Hücre Döngüsü Analizi
Hücre döngüsü, bir hücre içinde meydana gelen ve bölünmesine yol açan hücresel ve biyokimyasal süreçler kümesini ifade eder. Bir hücre, döngünün farklı aşamalarından geçer ve bu işlemi tamamlamak için geçen süre, bir hücre tipi için neredeyse sabittir. Bu süreden herhangi bir sapma, anormal hücre bölünmesinin göstergesidir. Bu nedenle, hücre döngüsü analizi, hücre bölünmesi mekanizmalarını incelemekle ilgilenen biyologlar için çok yararlı bir araç haline gelir ve bu da sonuçta hücre döngüsünün bozulduğu kanser gibi hastalıkları olan hastaların tedavisinde yardımcı olacaktır.
Bu video, hücre döngüsü analizinin ilkesini ve genelleştirilmiş bir protokolünü tartışacaktır. Son olarak, yaygın olarak kullanılan bu yöntemin bazı uygulamalarını göstereceğiz.
Hücre döngüsü analizinin ne olduğunu ve bu testin nasıl çalıştığını öğrenelim.
Esasen, karışık bir popülasyonun hücre döngüsü analizi, bize farklı fazların her birinde kaç hücre olduğunu söyler. Bu en yaygın olarak hücrenin DNA içeriğini değerlendirerek yapılır. Şöyle düşünebilirsiniz: neden DNA içeriği? Bunu anlamak için, bir hücre döngü boyunca ilerlerken kromozomal DNA'ya ne olduğunu kısaca gözden geçirelim.
G1 fazı sırasında, bir hücre içindeki DNA içeriği değişmez. S fazı boyunca DNA replikasyonu gerçekleşir ve bu fazın sonunda DNA içeriği iki katına çıkar. G2 fazında, hücreler DNA kopyalanmasında herhangi bir hata olup olmadığını kontrol eder ve son olarak - M aşamasının sonunda - bu DNA eşit olarak iki yavru hücreye bölünür. Bu nedenle, DNA'yı etiketlemek, bir bilim insanının hücre döngüsü aşamasını belirlemesine yardımcı olabilir.
Bu etiketleme için önemli bir husus, DNA bağlayıcı boya seçimidir. Bromodeoksiüridin veya BrdU, bir nükleik asit analoğudur ve yapısal olarak timidini taklit eder. Bu, BrdU'nun DNA replikasyonu sırasında büyüyen ipliğe dahil olmasına izin verir. Bu nedenle, bu boya sadece S fazındaki hücreleri etiketler. BrdU dahil edildikten sonra, DNA zincirleri ayrılır ve floresan etiketli antikorlar yardımıyla BrdU tespit edilir.
Doğası gereği floresan olan propidyum iyodür veya PI gibi diğer bileşikler, çift sarmallı nükleik asitler arasında ara katkadro oluşturur ve bu nedenle hücreleri her aşamada boyar. Bununla birlikte, PI boyama miktarı DNA miktarı ile orantılıdır.
Bir lekenin seçimi eldeki deneye bağlı olsa da, araştırmacılar genellikle ikili boyama prosedürleri kullanır. Tüm hücrelere orantılı olarak bağlanan PI gibi moleküller, G1 hücrelerini G2 veya M fazı hücrelerinden kolayca ayırt edebilir. Bununla birlikte, S fazı hücreleri hala geçiş halindedir. Bu nedenle, yalnızca S fazı hücrelerini etiketleyen BrdU gibi moleküllerin eklenmesi, hücre döngüsü aşaması tespitinin özgüllüğünü arttırır. Son olarak, hücreler, farklı hücre döngüsü aşamalarındaki hücreleri numaralandırmak için akış sitometrisi kullanılarak analiz edilir.
Artık hücre döngüsü boyamanın arkasındaki ilkeleri anladığınıza göre, BrdU ve PI kullanan bir prosedürü tartışalım.
Hücre kültürü kapları kurun: biri deney için ve diğeri kontrol olarak üç. Yaklaşık% 60 birleşmede, kültür ortamında çözünen BrdU canlı hücrelere eklenir, ardından inkübasyon yapılır. Bu aşamada, BrdU replikasyon yapan DNA'ya dahil edilir.
İnkübasyonun ardından, hücreler santrifüjlenir ve fosfat tamponlu salin veya PBS içinde yeniden süspanse edilir. Daha sonra, hücreler, hafifçe girdap yaparken buz gibi soğuk% 70 etanole damla damla hücre süspansiyonu eklenerek sabitlenir. Bu, hücre bölünmesini durdurur ve topaklanmayı önler.
Sabit hücreler tekrar santrifüjlenir ve PBS'de yeniden süspanse edilir. Daha sonra, Triton-X gibi bir deterjan içeren konsantre bir asit çözeltisi hücrelere damla damla eklenir. Deterjan, zar geçirimsiz bileşiklerin girişine izin vermek için hücrelere nüfuz eder ve asit, pH'ı düşürür ve DNA'yı denatüre ederek BrdU'yu açığa çıkarır. Hücreler daha sonra santrifüjlenir, süpernatant atılır ve pelet, pH'ı geri kazanmak için alkali çözelti içinde yeniden süspanse edilir.
Son olarak, hücreler PBS ile yıkanır ve oda sıcaklığında bir floresan etikete konjuge edilmiş bir BrdU antikoru ile inkübe edilir. Bu adımdan sonra, foto ağartmayı önlemek için numuneler ışıktan korunmalıdır.
Çift boyama sırasında, hücreler PI ve RNaz ile inkübe edilir. RNaz, aynı zamanda PI'ye bağlanan ve yanlış pozitif sonuçlar verebilen RNA-RNA veya RNA-DNA çift sarmallarını çıkarmak için gereklidir. Hücreler daha sonra akış sitometrik analizi için gerekli olan tek hücre süspansiyonunu yapmak için bir hücre süzgecinden geçirilir.
Artık boyama protokolünü öğrendiğinize göre, elde edilen verilerin nasıl analiz edileceğini gözden geçirelim.
Kısaca, akış sitometrisinde bir lazer ışını, tek hücre süspansiyonunun dar bir akışı üzerinde parlar ve her hücredeki boyalardan belirli dalga boylarındaki emisyon, bir saçılma grafiği üzerinde tek bir olay olarak tespit edilir.
Burada, PI lekeli hücrelerin dağılım grafiği, biri diğerinden neredeyse iki kat daha fazla PI içeren iki farklı küme gösterir. PI dedektörünün optimizasyonunu takiben, bu setler bir histogram analizinde iki tepe noktası olarak görünür. Daha yüksek PI yoğunluğundaki tepe noktası G2/M hücrelerini temsil eder ve daha düşük yoğunluktaki tepe noktası G1 hücrelerini temsil eder. Bu tepe noktalarının altındaki alanlar, karşılık gelen fazlardaki hücre sayısını temsil eder.
Benzer şekilde, BrdU-FITC olayları logaritmik bir ölçekte bir histogram analizinde görüntülenebilir. Bu grafik, BrdU pozitif hücrelerin boyanmamış hücrelerden belirgin şekilde daha parlak olduğunu ve popülasyonun sadece bir kısmının S fazında olduğundan, BrdU boyanmamış hücrelerin daha büyük bir zirvesinin görülebileceğini göstermektedir.
BrdU ve PI ile boyanmış hücrelerin dağılım grafiği, doğrusal X ekseninde PI ve logaritmik Y ekseninde BrdU ile görüntülenebilir ve bu, G1, S'den G2'ye giden bir at nalı desenini gösterir. Kapılı alanlardaki hücrelerin oranı belirlenebilir ve bir çubuk grafikte görüntülenebilir.
Artık hücre döngüsü analizi için temel protokolü incelediğimize göre, bunun çeşitli deney düzeneklerinde nasıl kullanılabileceğine bakalım.
A'dır. Bilim adamları, genetik manipülasyonları hücre döngüsü analizi ile birleştirerek, hücre döngüsü ilerlemesinde belirli proteinlerin rollerini inceler. Bu çalışmada, bilim adamları fare embriyonik fibroblastlarında p27 adı verilen bir proteini aşırı eksprese ettiler. Sonuçlar, aşırı ekspresyonun S fazında daha düşük hücre sayısına yol açtığını ve bu proteinin hücre döngüsü düzenlemesinde kritik bir rol oynadığını göstermektedir.
Bilim adamları, hücre döngüsü analizini kullanarak ilerleme kinetiğini karşılaştırabilirler. Burada, iki kolorektal kanser hücre hattı ile bir meme kanseri hücre hattı arasındaki progresyon kinetiği karşılaştırıldı. Sonuçlar, meme kanseri hücrelerinin, zaman içinde G1'deki meme kanseri hücrelerinin daha yüksek yüzdesi göz önüne alındığında, kolorektal hücre hatlarına kıyasla hücre döngüsü boyunca daha yavaş bir oranda ilerlediğini gösterdi.
Son olarak, in vivo hücre döngüsü analizi için, BrdU kemirgenlere enjekte edilebilir ve hedef hücre popülasyonu hücre döngüsü analizi için izole edilebilir. Bu çalışmada, BrdU enjekte edilen farelerin hematopoietik kök hücreleri veya HSC'leri akış sitometrik analizi için izole edildi. Toplanan veriler, HSC'lerin G1 ve S fazında baskın olan farklı hücre döngüsü aşamaları arasındaki dağılımını ortaya koydu.
Az önce JoVE'nin hücre döngüsü analizi hakkındaki videosunu izlediniz. Bu sürecin arkasındaki ilkeleri gözden geçirdik, adım adım bir protokolü detaylandırdık ve bu tür bir analizin çeşitli deneysel ortamlarda nasıl kullanıldığını inceledik. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Hücre döngüsü, bir hücrenin büyüdüğü, genomunu kopyaladığı ve nihayetinde mitoz süreci boyunca iki yavru hücreye bölündüğü olaylar kümesini ifade eder…
Hücre döngüsü, bir hücre içinde meydana gelen ve bölünmesine yol açan hücresel ve biyokimyasal süreçler kümesini ifade eder. Bir hücre, döngünün farklı aşamalarından geçer ve bu işlemi tamamlamak için geçen süre, bir hücre tipi için neredeyse sabittir. Bu süreden herhangi bir sapma, anormal hücre bölünmesinin göstergesidir. Bu nedenle, hücre döngüsü analizi, hücre bölünmesi mekanizmalarını incelemekle ilgilenen biyologlar için çok yararlı bir araç haline gelir ve bu da sonuçta hücre döngüsünün bozulduğu kanser gibi hastalıkları olan hastaların tedavisinde yardımcı olacaktır.
Bu video, hücre döngüsü analizinin ilkesini ve genelleştirilmiş bir protokolünü tartışacaktır. Son olarak, yaygın olarak kullanılan bu yöntemin bazı uygulamalarını göstereceğiz.
Hücre döngüsü analizinin ne olduğunu ve bu testin nasıl çalıştığını öğrenelim.
Esasen, karışık bir popülasyonun hücre döngüsü analizi, bize farklı fazların her birinde kaç hücre olduğunu söyler. Bu en yaygın olarak hücrenin DNA içeriğini değerlendirerek yapılır. Şöyle düşünebilirsiniz: neden DNA içeriği? Bunu anlamak için, bir hücre döngü boyunca ilerlerken kromozomal DNA'ya ne olduğunu kısaca gözden geçirelim.
G1 fazı sırasında, bir hücre içindeki DNA içeriği değişmez. S fazı boyunca DNA replikasyonu gerçekleşir ve bu fazın sonunda DNA içeriği iki katına çıkar. G2 fazında, hücreler DNA kopyalanmasında herhangi bir hata olup olmadığını kontrol eder ve son olarak - M aşamasının sonunda - bu DNA eşit olarak iki yavru hücreye bölünür. Bu nedenle, DNA'yı etiketlemek, bir bilim insanının hücre döngüsü aşamasını belirlemesine yardımcı olabilir.
Bu etiketleme için önemli bir husus, DNA bağlayıcı boya seçimidir. Bromodeoksiüridin veya BrdU, bir nükleik asit analoğudur ve yapısal olarak timidini taklit eder. Bu, BrdU'nun DNA replikasyonu sırasında büyüyen ipliğe dahil olmasına izin verir. Bu nedenle, bu boya sadece S fazındaki hücreleri etiketler. BrdU dahil edildikten sonra, DNA zincirleri ayrılır ve floresan etiketli antikorlar yardımıyla BrdU tespit edilir.
Doğası gereği floresan olan propidyum iyodür veya PI gibi diğer bileşikler, çift sarmallı nükleik asitler arasında ara katkadro oluşturur ve bu nedenle hücreleri her aşamada boyar. Bununla birlikte, PI boyama miktarı DNA miktarı ile orantılıdır.
Bir lekenin seçimi eldeki deneye bağlı olsa da, araştırmacılar genellikle ikili boyama prosedürleri kullanır. Tüm hücrelere orantılı olarak bağlanan PI gibi moleküller, G1 hücrelerini G2 veya M fazı hücrelerinden kolayca ayırt edebilir. Bununla birlikte, S fazı hücreleri hala geçiş halindedir. Bu nedenle, yalnızca S fazı hücrelerini etiketleyen BrdU gibi moleküllerin eklenmesi, hücre döngüsü aşaması tespitinin özgüllüğünü arttırır. Son olarak, hücreler, farklı hücre döngüsü aşamalarındaki hücreleri numaralandırmak için akış sitometrisi kullanılarak analiz edilir.
Artık hücre döngüsü boyamanın arkasındaki ilkeleri anladığınıza göre, BrdU ve PI kullanan bir prosedürü tartışalım.
Hücre kültürü kapları kurun: biri deney için ve diğeri kontrol olarak üç. Yaklaşık% 60 birleşmede, kültür ortamında çözünen BrdU canlı hücrelere eklenir, ardından inkübasyon yapılır. Bu aşamada, BrdU replikasyon yapan DNA'ya dahil edilir.
İnkübasyonun ardından, hücreler santrifüjlenir ve fosfat tamponlu salin veya PBS içinde yeniden süspanse edilir. Daha sonra, hücreler, hafifçe girdap yaparken buz gibi soğuk% 70 etanole damla damla hücre süspansiyonu eklenerek sabitlenir. Bu, hücre bölünmesini durdurur ve topaklanmayı önler.
Sabit hücreler tekrar santrifüjlenir ve PBS'de yeniden süspanse edilir. Daha sonra, Triton-X gibi bir deterjan içeren konsantre bir asit çözeltisi hücrelere damla damla eklenir. Deterjan, zar geçirimsiz bileşiklerin girişine izin vermek için hücrelere nüfuz eder ve asit, pH'ı düşürür ve DNA'yı denatüre ederek BrdU'yu açığa çıkarır. Hücreler daha sonra santrifüjlenir, süpernatant atılır ve pelet, pH'ı geri kazanmak için alkali çözelti içinde yeniden süspanse edilir.
Son olarak, hücreler PBS ile yıkanır ve oda sıcaklığında bir floresan etikete konjuge edilmiş bir BrdU antikoru ile inkübe edilir. Bu adımdan sonra, foto ağartmayı önlemek için numuneler ışıktan korunmalıdır.
Çift boyama sırasında, hücreler PI ve RNaz ile inkübe edilir. RNaz, aynı zamanda PI'ye bağlanan ve yanlış pozitif sonuçlar verebilen RNA-RNA veya RNA-DNA çift sarmallarını çıkarmak için gereklidir. Hücreler daha sonra akış sitometrik analizi için gerekli olan tek hücre süspansiyonunu yapmak için bir hücre süzgecinden geçirilir.
Artık boyama protokolünü öğrendiğinize göre, elde edilen verilerin nasıl analiz edileceğini gözden geçirelim.
Kısaca, akış sitometrisinde bir lazer ışını, tek hücre süspansiyonunun dar bir akışı üzerinde parlar ve her hücredeki boyalardan belirli dalga boylarındaki emisyon, bir saçılma grafiği üzerinde tek bir olay olarak tespit edilir.
Burada, PI lekeli hücrelerin dağılım grafiği, biri diğerinden neredeyse iki kat daha fazla PI içeren iki farklı küme gösterir. PI dedektörünün optimizasyonunu takiben, bu setler bir histogram analizinde iki tepe noktası olarak görünür. Daha yüksek PI yoğunluğundaki tepe noktası G2/M hücrelerini temsil eder ve daha düşük yoğunluktaki tepe noktası G1 hücrelerini temsil eder. Bu tepe noktalarının altındaki alanlar, karşılık gelen fazlardaki hücre sayısını temsil eder.
Benzer şekilde, BrdU-FITC olayları logaritmik bir ölçekte bir histogram analizinde görüntülenebilir. Bu grafik, BrdU pozitif hücrelerin boyanmamış hücrelerden belirgin şekilde daha parlak olduğunu ve popülasyonun sadece bir kısmının S fazında olduğundan, BrdU boyanmamış hücrelerin daha büyük bir zirvesinin görülebileceğini göstermektedir.
BrdU ve PI ile boyanmış hücrelerin dağılım grafiği, doğrusal X ekseninde PI ve logaritmik Y ekseninde BrdU ile görüntülenebilir ve bu, G1, S'den G2'ye giden bir at nalı desenini gösterir. Kapılı alanlardaki hücrelerin oranı belirlenebilir ve bir çubuk grafikte görüntülenebilir.
Artık hücre döngüsü analizi için temel protokolü incelediğimize göre, bunun çeşitli deney düzeneklerinde nasıl kullanılabileceğine bakalım.
A'dır. Bilim adamları, genetik manipülasyonları hücre döngüsü analizi ile birleştirerek, hücre döngüsü ilerlemesinde belirli proteinlerin rollerini inceler. Bu çalışmada, bilim adamları fare embriyonik fibroblastlarında p27 adı verilen bir proteini aşırı eksprese ettiler. Sonuçlar, aşırı ekspresyonun S fazında daha düşük hücre sayısına yol açtığını ve bu proteinin hücre döngüsü düzenlemesinde kritik bir rol oynadığını göstermektedir.
Bilim adamları, hücre döngüsü analizini kullanarak ilerleme kinetiğini karşılaştırabilirler. Burada, iki kolorektal kanser hücre hattı ile bir meme kanseri hücre hattı arasındaki progresyon kinetiği karşılaştırıldı. Sonuçlar, meme kanseri hücrelerinin, zaman içinde G1'deki meme kanseri hücrelerinin daha yüksek yüzdesi göz önüne alındığında, kolorektal hücre hatlarına kıyasla hücre döngüsü boyunca daha yavaş bir oranda ilerlediğini gösterdi.
Son olarak, in vivo hücre döngüsü analizi için, BrdU kemirgenlere enjekte edilebilir ve hedef hücre popülasyonu hücre döngüsü analizi için izole edilebilir. Bu çalışmada, BrdU enjekte edilen farelerin hematopoietik kök hücreleri veya HSC'leri akış sitometrik analizi için izole edildi. Toplanan veriler, HSC'lerin G1 ve S fazında baskın olan farklı hücre döngüsü aşamaları arasındaki dağılımını ortaya koydu.
Az önce JoVE'nin hücre döngüsü analizi hakkındaki videosunu izlediniz. Bu sürecin arkasındaki ilkeleri gözden geçirdik, adım adım bir protokolü detaylandırdık ve bu tür bir analizin çeşitli deneysel ortamlarda nasıl kullanıldığını inceledik. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Hücre döngüsü, bir hücre içinde meydana gelen ve bölünmesine yol açan hücresel ve biyokimyasal süreçler kümesini ifade eder. Bir hücre, döngünün farklı aşamalarından geçer ve bu işlemi tamamlamak için geçen süre, bir hücre tipi için neredeyse sabittir. Bu süreden herhangi bir sapma, anormal hücre bölünmesinin göstergesidir. Bu nedenle, hücre döngüsü analizi, hücre bölünmesi mekanizmalarını incelemekle ilgilenen biyologlar için çok yararlı bir araç haline gelir ve bu da sonuçta hücre döngüsünün bozulduğu kanser gibi hastalıkları olan hastaların tedavisinde yardımcı olacaktır.
Bu video, hücre döngüsü analizinin ilkesini ve genelleştirilmiş bir protokolünü tartışacaktır. Son olarak, yaygın olarak kullanılan bu yöntemin bazı uygulamalarını göstereceğiz.
Hücre döngüsü analizinin ne olduğunu ve bu testin nasıl çalıştığını öğrenelim.
Esasen, karışık bir popülasyonun hücre döngüsü analizi, bize farklı fazların her birinde kaç hücre olduğunu söyler. Bu en yaygın olarak hücrenin DNA içeriğini değerlendirerek yapılır. Şöyle düşünebilirsiniz: neden DNA içeriği? Bunu anlamak için, bir hücre döngü boyunca ilerlerken kromozomal DNA'ya ne olduğunu kısaca gözden geçirelim.
G1 fazı sırasında, bir hücre içindeki DNA içeriği değişmez. S fazı boyunca DNA replikasyonu gerçekleşir ve bu fazın sonunda DNA içeriği iki katına çıkar. G2 fazında, hücreler DNA kopyalanmasında herhangi bir hata olup olmadığını kontrol eder ve son olarak - M aşamasının sonunda - bu DNA eşit olarak iki yavru hücreye bölünür. Bu nedenle, DNA'yı etiketlemek, bir bilim insanının hücre döngüsü aşamasını belirlemesine yardımcı olabilir.
Bu etiketleme için önemli bir husus, DNA bağlayıcı boya seçimidir. Bromodeoksiüridin veya BrdU, bir nükleik asit analoğudur ve yapısal olarak timidini taklit eder. Bu, BrdU'nun DNA replikasyonu sırasında büyüyen ipliğe dahil olmasına izin verir. Bu nedenle, bu boya sadece S fazındaki hücreleri etiketler. BrdU dahil edildikten sonra, DNA zincirleri ayrılır ve floresan etiketli antikorlar yardımıyla BrdU tespit edilir.
Doğası gereği floresan olan propidyum iyodür veya PI gibi diğer bileşikler, çift sarmallı nükleik asitler arasında ara katkadro oluşturur ve bu nedenle hücreleri her aşamada boyar. Bununla birlikte, PI boyama miktarı DNA miktarı ile orantılıdır.
Bir lekenin seçimi eldeki deneye bağlı olsa da, araştırmacılar genellikle ikili boyama prosedürleri kullanır. Tüm hücrelere orantılı olarak bağlanan PI gibi moleküller, G1 hücrelerini G2 veya M fazı hücrelerinden kolayca ayırt edebilir. Bununla birlikte, S fazı hücreleri hala geçiş halindedir. Bu nedenle, yalnızca S fazı hücrelerini etiketleyen BrdU gibi moleküllerin eklenmesi, hücre döngüsü aşaması tespitinin özgüllüğünü arttırır. Son olarak, hücreler, farklı hücre döngüsü aşamalarındaki hücreleri numaralandırmak için akış sitometrisi kullanılarak analiz edilir.
Artık hücre döngüsü boyamanın arkasındaki ilkeleri anladığınıza göre, BrdU ve PI kullanan bir prosedürü tartışalım.
Hücre kültürü kapları kurun: biri deney için ve diğeri kontrol olarak üç. Yaklaşık% 60 birleşmede, kültür ortamında çözünen BrdU canlı hücrelere eklenir, ardından inkübasyon yapılır. Bu aşamada, BrdU replikasyon yapan DNA'ya dahil edilir.
İnkübasyonun ardından, hücreler santrifüjlenir ve fosfat tamponlu salin veya PBS içinde yeniden süspanse edilir. Daha sonra, hücreler, hafifçe girdap yaparken buz gibi soğuk% 70 etanole damla damla hücre süspansiyonu eklenerek sabitlenir. Bu, hücre bölünmesini durdurur ve topaklanmayı önler.
Sabit hücreler tekrar santrifüjlenir ve PBS'de yeniden süspanse edilir. Daha sonra, Triton-X gibi bir deterjan içeren konsantre bir asit çözeltisi hücrelere damla damla eklenir. Deterjan, zar geçirimsiz bileşiklerin girişine izin vermek için hücrelere nüfuz eder ve asit, pH'ı düşürür ve DNA'yı denatüre ederek BrdU'yu açığa çıkarır. Hücreler daha sonra santrifüjlenir, süpernatant atılır ve pelet, pH'ı geri kazanmak için alkali çözelti içinde yeniden süspanse edilir.
Son olarak, hücreler PBS ile yıkanır ve oda sıcaklığında bir floresan etikete konjuge edilmiş bir BrdU antikoru ile inkübe edilir. Bu adımdan sonra, foto ağartmayı önlemek için numuneler ışıktan korunmalıdır.
Çift boyama sırasında, hücreler PI ve RNaz ile inkübe edilir. RNaz, aynı zamanda PI'ye bağlanan ve yanlış pozitif sonuçlar verebilen RNA-RNA veya RNA-DNA çift sarmallarını çıkarmak için gereklidir. Hücreler daha sonra akış sitometrik analizi için gerekli olan tek hücre süspansiyonunu yapmak için bir hücre süzgecinden geçirilir.
Artık boyama protokolünü öğrendiğinize göre, elde edilen verilerin nasıl analiz edileceğini gözden geçirelim.
Kısaca, akış sitometrisinde bir lazer ışını, tek hücre süspansiyonunun dar bir akışı üzerinde parlar ve her hücredeki boyalardan belirli dalga boylarındaki emisyon, bir saçılma grafiği üzerinde tek bir olay olarak tespit edilir.
Burada, PI lekeli hücrelerin dağılım grafiği, biri diğerinden neredeyse iki kat daha fazla PI içeren iki farklı küme gösterir. PI dedektörünün optimizasyonunu takiben, bu setler bir histogram analizinde iki tepe noktası olarak görünür. Daha yüksek PI yoğunluğundaki tepe noktası G2/M hücrelerini temsil eder ve daha düşük yoğunluktaki tepe noktası G1 hücrelerini temsil eder. Bu tepe noktalarının altındaki alanlar, karşılık gelen fazlardaki hücre sayısını temsil eder.
Benzer şekilde, BrdU-FITC olayları logaritmik bir ölçekte bir histogram analizinde görüntülenebilir. Bu grafik, BrdU pozitif hücrelerin boyanmamış hücrelerden belirgin şekilde daha parlak olduğunu ve popülasyonun sadece bir kısmının S fazında olduğundan, BrdU boyanmamış hücrelerin daha büyük bir zirvesinin görülebileceğini göstermektedir.
BrdU ve PI ile boyanmış hücrelerin dağılım grafiği, doğrusal X ekseninde PI ve logaritmik Y ekseninde BrdU ile görüntülenebilir ve bu, G1, S'den G2'ye giden bir at nalı desenini gösterir. Kapılı alanlardaki hücrelerin oranı belirlenebilir ve bir çubuk grafikte görüntülenebilir.
Artık hücre döngüsü analizi için temel protokolü incelediğimize göre, bunun çeşitli deney düzeneklerinde nasıl kullanılabileceğine bakalım.
A'dır. Bilim adamları, genetik manipülasyonları hücre döngüsü analizi ile birleştirerek, hücre döngüsü ilerlemesinde belirli proteinlerin rollerini inceler. Bu çalışmada, bilim adamları fare embriyonik fibroblastlarında p27 adı verilen bir proteini aşırı eksprese ettiler. Sonuçlar, aşırı ekspresyonun S fazında daha düşük hücre sayısına yol açtığını ve bu proteinin hücre döngüsü düzenlemesinde kritik bir rol oynadığını göstermektedir.
Bilim adamları, hücre döngüsü analizini kullanarak ilerleme kinetiğini karşılaştırabilirler. Burada, iki kolorektal kanser hücre hattı ile bir meme kanseri hücre hattı arasındaki progresyon kinetiği karşılaştırıldı. Sonuçlar, meme kanseri hücrelerinin, zaman içinde G1'deki meme kanseri hücrelerinin daha yüksek yüzdesi göz önüne alındığında, kolorektal hücre hatlarına kıyasla hücre döngüsü boyunca daha yavaş bir oranda ilerlediğini gösterdi.
Son olarak, in vivo hücre döngüsü analizi için, BrdU kemirgenlere enjekte edilebilir ve hedef hücre popülasyonu hücre döngüsü analizi için izole edilebilir. Bu çalışmada, BrdU enjekte edilen farelerin hematopoietik kök hücreleri veya HSC'leri akış sitometrik analizi için izole edildi. Toplanan veriler, HSC'lerin G1 ve S fazında baskın olan farklı hücre döngüsü aşamaları arasındaki dağılımını ortaya koydu.
Az önce JoVE'nin hücre döngüsü analizi hakkındaki videosunu izlediniz. Bu sürecin arkasındaki ilkeleri gözden geçirdik, adım adım bir protokolü detaylandırdık ve bu tür bir analizin çeşitli deneysel ortamlarda nasıl kullanıldığını inceledik. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why is DNA content used to determine cell cycle phases?
DNA content changes predictably during the cell cycle, making it an ideal marker for phase identification. During G1, DNA remains constant; during S phase, DNA replicates and doubles; during G2, cells verify replication accuracy; and during M phase, DNA divides equally into daughter cells. These characteristic changes allow scientists to sort cells by their current cycle stage.
Q2: What is the difference between BrdU and propidium iodide staining?
BrdU, a thymidine analog, incorporates only into newly synthesized DNA during S phase, labeling replicating cells exclusively. Propidium iodide intercalates between all double-stranded DNA and stains cells at every cycle stage, with fluorescence proportional to DNA amount. Dual staining combines both dyes to increase specificity: PI differentiates G1 from G2/M cells, while BrdU identifies S phase cells in transition.
Q3: How does flow cytometry detect cells in different cycle phases?
Flow cytometry passes a single cell suspension through a laser beam, detecting fluorescent emissions from DNA-binding dyes at specific wavelengths. Each cell's signal appears as a single event on a scatter plot. PI-stained cells produce two distinct peaks in histogram analysis: higher intensity represents G2/M cells with doubled DNA, while lower intensity represents G1 cells with normal DNA content.
Q4: Why is RNase added during the dual staining protocol?
RNase removes RNA-RNA and RNA-DNA double strands that also bind to propidium iodide, which would produce false positive results and skew data interpretation. By eliminating these non-DNA targets, RNase ensures that PI fluorescence reflects only DNA content, improving the accuracy of cell cycle phase determination and allowing reliable quantification of cells in each phase.
Q5: What does the horseshoe pattern indicate in a BrdU and PI scatter plot?
The horseshoe pattern in a dual-stained scatter plot displays the progression of cells through the cell cycle. The pattern shows cells transitioning from G1 (lower PI, no BrdU) through S phase (increasing PI and BrdU signal) to G2/M (high PI, no BrdU). This visual representation helps researchers quantify the proportion of cells in each gated area and understand population dynamics during cell cycle progression.
Q6: How can cell cycle analysis reveal protein roles in cell division?
By combining genetic manipulations with cell cycle analysis, scientists can observe how altering specific proteins affects cycle progression. For example, overexpressing p27 in mouse fibroblasts reduced S phase cell numbers, demonstrating that p27 regulates cell cycle progression. This approach allows researchers to identify critical proteins involved in cell division, with applications for understanding cancer and developing therapeutic strategies.
Q7: What is the purpose of fixing cells in ice-cold ethanol during the protocol?
Ice-cold 70% ethanol fixes cells by ceasing cell division and preventing clumping, which would compromise analysis accuracy. The cold temperature and gentle vortexing preserve cell integrity while stopping metabolic activity. Fixed cells can then be safely permeabilized with detergent and acid solutions to expose BrdU and allow antibody penetration without cellular degradation.
Bu videodaki bölümler
0:00
Overview
0:56
Principle Behind Cell Cycle Analysis
3:33
Generalized Protocol for BrdU and PI Staining
5:43
Flow Cytometric Analysis
7:26
Applications
9:07
Summary