama (SIP) ile belirlenmiştir. Bu yöntemi kullanarak, toplum içinde aktif metabolik bakteri türlerinin belirlenmesi, yüksek çözünürlük ve hassasiyet ile yapıldı.

Kültürlü ve Gut metabolik Aktif Bakterilerin Tanımlanması<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; DNA Kararlı İzotop yoluyla kullanma Probing<sup&gt; 13</sup&gt; C = Glukoz

Planta'da besin ve toksik madde akılarının ölçümü, bitki beslenmesi ve toksisitesinin incelenmesi için esastır. Burada, örnek olarak potasyum (K+) ve amonyak/amonyum (NH3/NH4+) akılarını kullanarak, bozulmamış bitki köklerinde akıntı ve akış tayini için radyoizleyici protokollerini ele alıyoruz. Bu tür tekniklerin avantajları ve sınırlamaları tartışılmaktadır.

Radyoaktif izleyiciler ile Bitkilerde Mineral Besin ve Toksikantların Değişimler Ölçme

Çözünmüş organik madde, enerji ve ekosistemler akarsu besin önemli bir kaynak sağlar. Burada kolayca tekrarlanabilir besin darbeleri ile yerinde çözünmüş organik maddenin ortam havuzu işlemek için bir alan bazlı yöntemi göstermektedir.

Sayesinde Organik Madde biyojeokimya Çözünmüş Anlamak<em&gt; In Situ</em&gt; Akış Ekosistemlerde Besin manipülasyonları

Bu makale, kararlı izotop izleme, belirli hücre tiplerini izole etmek için hücre sıralama ve kütle spektrometresinin bir kombinasyonunu kullanarak, birden fazla hücre tipinden oluşan karmaşık topluluklarda hücresel metabolizmayı incelemek için bir yöntemi açıklar.

Kararlı İzotop izlemeyi kullanma Kompleks Hücre Toplulukları Sıralama alt popülasyonlar Metabolizma Ölçme Bir Yöntem

Bu iletişim kuralı tek bir üretim için doğal organik madde ve mikrobiyal proteomik farklı ekosistemleri içinde tam olarak eşleştirilmiş karakterizasyonu sonuçlanan tamamlayıcı analitik ve omics teknikleri açıklar. Bu yaklaşım sağlam karşılaştırmalar metabolik yollar ve sera gazı üretim tanımlamak ve çevresel değişimin yanıt tahmin için önemli dönüşümleri tanımlamak için izin verir.

Karmaşık doğal organik madde karışımları karakterize için tek işlem hacmi tamamlayıcı yüksek çözünürlüklü analitik teknikler

Burada sunulan yüksek hassasiyet ve taksonomik çözünürlük ile sucul yırtıcı ökaryotlar otlatma oranları ölçmek için tek hücreli, epifloresan mikroskobik tabanlı teknik için bir protokoldür.

Floresan Etiketli Bakteriler Sucul Ekosistemlerde Organik Karbon Akışının Yeni Yollarını Ortaya Çıkaracak Bir İzleyici Olarak

Matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonizasyon görüntüleme kütle spektrometrisi ile agara bazlı, bakteriyel makrokolonilerin analizi için yeni bir numune hazırlama yöntemi gösterilmiştir.

Enfeksiyon Sırasında Agar ve Dokuda Yetişen Bakteri Kolonilerinin Görüntüleme Kütle Spektrometrisi Analizi Yoluyla Mikrobiyal İşbirliğinin İncelenmesi

Burada, tek tek hücreleri tanımlamak ve metabolizmalarını anlamak için orta kızılötesi fototermal-FISH (MIP-FISH) olarak da bilinen optik fototermal kızılötesi floresan yerinde hibridizasyon (OPTIR-FISH) kullanan bir protokol sunuyoruz. Bu metodoloji, tek hücre çözünürlüğü ile hücresel metabolizmanın haritalanması da dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için geniş çapta uygulanabilir.

Optik Fototermal Kızılötesi-Floresan Yerinde Hibridizasyon (OPTIR-FISH)

Öğrenin, izotopik izleyici deneyleriyle mikrobiyal metabolizmayı nicel olarak incelemeyi. Bu yöntem, besin kaynaklarının metabolik kaderini ve sentezlenen bileşiklerin kökenini belirler.

Birden çok besin kaynaklarının mikrobiyal metabolizma araştırmaya izotopik izleyici deneyler kombinasyonuna göre iş akışı

Daha fazla video keşfet