Name: Hipotalamik insülin sinyal fare beyin içine sürekli uyuşturucu infüzyon sistemi ile periferik glikoz intoleransı için eğitim (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Öğrenin, farelerde mikro-osmotik pompa ile beyne Met CCL5 antagonisti verilerek hipotalamik CCL5 sinyalinin insülin duyarlılığı ve glukoz metabolizması üzerindeki etkilerini. Bu yöntem metabolik bozukluklar için tedavi hedefleri keşfetmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Minnettarız S-Y c desteklenen Bakanlığı bilim ve teknoloji, Tayvan-MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) ve sağlık ve refah ücretli tütün ürünleri - MOHW106-TDU-B-212-144001

Not: Tüm iletişim kuralları ve yöntemleri hayvan bireylerde kullanılan kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komiteleri (IACUC), Taipei Tıp Üniversitesi tarafından onaylanmıştır (protokol numaraları: LAC-2014-0387)
1. mikro-ozmotik pompa infüzyon sistemleri hazırlanması
Not: pompa, yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) arabellek ve uyuşturucu (Met-CCL5/RANTES protein çözüm (10 ng/mL aCSF)) steril koşullarda 0.2 µm filtreleriyle filtre arabellekleri kullanarak hazırlamak ve tüm prosedürleri ile Kültür örtünün altında kuralları eldiven. Cerrahi prosedürler aşağıdaki gibi yapılır:
<ol>
	<li>Ameliyattan önce bir gün mikro ozmotik pompalar hazırlamak: beyin mikro ozmotik pompa yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) ile 1 mL şırınga ve kit ile birlikte sağlanan künt kafa iğne ile doldurun. ACSF içinde mikro ozmotik pompa bırakın ve bir shaker yerleştirin ve nazikçe gecede sallamak. Dikkat: Pompa aCSF ile doldurulmalıdır ve pompa (şekil 1A) içinde hava kabarcıkları kaçınılmalıdır.</li>
	<li>Ameliyat başlamadan önce rekombinant Met-CCL5/RANTES protein çözüm (10 ng/mL, içinde seyreltilmiş aCSF) denemede kullanılmak üzere hazırlayın. ACSF pompası kaldırmak ve aşırı sızıntıları pompa ile uyuşturucu çözüm yavaş yavaş dolduramazsınız. Not: 15 mL aCSF veya Met-CCL5/RANTES çözüm 5-8 pompalar için yeterli olur. Dikkat: pompa tamamen baloncuklar içinde olmadan uyuşturucu dolu emin olmak için yordamı yineleyin.</li>
	<li>Kateter tüpler istenilen boy kesme ve künt uçlu beyin infüzyon iğne beyin infüzyon seti ile ekleyebilirsiniz. İnfüzyon seti ve borular ile uyuşturucu doldurun.</li>
	<li>Son olarak, montaj ve beyin infüzyon seti için mikro-ozmotik pompa iliştirin. Dikkat: Hava kabarcığı yok tüp veya pompa (şekil 1A) oluşmuş olmalıdır.</li>
	<li>ACSF steril 50 mL tüp içinde pompa kurumasını önlemek için belirlenen tüm ozmotik pompa-beyinli füzyon bırakın. Ozmotik pompa-beyinli füzyon kümesi Şimdi ameliyat için kullanılmak üzere hazırdır. Not: Mikro-ozmotik pompa sistemleri uzun süreli ilaç infüzyonu için kullanılabilir. Bu ilaç dağıtım fare beyin içine güvenli ve kolay modu sağlar.</li>
</ol>
2. intraserebral ventrikül cerrahi-mikro ozmotik pompa implantasyonu
Dikkat: % 75 etanol ile cerrahi çevre Sterilize ve çalışmaya dahil insanlar steril eldiven ve temiz önlük giyiyorsun emin olun. Cerrahi alet / aletler autoclaved ve kurutulmuş kullanmadan önce ve daha sonra % 75 etanol arasında fareler ameliyatları ile sterilize edilmiş olması gerekir.
<ol>
	<li>Fare tartmak ve intra Periton enjeksiyon (IP) ketamin/Xylazine ile kullanarak anestezi (ketamin 50 mg/kg, Xylazine 10 mg/kg). Dikkat: Fareler vücut ağırlıkları 24 g alt ozmotik pompa implantasyonu ameliyatı için tavsiye edilmez.</li>
	<li>Dağ ve stereotaktik cihaz (şekil 1B) üzerine fare kafa düzeltmek.</li>
	<li>Bir çift Cerrahi makas ve kerpeten kafatası kapsayan dış deri açık kesmek için kullanın. İyot periferik kafatası temizlemek için kullanın.</li>
	<li>Derinin en dış tabakası subkutan deri boyun bölgesi yakınındaki künt kafa kerpeten ozmotik pompa-beyinli füzyon set implantasyon (şekil 1 c) için bir çift yardımı ile ayırın.</li>
	<li>İnfüzyon noktası ile referans için stereotaktik cihaz kullanarak beyin Haritası (şekil 1 d) işaretleyin. Bu deneyde, iğne 3rd ventrikül bölgede implante olması gerekiyor (Bregma: 0.0 mm lateral, 1.3 mm arka, 5.7 mm ventral).</li>
	<li>Kafatasında (şekil 1E) işaretli alanı çevresinde bir çivi matkap kullanarak bir delik. Dikkat: fare meninkslerde ve kan damarları, böylece bozulma beyindeki mikro-kan damarlarının kaçınarak kırmak dikkatli olun.</li>
	<li>ACSF (kontrol) olarak ya da ilaç (Met-CCL5/RANTES protein çözüm) beyin infüzyon iğne ilaç fare beyin ( demleyin delinmiş deliğe boyun bölgesi ve INSERT arkasındaki deri altında bulunduğu mikro ozmotik pompa-beyinli füzyon kümesi yerleştirin Rakam 1E). İğne meninkslerde nüfuz ve ventrikül almak. İğneyi yerinde yüzey desensitizing jel (şekil 1F) kullanarak kafatasında düzeltmek ve tutkal kurur kadar 1-2 dakika bekleyin. Daha sonra iğne (şekil 1G- H) üstünde çıkıntılı bölüm kesti.</li>
	<li>Bir doku yapıştırıcı tutkal işleminin başında yara iyileşmesi için kullanın. Yaranın üstüne tutkal 50 µL uygulamak, her iki cilt birlikte çekin ve 30'dur (şekil 1I) imzalamaya cilt izin için s. Dikkat: %100 alkol takımını cerrahi ve 100 ul penisilin enfeksiyonu önlemek için streptomisin ile sonra yara temizlemek için kullanın. Not: Fare cilt skar dokusu oluştururlar ve cerrahi tutkal yönetimini takiben birkaç gün içinde iyileşir. Ana tutkal cilt tahriş veya iltihap neden olabilecek cerrahi dikiş kaçınma avantajdır.</li>
	<li>Fareyi temiz bir kafeste tuttu sıcak bir tabağa yer (37 ° C'ye kadar ısıtılır) ve anestezik etkisi fare normale dönene kadar bekle. Dikkat: Bu ameliyattan sonra hayatta kalma şansını artırmak için fare vücut ısısını korumak için önemlidir.</li>
	<li>Bir haftalık iyileşme süresi sonra farelerin Oral glikoz tolerans testi (OGTT) ve insülin tolerans testi (ITT) gibi daha fazla deneyler için hazır olacak.</li>
</ol>
3. oral glukoz tolerans testi (OGTT)
Not: oral glukoz tolerans testi 7 gün sonra aCSF ve MetCCL5/RANTES (10 ng/mL, 100 µL) infüzyonu gerçekleştirin. 6 h OGTT önce fareler ile yeterli su temini için hızlı korumak. Hayvanlar işlem sırasında stresi azaltmak için çevreye parkenizin böylece nerede deneyler yapılır aynı tezgah üzerinde tutun.
<ol>
	<li>Glikoz eriyik Hazırlığı: deneme gerçekleştirmeden önce glikoz çözüm 3.75 g çözülerek 15 mL distile H2o glikoz hazırlamak</li>
	<li>Okumalar deneysel işlem sırasında (Tablo 1) kaydetmek için bir takvim kadar ayarla. Not: Saatleri arasında her kan sınav deneme sırasında kayıt doğru izin vermek için uygun aralıklarla ayarlamak önemlidir.</li>
	<li>Oruç sonra her fare tartmak ve glikoz enjekte edilir uygun miktarını hesaplamak.</li></ol>Örneğin, fareyi 30 g ağırlığında, yönetilecek glikoz çözüm miktarı 300 µL olmalıdır.
	<li>Cihazlar, work bench hazırlayın:<ol>
		<li>Şeker Ölçüm (pil durumunu denetlemek için önce test çalıştığından emin olun Başlat düğmesine basın.)</li>
		<li>Glikoz çip</li>
		<li>İnsülin şırınga (0.3 mL insülin şırınga)</li>
		<li>Jilet</li>
		<li>Zamanlayıcı</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bir kez tezgah kurmak, ölçmek ve kan şekeri düzeyini aşağıdaki gibi kaydedebilirsiniz: temiz bir koyun ve yeni glikoz yonga Şeker Ölçüm ve o sıfır olarak Başlat düğmesine basın.</li>
	<li>Boynun arka tarafından fare seçmek ve kuyruk birkaç kez inme kuyruk bölgesi yeterli kan akışını sağlamak için.</li>
	<li>Kuyruk küçük bir parça kesip bir küçük bir damla kan sıkmak yeni jilet kullanarak (yaklaşık 10-20 µL) içine glikoz küçük parça. Kan doğru ölçüm izin vermek belgili tanımlık küçük parça doldurmalıdır. Şeker Ölçüm glukoz seviyesinin hemen görüntüler. Makine "hata" gösteriyorsa, yeni bir glikoz çip ile yordamı yineleyin. Not: Sadece bir damla kan glikoz çip gerekir. Kan örneği birden çok kez toplanması gereken zaman, sadece doğrudan kan toplamak için küçük parça üzerine kuyruk sonuna tutarken parmaklarını fare kuyruk boyunca birkaç kez çalıştırarak basınç uygulayın. Kan örnekleri toplarken her zaman arka uç kesmek gerekli değildir.</li>
	<li>Ardından, fare glikoz (0, 25 g/mL) sözlü olarak intragastric gavaj tekniği kullanarak yem. Yönetilecek glikoz miktarını formül kullanılarak hesaplanan: 10 X vücut ağırlığı (BW) µL glikoz çözüm (örneğin, fare ağırlığında 30 g, yönetilecek glikoz çözüm miktarı 300 µL olması durumunda). Sayacı başlatmak hemen sonra oral glukoz yönetme.</li>
	<li>15, 30, 60, 90 ve 120 dk glikoz ölçüm yordamı yineleyin.</li>
	<li>Tüm glikoz düzeyi okuma kaydettikten sonra tıraş bıçağı atmak ve glikoz bir biohazard kap içinde yongaları. Yiyecek geri fareler kafesi koyun ve hayvan odasına getirin.</li>

4. insülin tolerans testi (ITT)
Not: İnsülin tolerans testi ve oral glukoz tolerans testi en az 7 gün arayla hayvanlar üzerinde açlık etkisini azaltmak için zamanlanması gerekir. İnsülin tolerans testi için (ITT) insan insülin (0,75 U/Kg) IP sızdırma yoluyla yönetilen.
<ol>
	<li>0,25 U insülin çözüm hazırlanması: seyreltik 100U insan insülin 1: 400 tuzlu çözüm oranı.</li>
	<li>Oruç sonra her fare tartmak ve buna göre insülin enjekte miktarı hesaplamak: IP için 0,25 U insülin hacmi (µL) enjekte = 3 X BW (0,75 U insülin/Kg vücut ağırlığı). Örneğin: 28,8 g ağırlığında bir fare için enjekte: 28,8 X 3 = 86,4 µL (0,25 seyreltilmiş U insülin) (Tablo 2). Dikkat: 6 farklı günlerde oruç h sonra farklı vücut ağırlıkları aynı hayvanlar olabilir. Böylece, önce ve sonra oruç ve OGTT ve ITT test kuralları vücut ağırlığı ölçmek gereklidir. Fare vücut ağırlığı tür, cinsiyet ve açlık süresi bağlı olarak bırakın. Daha yüksek dozlarda insülin, insülin şok neden olabilir ve hayvanın ölümüne yol açacak.</li>
	<li>Okuma sırasında deneysel bir işlem kaydetmek için bir tablo (Tablo 2) ayarlayın. 3.4 adımları yineleyin. 3.8 için. Ölçüm kan şekeri düzeyleri için.</li>
</ol>

<ol><li>Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines%2Fintercrines+and+central+regulation+of+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chemokines/intercrines and central regulation of feeding.</a> Am J Physiol. 266, R1711-R1715 (1994).</li>
<li>Milanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+hypothalamic+inflammation+reverses+diet-induced+insulin+resistance+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver.</a> Diabetes. 61, 1455-1462 (2012).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+hypothalamic+inflammation+associated+with+the+susceptibility+to+obesity+in+rats+exposed+to+high-fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+diabetes+research%22%5BJournal%5D)">Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet.</a> Experimental diabetes research. 2012, 847246(2012).</li>
<li>Benomar, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+and+leptin+induce+Glut4+plasma+membrane+translocation+and+glucose+uptake+in+a+human+neuronal+cell+line+by+a+phosphatidylinositol+3-kinase-+dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Insulin and leptin induce Glut4 plasma membrane translocation and glucose uptake in a human neuronal cell line by a phosphatidylinositol 3-kinase- dependent mechanism.</a> Endocrinology. 147, 2550-2556 (2006).</li>
<li>Gual, P., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulation+of+insulin+signaling+through+IRS-1+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulation of insulin signaling through IRS-1 phosphorylation.</a> Biochimie. 87, 99-109 (2005).</li>
<li>Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+due+to+phosphorylation+of+insulin+receptor+substrate-1+at+serine+302%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302.</a> The Journal of biological chemistry. 279, 35298-35305 (2004).</li>
<li>Boura-Halfon, S., Zick, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+IRS+proteins%2C+insulin+action%2C+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Endocrinology+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of IRS proteins, insulin action, and insulin resistance.</a> American journal of physiology. Endocrinology and metabolism. 296, E581-E591 (2009).</li>
<li>Chou, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL5%2FRANTES+contributes+to+hypothalamic+insulin+signaling+for+systemic+insulin+responsiveness+through+CCR5%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5.</a> Sci Rep. 6, 37659(2016).</li>
<li>Calegari, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+of+the+hypothalamus+leads+to+defective+pancreatic+islet+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inflammation of the hypothalamus leads to defective pancreatic islet function.</a> J Biol Chem. 286, 12870-12880 (2011).</li>
<li>Mighiu, P. I., Filippi, B. M., Lam, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+inflammation+to+the+brain-liver+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Linking inflammation to the brain-liver axis.</a> Diabetes. 61, 1350-1352 (2012).</li>
<li>Tavares, E., Minano, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANTES%3A+a+new+prostaglandin+dependent+endogenous+pyrogen+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">RANTES: a new prostaglandin dependent endogenous pyrogen in the rat.</a> Neuropharmacology. 39, 2505-2513 (2000).</li>
<li>Appay, V., Rowland-Jones, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANTES%3A+a+versatile+and+controversial+chemokine%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">RANTES: a versatile and controversial chemokine.</a> Trends in immunology. 22, 83-87 (2001).</li>
<li>DeVos, S. L., Miller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+intraventricular+delivery+of+drugs+to+the+rodent+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system.</a> J Vis Exp. , e50326(2013).</li>
<li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Admission+blood+glucose+and+in-hospital+clinical+outcome+among+patients+with+acute+stroke+in+Inner+Mongolia%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Invest+Med%22%5BJournal%5D)">Admission blood glucose and in-hospital clinical outcome among patients with acute stroke in Inner Mongolia, China.</a> Clin Invest Med. 32, E151-E157 (2009).</li>
<li>Olsen, T. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19271949">Blood glucose in acute stroke.</a> Expert Rev Neurother. 9, 409-419 (2009).</li>
<li>De Jong, W. H., Borm, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+and+nanoparticles%3Aapplications+and+hazards%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Drug delivery and nanoparticles:applications and hazards.</a> Int J Nanomedicine. 3, 133-149 (2008).</li>
<li>Kitade, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR5+plays+a+critical+role+in+obesity-induced+adipose+tissue+inflammation+and+insulin+resistance+by+regulating+both+macrophage+recruitment+and+M1%2FM2+status%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status.</a> Diabetes. 61, 1680-1690 (2012).</li>
<li>Kennedy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CCR5+results+in+glucose+intolerance+in+diet-induced+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 305, E897-E906 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Kronik inflamasyon ve CCL5 ve onun reseptör-gibi ilgili kemokinler mekanizmasının CCR5 tip-2 diyabet gelişiminde belirsizdir. Kronik inflamasyon makrofaj infiltrasyonu yağ dokuları içine neden olur ve adipokines Yönetmeliği etkiler; Bu arada, aynı zamanda β-hücreleri çekiyor ve insülin salgılanması adacıkları of Langerhans kan şekeri yanıt olarak gelen bozar. Beyindeki hipotalamus iştah, periferik kan glikoz metabolizması ve insülin yanıt düzenlenmesinde sistemik periferik dokularda insülin ve adipokine sinyalleri yönetiminde bir kontrol merkezi olarak önemli bir rol oynar. Birçok çalışma da hipotalamik iltihap enerji homeostasis gibi arızalı pankreas adacık ve karaciğer fonksiyon2,3,9,10kusurlu düzenlenmesi için yol gösterir. CCL5 beyindeki hipotalamus11,12gıda alımı ve vücut sıcaklık regülasyonu katkıda bulunur; Ancak, hipotalamik ve sistemik insülin sinyal için CCL5 korelasyon belli değildir. Bir CCL5 tüm vücut nakavt fare (CCL5- / -) daha yüksek insülin seviyeleri ve yüksek kan şekeri düzeyleri ile bir insülin direnci fenotip kan8' gösterir bu soru adresi üretti. Ancak, T2DM fenotip geliştirmek için uzun zaman gerektirir ve rol ve CCL5 mekanizma olası uzun vadeli telafi edici etkileri nedeniyle hipotalamik insülin sinyalinde araştırmak zordur. Bu nedenle, hipotalamik nöronlarda sinyal doğrudan manipülasyonu CCL5 en iyi yaklaşımdır. Var, ancak, hipotalamik bölge neurons birden çok tür ve oldukça pahalı ve zaman alıcı hücre belirli nakavt fareler oluşturmak. Bir ICV kullanan infüzyon sistemi böylece zamandan tasarruf ve olası çevresel iltihabi reaksiyonlar atlayarak CCL5 işlevi doğrudan beyindeki işlemek için daha açık bir yaklaşım sağlayın.
Ozmotik pompalar kullanan çalışmalar zaten daha önce büyük örnekler ve gösteriler teknikleri kemirgenler13' te ozmotik pompalar implantasyonu dahil sağlayan yayınlanmıştır. Ancak, bu iletişim kuralları çalışma aşağıdaki sırada birkaç zorlukla karşılaştı. İlk olarak, bazı iletişim kuralında kullanılan ekipman oldukça pahalı, çizim ve fare beyin, fare vücut ısısı ve 3) oksijen isoflurane korumak için 2) termo sistemi içine iğne ekleme konuma ulaşmak için 1) elektrik sistemi dahil Anestezi fareler için yönetmek için sistem kaynağı. İkinci olarak, diğer makalelerinde açıklanan teknikleri biz sadece bizim çalışma için hayvanların vücut ağırlıkları ve belirli yaş küçük bir aralık içinde kullanmak başardık çünkü çoğaltmak zordu. Daha büyük fareler cerrahi ve implantasyon için daha uygun olduğu. Ancak, bizim çalışmada, daha genç ve daha küçük fareler kilolu ve insülin ve kan glikoz yönetmelik yaşlanma etkileri önlemek için kullandık: 25 ± 2 g ve yaş erkek fare ile vücut ağırlığı sadece yaklaşık 2 ay eski çalışma odasında seçilmiştir. Böylece, ameliyat ve yara fare kafasına dikiş zordur. Üçüncü olarak, inflamatuar yanıt bir inflamatuar sitokin bu çalışmada hedef olduğu için ameliyattan sonra en aza vardır. Fare ve sıçanlar dikiş çıkarın ve açık yaralar kolayca iltihap neden ve Kemokin reaksiyonlar artışı ameliyattan sonra. Bu nedenle, bir strateji konumu ulaşmak ve çizmek ve iğne ikincil enfeksiyonu önler fare beyin eklemek için gereklidir. Bu nedenle, bu tekniği maliyet etkin, daha kolay ve daha az aşağıdaki paragrafta açıklandığı gibi hayvanlar için zararlı hale getirmek için yukarıda açıklanan iletişim kuralları değiştiren.
İlk olarak, biz el ile bir kafatası üzerinde işaretlenmiş hedef alan çevresinde 2.6 adımda anlatıldığı gibi delik için bir çivi matkap kullanılır. Bu yöntem, uygun maliyetli ve fare meninkslerde ve kan damarları zarar görmesini önlemek için tüm yordamı izlemek için bize izin verir. Kan glikoz yönetmelik akut inme, beyin kanaması gibi sonra bozulmuş. Akut hiperglisemi ve şeker hastalığı benzeri sendromlar da klinik ayarları14,15vuruş sonra tespit edildi. Benzer şekilde, ayrıca bozulmuş glikoz düzeyi ve insülin yanıt kanama ve irin ile farelerde beyin bulduk. Biz daha iyi kontrol el kitabı tabanlı cerrahi sonuçları tutarlılığını sağlamak için gerekli farkındayız. İkinci olarak, biz yeni geliştirilmiş bir tıbbi biomaterial cilt mühür için klinikler, doku yapıştırıcı tutkal (Adım 2.8), yaygın olarak kullanılan fare kafasına ameliyatı takiben, bu nedenle, dikiş kaçınarak ve iyileşme hızı hızlandırılması kullandı. Bu cerrahi işlemler gerçekleştirmek kolaylaştırır ve ikincil iltihap riskini azaltır. Üçüncü olarak, hangi fareler için hayatta kalma şansını artırır ve intraperitoneally enjekte anestezik ilaç dozu düşürür nispeten daha kısa, tüm cerrahi işlem gerçekleştirmek için gereken zamanı geldi. Biz yüksek sağkalım oranı (% 95) gözlenen ve değiştirilmiş bu iletişim kuralı takip ederek nispeten doğru sonuçlar elde.
Bu teknik oldukça kısa süre ilaç dağıtım kısıtlamasıdır. Her ne kadar beyin, bizim çalışma sadece yeniden açılması periferik sistemik insülin sinyal düzenleyen beyin inflamatuar Kemokin etkisi üzerinde duruluyor olmadan bir ozmotik pompa fare vücuda alternatif olarak yerleştirilebilir. Ek cerrahi periferik dokularda muhtemelen sonra inflamatuar Kemokin ifade artırmak ve sonuçları etkileyebilecek periferik dokularda iltihabi bir tepki neden. İkinci olarak, ilaç half-life de çalışma süresini sınırlar. Kemokin gibi rekombinant proteinler genellikle aynı zamanda beyin ve kısa vadede sinyal engelleme CCL5 etkisini incelemek için bize izin verir ama hangi faaliyete zaman içinde kaybeder bir daha kısa yarılanma ömrü var. Önceki çalışmalarımız da uzun vadeli etkileri8ile bir modelini sağlayan bir CCL5 nakavt fare oluşturmak için bir genetik değişiklik yaklaşım anlatmıştık.
Bazı yeni teknikleri ve uyuşturucu beyine sunmak için alternatif yöntemler vardır. Nanoteknoloji olan merkezi sinir sistemi uyuşturucu dağıtmak için kullanılan güçlü bir tekniktir. Ancak, birçok ilaç thermosensitive ve onları nano tanecikleri16paketlemek çalışırken yok edilebilir. Buna ek olarak, nano tanecikleri BBB geçmek ve siRNA veya en yaygın uyuşturucu için uygun olan hücreler tarafından uptaken olabilir, ama ligand-reseptör bağlamak için ideal bir yöntem değildir.CCL5 etkisi8, almaya hipotalamus ARC nöronlar içinde onun reseptör CCR5, bağlama gerektirir ve CCL5 antagonisti MetCCL5 nöronlar nano tanecikleri ile içine teslimini yeteneği bağlamak ve CCR5 hücre block kaybına neden olabilir yüzey.
Kan şekeri düzeyini önemli ölçüde daha yüksek oral glukoz tolerans testi CCL5-antagonist MetCCL5 denetimleri (aCSF ile yönetilen fareler) karşılaştırıldığında ile yönetilen farelerde. Ek insülin Yönetim (insülin tolerans testi) da fareler (şekil 4B), alma endojen ve dış insülin kan şekeri düzeylerini azaltmak olamaz öneriyor kan şekeri düzeyini MetCCL5 içinde alt edemedi hipotalamik CCL5 sinyal engelleme zaman. Fareler üzerindeki CCL5 etkinliği olmayan insülin dayanıklı oldu. Artan serine302 fosforilasyon IRS-1 Met-CCL5 aCSF (şekil 5A-B) alma kontrol fareler için karşılaştırıldığında alma farelerde bulundu. Serin 302 fosforilasyon IRS-1 IRS-1 bir fiziksel ayrışma insülin direnci6önemli bir nedeni insülin reseptör üzerinden neden olduğu gösterilmiştir; insülin PI3K-Akt yolu gibi aşağı akım sinyalleri etkinleştirmek değiştiremiyor. Bir ex vivo insülin stimülasyon çalışma aşağı akım sinyal molekülü Akt (p-AktS473) fare hipotalamik dokusunda insülin tarafından etkinleştirilemedi insülin Met-CCL5 ile infüzyon ve bunun yerine, serin 302 fosforilasyon arttı doğruladı. Özet olarak, fizyolojik veri (OGTT ve ITT) ve moleküler çalışma hipotalamik CCL5 sinyal sistematik insülin direnci ve glikoz metabolizması için katkıda hipotalamik insülin sinyal yönetmelik aracılık eder göstermektedir.
Rol ve CCL5 ve CCR5 mekanizmasının diyabet obezite ile ilişkili kalır belirsiz. Kitade vd CCR5 eksikliği obezite kaynaklı iltihabı, makrofaj işe alım ve insülin direnci17fare korumalı bildirdi. Ancak, diğer çalışmalar Kennedy ve ark. tarafından ters sonuçlar CCR5 eksikliği sistemik glukoz tolerans yanı sıra adipocyte ve kas insülin18sinyal bozar gösteren bulundu. Her iki çalışmaları tüm vücut kronik inflamasyon ve telafi edici yanıt yol açan obezite ikna etmek için bir yüksek yağlı diyet uygulanır. Bu çalışmalar insülin yönetmelik sinyal temiz ve berrak mekanizmalar CCL5 ve CCR5 sağlamadı. Öte yandan, ozmotik Pompa Teknik bir beyin belirli infüzyon sağlar ve telafi edici yanıt zaman-mahdut teslimat ile önler.
Sonuç olarak, ozmotik pompa beyin infüzyon sistemi ile "eski moda" bir tekniği gibi görünüyor olsa da, daha ucuz, daha kolay ve daha az zararlı ilaç dağıtım yöntemi sağlamamaktadır ve yardımcı olur araştırmak ligand-reseptör içinde sinyal işlevi beyin.

İnsülin doku beyin de dahil olmak üzere çok çeşitli etkiler. İnsülin kan - beyin bariyerini geçer, merkezi sinir sistemi (MSS) girer ve insülin reseptör (IR) ile hipotalamus gıda alımı, sempatik aktivite ve periferik insülin yanıt düzenleyen bağlar. Periferik yağ dokularında kronik inflamasyon 2 diabetes mellitus (T2DM) yazmak için katkıda bulunmak için teklif edildi ama bu inflamatuar reaksiyonları insülin etkilemesi hipotalamus sistemik insülin yanıt ve glukoz intoleransı arabuluculuk sinyalleri belirsizdir. Bazı kemokinler iştah düzenlemesi ve vücut sıcaklık regülasyonu gibi tümör nekrozis faktör-alfa (TNFα), İnterlökin (Il) -6, IL-1β, hipotalamus1 katılmak monosit chemoattractant protein-1 (MCP-1) ve CCL5 (C-C motifi ligand 5 ). Buna ek olarak, hipotalamus iltihabı insülin direnci T2DM2,3yol açar.
Bu kemokinler, Kemokin CCL5 düzeyde ifade değişiklik ve onun reseptör arasında CCR5, içinde yağ doku T2DM damar sertliği ve glikoz intoleransı insanlar hem de hayvanlar ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. CCL5 aynı zamanda gıda alımı ve vücut sıcaklığı, düzenlenmesi hipotalamus dahil nöroendokrin işlevleri vardır. Böylece CCL5 hipotalamus veya periferik dokularda insülin sinyal harekete geçirmek katılan olup olmadığını araştırmak önemlidir.
İnsülin sinyal hücrelerde sıkı bir şekilde düzenlenir. İnsülin-insülin reseptörleri (IR) bağlama insülin reseptör substrat (IRS) proteinler, ardından phosphatidylinositol 3-kinaz (PI3K) ve protein kinaz B (PKB/AKT) etkinleştirme ve glukoz taşıyıcı-4 (GLUT4) membran translocation4 etkinleştirir . IRS proteinlerdir bu sinyal yolu anahtar düzenleyiciler: onlar-si olmak yanıt pozitif olarak fosforile birden çok tirozin ve serin artıkları veya negatif insülin sinyalleri5. Örneğin, serin 302 fosforilasyon IRS-1 IRS-1 fiziksel ayrışma için IR yol ve insülin sinyal iletimi, insülin direnci6için önde gelen blok. IRS proteinler üzerindeki aktivite bozukluğu insülin direnci ve glikoz intoleransı fareler7neden olduğu gösterilmiştir.
Belirli bir gen işlevini incelemek için bir ortak organizmanın tüm vücutta dağıtılan hedef genlerin ifade manipülasyon yoludur. Ancak, bu çeşitli sakıncaları olabilir: 1) o zaman içinde farklı geribildirim Düzenleyici veya telafi edici etkileri üretebilir ve 2) bu yöntem bize belirli beyin bölgeleri hedef protein rolünü göstermek yardımcı olmuyor. Ayrıca, doku ve hücre özel gen nakavt hayvan üremek için uzun zaman alabilir ve yüksek maliyetlidir. Böylece, bir kısa vadeli beyin infüzyon ozmotik pompa sistemi - bahsedilen sorunların üstesinden gelmek için antagonist ilaç kullanarak beyin hedef protein sinyal ile müdahale için nispeten hızlı ve uygun bir yol kullanın. Stereotaksik enjeksiyonları karmaşık cerrahi beceri ve geniş yatırım araçları ve zaman gerektirir için kullanılır. Bu protokol için biz stereotaksik enjeksiyon ve kan glukoz konsantrasyonu algılamak ve hipotalamik insülin yönetmelik sinyal CCL5 rolünde araştırmak için hızlı, daha az zararlı ve anlık yöntemi gerçekleştirmek için basit ve güvenli bir yöntem sağlar.

<table><tbody><tr><td>Vetbond Doku Yapıştırıcısı</td><td>3M</td><td>#1049SB</td><td>Fare kafasındaki lezyon bölgesini kapatmak için kullanılan yapıştırıcı</td></tr><tr><td>LOCTITE 454 anında yapıştırıcı</td><td>Durect Corporation</td><td>#8670</td><td>İğneyi fare kafatasına sabitlemek için kullanılan yapıştırıcı</td></tr><tr><td>Alzet Mikro-Ozmotik Pompa</td><td>Durect Corporation</td><td>#9922</td><td>0.11 &; Saatte l, 28 gün</td></tr><tr><td>Beyin infüzyon sistemi</td><td>Durect Corporation</td> <td># 8851</td><td>1-3 mm, ilacı farelerin beynine perfüze etmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Glukometre</td><td>Roche</td> <td># 06870244001</td><td>Kan şekeri seviyesini ölçmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Glikoz çipi</td><td>Roche</td> <td># 06454011020</td><td>Kan örneğini yüklemek için kullanılır</td></tr><tr><td>Evan'ın mavi Sigma'sı</td><td></td><td>#MKBK0523V</td><td>İlaç infüzyonunu göstermek için alan</td></tr><tr><td>İnsülin şırıngası</td><td>Becton, Dickinson and Company</td> <td># 3232145 C</td><td>İnsülini intraperitoneal olarak uygulamak için kullanılır</td></tr><tr><td>MIO NE116 KONTROL ÜNİTESİ (tırnak matkabı)</td><td>Mio System</td><td>#E235-015</td><td>Farenin kafatasında bir delik açmak için</td></tr><tr><td>CCL5/Met-RANTES Protein R</td><td>& D</td><td>#ADB0111081</td><td>Rekombinant İnsan CCL5, E-coli'den türetilmiş</td></tr><tr><td>aCSF formülü</td><td>119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glikoz</td><td></td><td>Filtre ile sterilize edin 0.22 &mu; m filtre aparatı ve 4 ° C. 'da saklayın aCSF 3-4 hafta stabildir</td></tr><tr><td>Fosfo-IRS-1 Serine302 antikoru</td><td>Hücre Sinyali</td><td>#12879</td><td>1:1000 seyreltme</td></tr><tr><td>IRS-1 (D23G12) antikoru</td><td>Hücre Sinyali</td><td>#12879</td><td>1:1000 seyreltme</td></tr><tr><td>Fosfo-Akt Serin 473 antikoru</td><td>Hücre Sinyali</td><td>#9916</td><td>1:2000 seyreltme</td></tr><tr><td>Akt (pan) (C67E7) antikoru</td><td>Hücre Sinyali</td><td>#9916</td><td>1:1000 seyreltme</td></tr><tr><td>Hayvanlar: C57BL/6</td><td>NAR Labs</td><td></td><td>Çalışmada kullanılan vahşi tip fare türü</td></tr></tbody></table>

hipotalamik insülin sinyal fare beyin içine sürekli uyuşturucu infüzyon sistemi ile periferik glikoz intoleransı için eğitim

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

İnsülin hipotalamus ve periferik insülin yanıt sistematik metabolizmasını düzenleyen. İnflamatuar reaksiyon periferik yağ dokularında tip 2 diabetes mellitus (T2DM) geliştirme ve iştah yönetmelik üzerindeki katkıda bulunur. Kemokin CCL5 ve C-C Kemokin reseptör tip 5 (CCR5) düzeyleri tip 2 diabetes mellitus (T2DM) damar sertliği ve glikoz intoleransı arabuluculuk önerdi. Buna ek olarak, CCL5 bir nöroendokrin rol içinde hipotalamus gıda alımı ve vücut sıcaklığı, böylece, düzenleyen tarafından bize hipotalamik insülin sinyal de onun işlevi ve periferik glikoz metabolizmasının araştırmak için isteyen oynar.
Mikro-ozmotik pompa beyin infüzyon sistemi CCL5 işlevi değiştirmek ve etkisi beyin çalışma için hızlı ve hassas bir yoludur. Ayrıca bir transgenik nakavt hayvan üreten uygun alternatif bir yaklaşım sağlar. Bu sistemde CCL5 sinyal bir mikro-ozmotik pompa kullanarak intracerebroventricular (ICV) infüzyonu kendi antagonisti, MetCCL5, tarafından engellendi. Periferik glikoz metabolizması ve insülin yanıt Oral glikoz tolerans testi (OGTT) ve insülin tolerans testi (ITT) tarafından tespit edildi. Etkinlik sinyal insülin sonra Doku örneklerinden hayvanlardan elde edilen protein leke tarafından analiz edildi.
7-14 gün sonra MetCCL5 infüzyon, glikoz metabolizması ve insülin yanıt farelerde, ITT ve OGTT sonuçlarına görüldüğü gibi Engelli. IRS-1 serine302 fosforilasyon yükseltilmiştir ve Akt faaliyet CCL5 inhibisyon takip fareler hipotalamik nöronlarda düşürüldü. Özet olarak, bizim veri CCL5 fare beynindeki engelleme IRS-1 S302 fosforilasyon artırır ve hipotalamik insülin sinyal, glikoz bozulma yanı sıra periferik dokularda insülin işlevinde azalma önde gelen kesmeleri öneririm metabolizma.

Denetim veya (CCL5 etkileri beyin engellemek için) CCL5 antagonisti MetCCL5 olarak her iki aCSF içeren ozmotik infüzyon pompa cerrahi takılan fareler üzerinde yapılmıştır. Ameliyat sonrası 7 ila 14 gün periferik glukoz ve insülin yanıt farelerin OGTT (7 gün sonra) ve ITT (14 gün sonra) iletişim kuralında belirtildiği gibi kullanarak analiz edildi. Oral glukoz tolerans testi (OGTT) ve insülin tolerans testi (ITT) farelerin oruç 6 saat sonra yapıldı. Fareler glikoz ile sözlü, onların anılan sıraya göre vücut ağırlıkları üzerinde temel alan tutarı ile yönetilen. Şekil 3' te gösterildiği gibi kan şekeri düzeyleri değişiklikleri kaydedildi. İnsülin duyarlılık testi fareler içine mayi (IP) insülin enjeksiyon tarafından gerçekleştirilmiş ve kan şekeri düzeyini Değiştir hemen ölçüldü. Şekil 4' te gösterildiği gibi kan şekeri düzeyleri insülin stimülasyon farklı infüzyon ilaçlarla farelerde üzerine değişiklikler kaydedildi. Kan glikoz düzeyi sadece biraz glikoz Yönetim (şekil 3B) ve insülin enjeksiyon (şekil 4B) farelerde aCSF infüzyon ile fareler karşılaştırıldığında CCL5 antagonisti (MetCCL5) infüzyon ile sonra düşürüldü. Bu sonuçlar ile MetCCL5 beyinde yönetilen insülin işlevini farelerde periferik glikoz metabolizması bozuklukları öneririz.
Daha sonra analiz ettik insülin sinyal aktivasyonu IRS-1 fosforilasyon ve Akt harekete geçirmek düzeyleri hipotalamik dokularda değerlendirerek. 302 üzerinde serin fosforilasyonu IRS-1'in upregulated antagonisti (MetCCL5) ile tedavi farelerde yapıldı (şekil 5B-C) ne zaman fare beslenen normalde. Kontrol grubunda aCSF fareler hipotalamus idare ve insülin meydan aşağı akım sinyal molekülü Akt (fosforile Akt serin 473) aktif (şekil 5 d, F) artan IRS-1 serine302 harekete geçirmek () olmadan Şekil 5 d -E) ve Akt serine473 fosforilasyon. Buna ek olarak, Akt sinyal MetCCL5 ile infüzyon farelerde artmış değil, ama bunun yerine IRS-1 serin 302 fosforilasyon bir artış oldu. Bu arada, fare beynindeki CCL5 sinyali engelliyor insülin aktivitesi hipotalamus ve zayıflatmak periferik insülin fonksiyon kesildi. Bizim genel bulgular, ITT, OGTT ve ex vivo insülin meydan, sonuçlarından gibi gelen CCL5 üzerindeki insülin sinyal harekete geçirmek ve periferik glikoz metabolizması insülin stimülasyon üzerine yaptığı katkının sonucuna vardı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig1.jpg"> 
Şekil 1. Ozmotik pompa hazırlık ve implantasyon cerrahi prosedürde fare. Uyuşturucu Çözümle periosteum (A) beyin infüzyon seti ve pompa hazırlık. Kırmızı oklar, sıvı kristal ile kateter tüpler gösterir. (B) düzeltmesi ve mount stereotaktik cihaz üzerine fare kafa. (C) ayrı mikro ozmotik pompa-beyinli infüzyon seti implantasyonu için subkutan deri derinin en dış katmanı; Dash çizgiler ozmotik pompa implantlar konumunu gösterir. (D) oku infüzyon yan gösterir. (E) matkap kafatası üzerinde işaretli çevresinde bir delik. (F) yer ozmotik pompa-beyinli infüzyon fare arkasına ayarla ve beyin infüzyon iğne delinmiş deliğe (Daire içinde çizgi) ekleyin. (G) doku yapıştırıcı tutkal kullanarak kafatası üzerine iğne düzeltmek ve (H) gösterildiği gibi (sivri uçlu makas G) iğne üst ayır. (ben) mühür yara kullanarak doku yapıştırıcı tutkal. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig2.jpg"> 
Şekil 2. İlaç ozmotik pompa kullanarak ventrikül bölgede yönetilen zaman uyuşturucu Difüzyon alanında temsilcisi görüntüler. Evan'ın mavi ozmotik pompa uyuşturucu infüzyon illüstrasyon ventrikül bölgeye(a)ve (B) yan ve üçüncü ventrikül içine Difüzyon kullanılan temsilcisi ilaçtır. Ölçek çubuğu 0.5 cm. = <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig3.jpg"> 
Şekil 3. Oral glukoz tolerans testi (OGTT) tarafından ölçülen ameliyattan sonra farelerin glikoz metabolizması. Kan şekeri düzeyleri dağılımı değiştirildi glikoz WT farelerde sözlü yönetim infüzyon aCSF(a)ve antagonisti, MCCL5 ile aşağıdaki (B). Ortalama ± SE. (şekil8değişiklik) olarak gösterilen veriler. * p &lt; 0,05, iki yönlü ANOVA tarafından. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig4.jpg"> 
Şekil 4. İnsülin fareler kan glikoz - insülin tolerans testi (ITT) işlevinde. Kan şekeri düzeyleri dağılımı değiştirildi insülin enjeksiyon aCSF(a)ile infüzyon WT farelerde takip ve antagonisti ile MCCL5 infüzyon (B). Ortalama ± SE (şekil8değişiklik) olarak sunulan veri. p &lt; 0,001, iki yönlü ANOVA tarafından. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig5.jpg"> 
Şekil 5. İnsülin sinyal etkinliğinde ameliyat sonrası fareler. (A)şeklinde inhibitör serin 302 fosforilasyon IRS-1 (insülin yanıt substrat-1, pIRS1S302) fareler hipotalamus dokularda Western Blot tedavi aCSF veya CCL5 antagonisti, MetCCL5 ile (MCCL5) infüzyon pompası. (B) fosfor-IRS-1S302 normal beslenme ile fareler hipotalamus infüzyon sonra ilgili düzeyde.(C) IRS-1 ve Akt etkinleştirme (fosfor-Akt S473, pAktS473) veya aCSF veya METCCL5 infüzyon sonra hipotalamik dokusunda insülin stimülasyon olmadan S302 fosforilasyon Western Blot. (D-E) PIRS-1S302, pS6KT421ve pAktS473göreli düzeyde. ("2" yapılan her çubuk grafik açılımı: n = 2 tüm quantifications için). (5D-E, boş barlarda yaptı: insülin; 5D-E, şeritler barlarda sağ: insülin ile). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#</td>
			<td>Fare kimliği</td>
			<td>Vücut</td>
			<td>Glikoz</td>
			<td>Başlat</td>
			<td>0</td>
			<td>15</td>
			<td>30</td>
			<td>60</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ağırlık</td>
			<td>μl 10xBW =</td>
			<td>zaman</td>
			<td>ortaçağ halk ozanı</td>
			<td>ortaçağ halk ozanı</td>
			<td>ortaçağ halk ozanı</td>
			<td>ortaçağ halk ozanı</td>
			<td>ortaçağ halk ozanı</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>501</td>
			<td>25,8 g</td>
			<td>258</td>
			<td>9:00</td>
			<td>9:00</td>
			<td>9:00</td>
			<td>9:15</td>
			<td>9:30</td>
			<td>10:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>502</td>
			<td>25.3g</td>
			<td>253</td>
			<td>9:07</td>
			<td>9:07</td>
			<td>9:07</td>
			<td>9:22</td>
			<td>9:37</td>
			<td>10:07</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1. Oral glikoz tolerans testi (OGTT) kayıt için takvim
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#</td>
			<td>Fare kimliği</td>
			<td>Vücut</td>
			<td>İnsülin 0,25 IU</td>
			<td>Başlat</td>
			<td>0</td>
			<td>15</td>
			<td>30</td>
			<td>60</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ağırlık</td>
			<td>μl 3xBW =</td>
			<td>zaman</td>
			<td>ortaçağ halk ozanı</td>
			<td>ortaçağ halk ozanı</td>
			<td>ortaçağ halk ozanı</td>
			<td>ortaçağ halk ozanı</td>
			<td>ortaçağ halk ozanı</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>501</td>
			<td>28,8 g</td>
			<td>86,4</td>
			<td>9:00</td>
			<td>9:00</td>
			<td>9:15</td>
			<td>9:30</td>
			<td>10:00</td>
			<td>10:30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>502</td>
			<td>25.3g</td>
			<td>75.9</td>
			<td>9:07</td>
			<td>9:07</td>
			<td>9:22</td>
			<td>9:37</td>
			<td>10:07</td>
			<td>10:37</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 2. İnsülin tolerans testi (ITT) kayıt için takvim

Bu iletişim kuralı bir antagonisti, MetCCL5, bir mikro-ozmotik pompa beyin infüzyon sistemi kullanarak fare beyin içine sunarak Kemokin (C-C motifi) ligand 5 (CCL5) üzerindeki rolünü inceliyor. CCL5 faaliyet geçici bu inhibisyon sinyal, glukoz intoleransı ve periferik sistemik insülin duyarlılık için lider hipotalamik insülin kesildi.

Hipotalamik insülin sinyal fare beyin içine sürekli uyuşturucu infüzyon sistemi ile periferik glikoz intoleransı için eğitim

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

Bu deneyin genel amacı, hipotalamik C-C-L-5 sinyalinin periferik sistemdeki insülin fonksiyonundaki rolünü ve C-C-L-5 sinyalini manipüle ederek C-C-L-5 sinyalini manipüle ederek araştırmaktır. Bu ilaç, vücut glikoz metabolizmasını ve beyindeki insülin yanıtını kontrol etmede kemokin C-C-L-5 gibi biyokimyasal fizyoloji alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu ölçümün ana avantajı, deneycinin beyindeki belirli sinyalleri, buradaki C-C-L-5 gibi, telafi edici bir etki veya bozukluk geliştirmeden, genellikle kemirgenlerde genetik manipülasyon yaptığımızda olan bir süre için kolayca manipüle edebilmesidir.Mikro-ozmotik pompanın yerleştirilmesi ve kan insülin ve glukoz seviyesinin doğru ölçümü beceri ve hassasiyet gerektirdiğinden bu prosedürün görsel olarak gösterilmesi önemlidir. Ameliyattan bir gün önce, bir mililitrelik şırınga ve künt başlı iğne kullanarak beyin mikro-ozmotik pompalarını hazırlayın ve pompaları yapay beyin omurilik sıvısı veya ACSF ile doldurun. Ardından, pompayı ACSF'ye daldırın ve gece boyunca nazikçe sallamak için bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin.Ertesi gün, ACSF'yi pompadan çıkarın ve fazlalık dışarı sızana kadar ACSF içinde seyreltilmiş önceden hazırlanmış ilaç solüsyonu ile tamamen doldurun. Ardından, kateter tüplerini istenen uzunlukta kesmek için cerrahi makas kullanın. Künt uçlu bir beyin infüzyon iğnesi kullanarak, tüpleri beyin infüzyon kitine takın.Ardından, infüzyon kitindeki tüpleri ilaç çözeltisi ile doldurun. Kiti monte ettikten sonra mikro ozmotik pompaya takın. Son olarak, pompanın kurumasını önlemek için, ozmotik pompa beyin infüzyon ayarını sterilize edilmiş 50 mililitrelik bir tüp içinde ACSF'ye daldırın.Ameliyatı başlatmak için, anestezi uygulanmış bir farenin kafasını stereotaktik bir aparata monte edin ve sabitleyin. Bir çift cerrahi makas ve kerpeten kullanarak kafatasını kaplayan dış deriyi kesin. Ardından, periferik kafatasını temizlemek için iyot kullanın.Daha sonra, ozmotik pompa beyin füzyon seti implantasyonu için cildin en dış tabakasını deri altı deriden ayırmak için boyun bölgesine yakın bir çift künt başlı makas kullanın. İnfüzyon noktasını beyin haritasına referans olarak işaretlemek için stereotaktik cihazı kullanın. Kafatasında işaretli alanın etrafında bir delik açmak için bir tırnak matkabı kullanın, fare meninkslerini ve kan damarlarını kırmamaya dikkat edin.Daha sonra ilgilenilen ilacın veya kontrol olarak A-C-S-F'nin bulunduğu mikro-ozmotik pompa beyin füzyon setini boyun bölgesinin arkasındaki cilt altına yerleştirin. İlacın beyne infüze edilmesi için, beyin infüzyon iğnesini açılan deliğe sokun. İğneyi kafatasının üzerine sabitlemek için yüzey hassasiyet giderici jel kullanın ve yapıştırıcı kuruyana kadar bekleyin.İğnenin üstündeki çıkıntılı parçayı kesin. Glikoz tolerans testine başlamadan önce, 3.75 gram glikoz ve 15 mililitre damıtılmış suyu çözerek glikoz çözeltisini hazırlayın. Deney sırasında okumaları kaydetmek için her kan muayenesi arasında uygun aralıklarla bir zaman çizelgesi oluşturun.Daha sonra, enjeksiyon için uygun glikoz miktarını hesaplamak için oruç tuttuktan sonra her bir fareyi tartın. Daha sonra çalışma tezgahında bir zamanlayıcı, glikoz çipi, şeker ölçüm cihazı, insülin şırıngası ve tıraş bıçağı hazırlayın. Kan şekeri seviyesini ölçmek için önce şeker ölçüm cihazına yeni bir glikoz çipi yerleştirin ve sıfırı ayarlamak için başlat düğmesine basın.Ardından, fareyi boynunun arkasından alın ve yeterli kan akışını sağlamak için kuyruğunu okşayın. Kuyruğun küçük bir parçasını kesmek için yeni bir tıraş bıçağı kullanın ve ardından glikoz çipine bir damla kan sıkın. İntragastrik lavaj tekniğini kullanarak, fare glikozunu besleyin ve hemen zamanlayıcıyı başlatın.Glikozu farklı zaman noktalarında ölçün. İnsülin tolerans testini başlatmak için 0.25 ünite insan insülin solüsyonu hazırlayın. Ardından, enjeksiyon için uygun insülin miktarını hesaplamak için oruç tuttuktan sonra her fareyi tartın.Ardından, deney sırasında okumaları kaydetmek için bir zaman çizelgesi oluşturun. Son olarak, insülin enjeksiyonundan sonra, daha önce yapıldığı gibi kan şekeri seviyesini ölçün. Glukoz metabolizması, farelerde oral glukoz verilmesini takiben ameliyat sonrası oral glukoz tolerans testi ile ölçüldü.ACSF ile infüze edilen veya CCL-5 antagonisti ile infüze edilen farelerde kan şekeri seviyesindeki değişiklikler burada kaydedilir ve gösterilir. İnsülin duyarlılık testi de yapıldı ve C-C-L-5 antagonisti ile infüze edilen farelerde kan şekeri seviyesi, kontrol farelerine kıyasla sadece biraz azaldı, bu da C-C-L-5 ile tedavi edilen farelerde periferik glikoz metabolizmasında insülin fonksiyonunda bozulmalar olduğunu düşündürdü. İnsülin sinyal aktivasyonunu analiz etmek için, insülin reseptörü substrat proteini veya I-R-S-1 fosforilasyonu hipotalamusta değerlendirildi.Normal beslendiğinde C-C-L-5 antagonisti ile tedavi edilen farelerde, I-R-S-1 fosforilasyonu kontrol grubuna kıyasla yukarı regüle edildi. İnsülin sinyal aktivasyonunu daha fazla analiz etmek için, insülin aşağı akış sinyal molekülü olan fosforile serin 4-7-3 Akt seviyeleri de değerlendirildi. Daha sonra, kontrol ACSF ile tedavi edilen farelerde insülin zorluğu AKT sinyali artmıştır, ancak CCL-5 antagonisti ile tedavi edilen farelerde artmamıştır.Mikro-ozmotik pompanın yerleştirilmesi ustalardan sonra, uygun şekilde yapılırsa sadece yarım saat sürecektir. Bu prosedürü denerken, fare kafasının hafifçe yukarı kaldırıldığından ve omurganın stereotaktik aparat üzerinde düz olduğundan emin olmak önemlidir. Bu teknik, araştırmacıya endokrinolojide bir ilacın, bir kemokinin veya kemirgenin beynindeki bir protein fonksiyonunun etkisini keşfetmesi için bir yol sağlar.Bu prosedürü takiben, C-C-L-5 ve reseptör C-C-L-5'in gıda sindirimi ve metabolizma devresine nasıl katıldığı gibi ek soruları yanıtlamak için bir virüsün intraserebral iletimi veya daha keskin 9 ile gen ekspresyonunun manipüle edilmesi gibi ek bir önlem gerçekleştirilebilir.

studying-hypothalamic-insulin-signal-to-peripheral-glucose

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Hiperinsülinemik öglisemik kelepçe, ya da insülin kelepçe, insülin etkisini değerlendirmek için altın...

Bilinçli Mesnetlenmemiş Fare hiperinsülinemik öglisemik Kelepçeleri

Doğrudan intrahippocampal mikroenjeksiyon ile hipokampal bağımlı uzaysal çalışma belleği Modülasyon, eşlik ve...

Hipokampal İnsülin Mikroenjeksiyon ve<em&gt; In vivo</emMekansal Bellek Test sırasında&gt; mikrodivaliz

Bu videoda, bir laboratuvar faresinde oral glukoz tolerans testinin nasıl yapılacağı anlatılmaktadır.

Oral Glukoz Tolerans Testi (OGTT): Farelerde Glukoz Metabolizmasının Ölçülmesi

Bu videoda, bir mikro-ozmotik pompa beyin infüzyon sisteminin montajını ve ardından fare kafatasına cerrahi implantasyonunu gösteriyoruz. Bu sistem, potansiyel ilaçların sürekli olarak verilmesini sağlar ve bunların beyin ve beyin dokusu üzerindeki etkilerinin incelenmesini kolaylaştırır.

Fare Modelinde Sürekli İlaç İnfüzyon Sistemi: Sürekli İlaç Dağıtımı için Fare Beynine Mikro-ozmotik Pompa İnfüzyon Sistemini İmplante Etmek İçin Cerrahi Bir Prosedür

Bu video, fare beynine sürekli ilaç infüzyonunun kan şekeri seviyeleri üzerindeki etkisini göstermektedir. Glikoz metabolizması, açlık bir farenin kuyruğundan kan toplanarak ve oral glikoz uygulamasından önce ve sonra glikoz seviyelerinin ölçülmesiyle değerlendirilir. İnsülin toleransı, fareye insülin enjekte edilerek değerlendirilir ve glikoz seviyeleri belirli aralıklarla kaydedilir.

Fare Beynine Sürekli İlaç İnfüzyonunun Periferik Glikoz Düzeyleri Üzerindeki Etkisinin Değerlendirilmesi

Geçerli makalenin üretimi ve yüksek yağlı diyet beslenen farelerin metabolik karakterizasyonu diyet kaynaklı insülin direnci ve obezite bir model olarak açıklar. Daha fazla oral glukoz tolerans testi ve glukoz metabolizma vivo içindetüm vücut değişikliklere izleme insülin tolerans testi gerçekleştirmek için detaylı iletişim kuralları bulunmaktadır.

Vivo glikoz metabolizması farelerde Oral glukoz tolerans testi (OGTT) ve insülin tolerans testi (ITT) kullanarak yüksek yağlı diyet beslenen incelenmesi

Burada, hastalar için tasarlanmış ticari bir sürekli glikoz monitörünü farelere implante etmek ve sonuçları analiz etmek için komut dosyaları sağlamak için basit bir yöntem açıklıyoruz.

Serbestçe hareket eden farelerde basit sürekli glikoz izleme

Bu makalede, farelerin beyin omurilik sıvısındaki (BOS) glikoz konsantrasyonunu arttırmak için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, yüksek BOS glikozunun farelerde nörodejenerasyon, biliş ve periferik glikoz metabolizması üzerindeki etkilerini incelemek için yararlı olabilir.

Fare Beyin Omurilik Sıvısında Glikoz Konsantrasyonunu Artırmak için Ozmotik Minipump İmplantasyonu

Daha yüksek kan şekeri konsantrasyonu ile insülin salınımını ölçmek için bir hiperglisemik kelepçe kullanılır. Hipoglisemik bir kelepçe, karşı düzenleyici yanıtların neden olduğu glikoz üretimini ölçmek içindir. Her iki yöntemde de aynı cerrahi prosedür kullanılır. Burada, sistemik glukoz metabolizmasını değerlendirmek için bir klemp tekniği sunuyoruz.

Bilinçli Farelerde Hiperglisemik Kelepçe ve Hipoglisemik Kelepçe

Burada, olası karışıklıkların azaltılması ile endokrin pankreas fonksiyonunu değerlendirmek için ek bir teknik olarak, sağlam bir pankreas ile fare damar sistemi yoluyla perfüzyon yoluyla glikoz ile uyarılan insülin sekresyonu (GSIS) gerçekleştirme hakkında ayrıntılar sunuyoruz.

Sağlam Bir Pankreas ile Farelerin Damar Sisteminden Perfüzyon Yoluyla Glikozla Uyarılan İnsülin Sekresyonu

Öğrenin, farelerde mikro-osmotik pompa ile beyne Met CCL5 antagonisti verilerek hipotalamik CCL5 sinyalinin insülin duyarlılığı ve glukoz metabolizması üzerindeki etkilerini. Bu yöntem metabolik bozukluklar için tedavi hedefleri keşfetmeye yardımcı olur.

Hipotalamik insülin sinyal fare beyin içine sürekli uyuşturucu infüzyon sistemi ile periferik glikoz intoleransı için eğitim

Daha fazla video keşfet