GLUT4 protein Deconvolution mikroskobu kullanarak fare birincil hipotalamik nöronlarda ticareti canlı görüntüleri

Bu deneyin genel amacı, hipotalamik nöronlarda GLUT4 gibi birincil nöronal hücrelerde gerçek zamanlı protein trafiğini minimum hasarla gözlemlemektir. Bu yöntem, tip 2 diabetes mellitus durumunda olduğu gibi insülin sinyalizasyonu ve metabolizmasının nöronal regülasyonu ile ilgili temel soruları açıklayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacıların birincil hücre kültürlerini izole edebilmeleri ve ilaca bağlı etkiyi gerçek zamanlı olarak gözlemleyebilmeleridir.

Bu tekniğin anlamı, tip 2 diyabet veya beyinle ilişkili insülin direncinin bir tedavisini seçmektir, çünkü şimdi bu insülin sinyalinin hipotalamik nöronlardaki kemokin CCL5 tarafından nasıl değiştirildiğini biliyoruz. Bu işleme başlamak için, kültür kaplarını kültürden bir gün önce poli-D lizin ile kaplayın. Altı oyuklu bir yemek için, her oyuğa 0,05 mg / mL'de 1,5 mL poli-D lizin ekleyin.

Ertesi gün, poli-D lizini çıkarın ve bulaşıkları 2 mL ddH2O ile iki kez yıkayın. Daha sonra 10 cm'lik Petri kaplarını 20 mL yıkama ortamı ile doldurun ve buz üzerinde tutun. 15 mL'lik tüpleri yıkama ortamı ile doldurun ve buz üzerinde tutun.

Beyin dokusu izolasyonu için, kontaminasyonu önlemek için platformu, diseksiyon mikroskobunu ve cerrahi aletleri% 75 etanol ile sterilize edin. Bundan sonra, yavruları onlara zarar vermeden izole etmek için göbek kordonu bölgesinin etrafını kesin. Ardından, her yavrunun başını çıkarın ve ince uçlu düz forseps kullanarak yerine sabitleyin.

Dış deriyi ve kafatasını her iki taraftan çıkarmak için başka bir ince uçlu kavisli forseps kullanın ve bunları önden sırt yönüne doğru soyun. Ardından, izole edilmiş beyinleri buz gibi soğuk yıkama ortamına sahip temiz bir Petri kabında tutun. Beyni çevirin ve ventral tarafı yukarıda tutun.

Daha sonra, hipotalamik dokuyu ince uçlu kavisli forseps ile izole edin. Keskin forseps ile koku alma lobunu tutun ve kavisli forseps ile tüm beyni çevreleyen ince meninksleri soyun. Korteksin alt tarafına çevirin ve hipokampusu yana doğru çekerek korteksten ayırın.

Beynin tüm bölgeleri izole edildiğinde, bu dokuları buz gibi soğuk yıkama ortamı içeren 15 ml'lik tüplerde doğrayın. Bu prosedürde, doku içeren tüpü iki ila üç kez ters çevirerek dokuları durulayın. Ardından, dokuların yerleşmesine izin vermek için tüpü düz tutun.

Bir vakum sistemine bağlı cam Pasteur pipetini kullanarak üst ortamı çıkarın. Dokuyu yıkamak için 15 mL buz gibi soğuk yıkama ortamı ekleyin ve tüpü iki ila üç kez ters çevirin. Son yıkamadan sonra, yıkama ortamını 1 mL'lik bir pipet yardımıyla çıkarın.

Dokuları Papain-Tripsin sindirim tamponu ile 37 derecelik bir su banyosunda yedi ila 14 dakika inkübe edin. Bunu takiben, bir hacim fetal sığır serumu ekleyerek enzim aktivitesini nötralize edin. Tüpü rafta tutun ve dokuların oturması için bir ila iki dakika bekleyin.

Daha sonra, süpernatanı 1 mL'lik bir pipetle dikkatlice çıkarın. Test tüpüne 6 mL kaplama ortamı ekleyin ve dokuyu 5 mL'lik bir pipetle 50 kez yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyin. Tüpü rafta tutun ve tıknaz, ayrışmamış dokuların yerleşmesine izin vermek için bir ila iki dakika bekleyin.

Daha sonra, ayrışmış hücreleri içeren üst fazı yeni bir tüpe aktarın ve kaplama ortamı ile seyreltin. Daha sonra, altı oyuklu tabağın her bir oyuğuna 2 mL tam kültür ortamı ekleyin. Hücreleri canlı görüntülemeye hazırlamak için, forseps kullanarak nöronlu kapak fişlerini dikkatlice çıkarın ve dikkatli bir şekilde cam slayt üzerine yerleştirin.

Ardından, hassas görev mendilleriyle fazla ortamı iki kez katlayarak ve hareket ettirmeden dikkatlice kapak fişine yerleştirerek çıkarın. Kapak kızağı üzerinde gereksiz hareketi önlemek için fazla miktarda ortamın çıkarılması önemlidir. Daha sonra, seçilen hücre örneklerini bir dakika boyunca 10 ng / mL'de CCL5 veya 10 birim / mL'de insülin ile tedavi edin.

Bunu takiben, kapak kızaklarının kenarına 1.5 mcL seyreltilmiş insülin ekleyin. Ardından, 60 kat büyütmeli 1.52 NA objektif lens üzerine daldırma yağı ekleyin. Daha sonra, kapak fişlerini, kapak fişleri aşağı bakacak ve düzgün bir şekilde sabitlenecek şekilde evrişim mikroskobu aşamasına yerleştirin.

Hedef hücreleri tanımlamak için parlak alan veya floresan aydınlatması kullanın. Daha sonra, hedef hücreler net bir şekilde gözlemlenene kadar odağı ayarlayın. Gereksiz çizik izlerini önlemek için objektif merceğini kapak kayma alanının dışına çıkarmayın.

Ardından, GFP-GLUT4'ü GFP sinyali ile tanımlayın. Ardından, görüntü elde etmek için istenen hedef hücreleri belirleyin. Ardından, piksel sayısı, uyarma dalga boyu, iletim yüzdesi, maruz kalma süresi, yığın kalınlığı, zaman aralığı ve toplam görüntüleme süresi dahil olmak üzere her hedef hücrede uygun deneysel parametreleri ayarlayın.

Maksimum piksel yoğunluğunu elde etmek için pozlama parametresini yaklaşık 2000 ila 3000 sayıma ayarlayın. Floresan foto ağartmayı en aza indirmek için, pozlama süresini bir saniyeden az tutarken uyarma ışığı iletim yüzdesini mümkün olduğunca azaltın. Mikroskop aşamasını hedef hücrenin üst ve alt kısımları hafifçe odak dışına çıkana kadar hareket ettirerek her hedef hücredeki Z yığınının üst ve alt sınırını ayarlayın.

Işık görüntüsünü takiben nöron ölümünde floresan foto beyazlamanın en aza indirilmesi çok önemlidir. Bu şekil, primer kültürlenmiş hipotalamik nöronların nöron markörü MAP2 ile etiketlendiğini göstermektedir. Hipotalamik nöronal belirteç POMC ve CCR5'in birlikte ekspresyonu.

Kolokalize görüntü, CCL5'in POMC pozitif hipotalamik nöronlarda eksprese edildiğini göstermektedir. Bu görüntüler, vahşi tip hipotalamik nöronlarda ve CCR5 çift negatif hipotalamik nöronlarda GFP-GLUT4 proteininin ekspresyonunu göstermektedir. Nöronlar insülin veya CCL5 ile uyarıldı.

Oklar, insülin veya CCL5 stimülasyonundan önce veya sonra nöritte GFP-GLUT4 punktatını gösterir ve yıldız işaretleri, CCL5 stimülasyonundan önce veya sonra yüzey GLUT4-GFP'yi gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, birincil hücre tekniğinin bu laboratuvar kaydı, deney gereksinimlerine ve düzgün bir şekilde yapılıp yapılmadığına bağlı olarak bir ila dört saat arasında yapılabilir. Bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların, birincil hücre kültüründe ilacın neden olduğu ani etkiyi karakterize etme olasılığını keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, birincil hipotalamik nöron, hipokampal nöron ve kortikal nöronun nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Laboratuvarın yanı sıra, farklı stimülasyonlar üzerine seri molekülün canlı kaydını nasıl yapacağınızı da öğrenebilirsiniz. Hayvanlardan bakteri ve mantar kontaminasyonunu önlemek için laboratuvar önlüğünüzü ve eldivenlerinizi giymeyi ve sık sık etanol kullanmayı unutmayın.

Ayrıca bu prosedür boyunca kapak fişleri ve nöronlarla uğraşırken çok dikkatli olun.