Havuza alınan shRNA MeCP2 reaktivasyonu üzerinde etkin olmayan X kromozomu için ekran

Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi fare tendon fibroblastlarının hazırlanması ile başlayın. Önce ortamı aspire ederek hücreleri 10 santimetrelik bir plakadan toplayın. Daha sonra bir mililitre% 0.05 tripsin EDTA ekleyin ve 37 santigrat derecede iki ila beş dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, tripsini dokuz mililitre DMEM-10 ile söndürün ve yeniden süspanse edilmiş hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. Hücreleri DMEM-10 ile 100 mikrolitre başına bir hücrenin nihai konsantrasyonuna seyreltin. Daha sonra, her bir oyuğa 100 mikrolitre süspansiyon pipetleyerek hücreleri 96 kuyucuklu plakaya aktarın.

Hücreleri, kuyucuklar birleşene kadar 37 santigrat derecede inkübe edin, bu iki ila üç hafta kadar sürebilir. Ortamı her üç ila beş günde bir taze DMEM-10 ile değiştirin. Birleştiğinde, hücreleri oyuk başına 20 mikrolitre% 0.05 tripsin EDTA ile harekete geçirin ve bunları 96 oyuklu plakadan oluşan iki çift sete bölün.

Bir plaka setinde lusiferaz aktivitesi için tahlil. Lusiferaz test kitinde bulunan protokolü izleyerek, ortamın çıkarılmasını gerektirmeyen homojen bir Firefly lusiferaz testi kullanın. Kalan plaka setinden saptanabilir lusiferaz aktivitesi olmayan klonları seçmek için tahlil sonuçlarını kullanın.

Bu klonları önce 24 oyuklu bir plakaya, ardından altı oyuklu bir plakaya genişletin. En yüksek lusiferaz aktivitesine sahip bir klon için de aynısını yapın. Bu, doğrulama amacıyla pozitif bir kontrol olarak kullanılacaktır.

Altı kuyucuklu plakadaki genişlemeyi takiben, bir Batı lekesi için her kuyudan bir alikot hasat edin. Hücreleri 200 mikrolitre% 0.05 tripsin EDTA ile harekete geçirin. Hücreleri 37 santigrat derecede iki ila beş dakika inkübe edin.

Hücreleri iki mililitre DMEM-10 ile söndürün ve hücrelerin yarısını başka bir altı oyuklu plakaya aktarın. Hücreler plakanın dibine yapışana kadar bekleyin. Daha sonra, Western blot için lizasyondan önce hücreleri bir kez PBS ile yıkayın.

Altı oyuklu bir plakada oyuk başına 0.2 milyon hücrede birkaç negatif klon plaka. Hücreleri bir kez 10 mikromolar 5-azasitidin ile tedavi edin. Daha sonra, daha önce olduğu gibi, lusiferaz aktivitesini test etmeden önce ortamı değiştirmeden 72 saat inkübe edin.

Ardından, ekran için 5-azasitidin ile lusiferaz aktivitesi kazanan bir negatif klon seçin ve onu birden fazla 10 santimetrelik plakaya genişletmeye başlayın. Kalan negatif klonları yedek olarak sıvı nitrojen içinde dondurun. Pozitif klon, doku kültüründe muhafaza edilebilir veya daha fazla kullanıma kadar dondurulabilir.

Sabah, bir milyon inaktif X hücresini 10 santimetrelik doku kültürü plakalarına plakalayın. Öğleden sonra, ortamı önceden belirlenmiş miktarda viral süpernatan ve mililitre polibren başına beş ila 10 mikrogram içeren taze DMEM-10 ile değiştirerek plakaları enfekte edin. 18 ila 24 saat sonra, ortamı aspire edin ve her plakaya 10 mililitre taze DMEM-10 ekleyin.

48 saat daha kültür plakaları. Sabahları, plaka başına bir mililitre% 0.05 tripsin EDTA kullanarak hücreleri harekete geçirin ve hücreleri plaka başına 9 mililitre DMEM-10 ile söndürün. Süspansiyonu 100 mikronluk bir gözenekli filtreden geçirin.

Filtrelenmiş süspansiyonları bir araya getirin ve plaka başına bir milyon hücreye iki set 10 santimetrelik plaka tohumlayın. Öğleden sonra, mililitre Higromisin B.In diğer set başına 15 mikrogram içeren DMEM-10 ile bir plaka setindeki ortamı değiştirin, ortamı yalnızca taze DMEM-10 ile değiştirin. 48 saat sonra, hücreleri bir mililitre% 0.05 tripsin EDTA kullanarak Higromisin B işlenmemiş plakalardan harekete geçirin.

37 santigrat derecede iki ila beş dakika inkübe edin. Daha sonra, hücreleri 9 mililitre DMEM-10 ile söndürün. Tek tek numuneleri çekin ve hemen DNA'yı çıkarmaya devam edin.

Higromisin B seçim setini altı gün daha kültürlemeye devam edin, seçim ortamını her gün Higromisin B içeren taze DMEM-10 ile doldurun. Altıncı günde, seçim ortamını yalnızca yeni DMEM-10 ile değiştirin. Kurtarma için dört gün bekleyin ve ardından seçim sonrası numune DNA'sını daha önce olduğu gibi hasat edin.

Metin protokolünde açıklandığı gibi, seçim sonrası örneklerde zenginleştirilmiş saç tokalarını tanımlamaya devam edin. İsabetleri doğrulamak için, önce 10 santimetrelik plakalarda plaka başına sekiz milyon 293-FT hücre tohumlayın. Ertesi gün, ortamı transeksiyondan 30 dakika önce plaka başına dokuz mililitre antibiyotik içermeyen DMEM-10 ile değiştirin.

Daha sonra, 0.5 mililitre transfeksiyon karışımı, her bir transfeksiyon karışımı ikisine bir tane ekleyin ve pipetleme ile hafifçe karıştırın. Daha sonra karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Karışımı her bir plakaya damla damla uygulayın ve karıştırmak için plakayı hafifçe döndürün.

Ertesi gün, ilk transfeksiyondan saat sonra ortamı beş mililitre taze DMEM-10.48 ile değiştirin, lentiviral süpernatantı toplayın ve geri kazanımı en üst düzeye çıkarmak için DMEM-10 ile önceden ıslatılmış 0.22 mikronluk bir filtreden geçirin. Ertesi sabah, 0.1 milyon inaktif X hücresini kuyu başına altı kuyucuk plakasına yerleştirin. Öğleden sonra, ortamı lentiviral süpernatan içeren iki mililitre taze DMEM-10 ve mililitre polibren başına beş ila 10 mikrogram ile değiştirerek plakaları enfekte edin.

Boş bir lentiviral vektörden üretilen viral süpernatan ile bir kontrol kuyusunu enfekte edin. Ertesi gün, ortamı mililitre puromisin başına bir miligram içeren iki mililitre DMEM-10 ile değiştirin. Seçimi dört gün boyunca kullanın.

Dört gün sonra, ortamı iki mililitre taze DMEM-10 ile değiştirin ve iyileşme için 48 ila 72 saat bekleyin. Hücreleri 150 mikrolitre% 0.05 tripsin EDTA ile harekete geçirdikten sonra, 37 santigrat derecede iki ila beş dakika inkübe edin. Hücreleri 1.5 mililitre DMEM-10 ile söndürün, ardından konik tüplere aktarın ve hücreleri oda sıcaklığında 500 kez G'de 10 dakika santrifüjleyin.

Ortamı çıkarın ve hücreleri, lusiferaz tahlil kitinde sağlanan 100 mikrolitre lizis tamponunda yeniden askıya alın. Süspansiyonu oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Beş dakika sonra, süspansiyonu beyaz bir 96 oyuklu plakaya aktarın.

Kitte bulunan protokolü takip ederek testi karanlık odada gerçekleştirin. Pozitif kontrol olarak aktif X hücrelerini ve negatif kontrol olarak boş bir lentiviral vektör ile enfekte olmuş negatif X hücrelerini kullanın. Ölümsüzleştirilmiş fare tendonu fibroblast klonları, raportörün sırasıyla aktif veya inaktif X kromozomu üzerindeki yerleşimi ile tutarlı olarak pozitif veya negatif Firefly lusiferaz aktivitesi gösterir.

MeCP2 ifadesi, Western blot tarafından belirlendiği gibi, karşılıklı deseni sergiler. Firefly lusiferaz aktivitesinin, 5-azasitidin uygulamasıyla negatif klonlarda indüklenebileceğini unutmayın. Aktif X kromozomu üzerinde mevcutsa, Higromisin direnç geni, aktif olmayan X kromozomu üzerindeki gene sahip hücrelerle karşılaştırıldığında, Higromisin seçimi altında bir sağkalım avantajı sağlar.

Bu videoyu izledikten sonra, inaktif X kromozomuna seçici olarak yerleştirilen raportörleri kullanarak X kromozomu inaktivasyon düzenleyicileri için bir ekranın nasıl tasarlanacağını ve gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Laboratuvarım daha önce mayadaki kromatin düzenleyicileri için rapor edilen baz ekranları gerçekleştirmişti ve bu yaklaşımdaki başarımız, memeli hücrelerinde X kromozomu inaktivasyonunun düzenleyicileri için bu ekranı tasarlamam için bana ilham verdi. Bu prosedürü takiben, memeli hücrelerinde X kromozomu inaktivasyonu ile ilgili ek soruları yanıtlamaya yardımcı olmak için küçük, enterferans yapan RNA'lar, CRISPR, küçük moleküller gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir.