Hipotalamik insülin sinyal fare beyin içine sürekli uyuşturucu infüzyon sistemi ile periferik glikoz intoleransı için eğitim

Bu deneyin genel amacı, hipotalamik C-C-L-5 sinyalinin periferik sistemdeki insülin fonksiyonundaki rolünü ve C-C-L-5 sinyalini manipüle ederek C-C-L-5 sinyalini manipüle ederek araştırmaktır. Bu ilaç, vücut glikoz metabolizmasını ve beyindeki insülin yanıtını kontrol etmede kemokin C-C-L-5 gibi biyokimyasal fizyoloji alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu ölçümün ana avantajı, deneycinin beyindeki belirli sinyalleri, buradaki C-C-L-5 gibi, telafi edici bir etki veya bozukluk geliştirmeden, genellikle kemirgenlerde genetik manipülasyon yaptığımızda olan bir süre için kolayca manipüle edebilmesidir.

Mikro-ozmotik pompanın yerleştirilmesi ve kan insülin ve glukoz seviyesinin doğru ölçümü beceri ve hassasiyet gerektirdiğinden bu prosedürün görsel olarak gösterilmesi önemlidir. Ameliyattan bir gün önce, bir mililitrelik şırınga ve künt başlı iğne kullanarak beyin mikro-ozmotik pompalarını hazırlayın ve pompaları yapay beyin omurilik sıvısı veya ACSF ile doldurun. Ardından, pompayı ACSF'ye daldırın ve gece boyunca nazikçe sallamak için bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin.

Ertesi gün, ACSF'yi pompadan çıkarın ve fazlalık dışarı sızana kadar ACSF içinde seyreltilmiş önceden hazırlanmış ilaç solüsyonu ile tamamen doldurun. Ardından, kateter tüplerini istenen uzunlukta kesmek için cerrahi makas kullanın. Künt uçlu bir beyin infüzyon iğnesi kullanarak, tüpleri beyin infüzyon kitine takın.

Ardından, infüzyon kitindeki tüpleri ilaç çözeltisi ile doldurun. Kiti monte ettikten sonra mikro ozmotik pompaya takın. Son olarak, pompanın kurumasını önlemek için, ozmotik pompa beyin infüzyon ayarını sterilize edilmiş 50 mililitrelik bir tüp içinde ACSF'ye daldırın.

Ameliyatı başlatmak için, anestezi uygulanmış bir farenin kafasını stereotaktik bir aparata monte edin ve sabitleyin. Bir çift cerrahi makas ve kerpeten kullanarak kafatasını kaplayan dış deriyi kesin. Ardından, periferik kafatasını temizlemek için iyot kullanın.

Daha sonra, ozmotik pompa beyin füzyon seti implantasyonu için cildin en dış tabakasını deri altı deriden ayırmak için boyun bölgesine yakın bir çift künt başlı makas kullanın. İnfüzyon noktasını beyin haritasına referans olarak işaretlemek için stereotaktik cihazı kullanın. Kafatasında işaretli alanın etrafında bir delik açmak için bir tırnak matkabı kullanın, fare meninkslerini ve kan damarlarını kırmamaya dikkat edin.

Daha sonra ilgilenilen ilacın veya kontrol olarak A-C-S-F'nin bulunduğu mikro-ozmotik pompa beyin füzyon setini boyun bölgesinin arkasındaki cilt altına yerleştirin. İlacın beyne infüze edilmesi için, beyin infüzyon iğnesini açılan deliğe sokun. İğneyi kafatasının üzerine sabitlemek için yüzey hassasiyet giderici jel kullanın ve yapıştırıcı kuruyana kadar bekleyin.

İğnenin üstündeki çıkıntılı parçayı kesin. Glikoz tolerans testine başlamadan önce, 3.75 gram glikoz ve 15 mililitre damıtılmış suyu çözerek glikoz çözeltisini hazırlayın. Deney sırasında okumaları kaydetmek için her kan muayenesi arasında uygun aralıklarla bir zaman çizelgesi oluşturun.

Daha sonra, enjeksiyon için uygun glikoz miktarını hesaplamak için oruç tuttuktan sonra her bir fareyi tartın. Daha sonra çalışma tezgahında bir zamanlayıcı, glikoz çipi, şeker ölçüm cihazı, insülin şırıngası ve tıraş bıçağı hazırlayın. Kan şekeri seviyesini ölçmek için önce şeker ölçüm cihazına yeni bir glikoz çipi yerleştirin ve sıfırı ayarlamak için başlat düğmesine basın.

Ardından, fareyi boynunun arkasından alın ve yeterli kan akışını sağlamak için kuyruğunu okşayın. Kuyruğun küçük bir parçasını kesmek için yeni bir tıraş bıçağı kullanın ve ardından glikoz çipine bir damla kan sıkın. İntragastrik lavaj tekniğini kullanarak, fare glikozunu besleyin ve hemen zamanlayıcıyı başlatın.

Glikozu farklı zaman noktalarında ölçün. İnsülin tolerans testini başlatmak için 0.25 ünite insan insülin solüsyonu hazırlayın. Ardından, enjeksiyon için uygun insülin miktarını hesaplamak için oruç tuttuktan sonra her fareyi tartın.

Ardından, deney sırasında okumaları kaydetmek için bir zaman çizelgesi oluşturun. Son olarak, insülin enjeksiyonundan sonra, daha önce yapıldığı gibi kan şekeri seviyesini ölçün. Glukoz metabolizması, farelerde oral glukoz verilmesini takiben ameliyat sonrası oral glukoz tolerans testi ile ölçüldü.

ACSF ile infüze edilen veya CCL-5 antagonisti ile infüze edilen farelerde kan şekeri seviyesindeki değişiklikler burada kaydedilir ve gösterilir. İnsülin duyarlılık testi de yapıldı ve C-C-L-5 antagonisti ile infüze edilen farelerde kan şekeri seviyesi, kontrol farelerine kıyasla sadece biraz azaldı, bu da C-C-L-5 ile tedavi edilen farelerde periferik glikoz metabolizmasında insülin fonksiyonunda bozulmalar olduğunu düşündürdü. İnsülin sinyal aktivasyonunu analiz etmek için, insülin reseptörü substrat proteini veya I-R-S-1 fosforilasyonu hipotalamusta değerlendirildi.

Normal beslendiğinde C-C-L-5 antagonisti ile tedavi edilen farelerde, I-R-S-1 fosforilasyonu kontrol grubuna kıyasla yukarı regüle edildi. İnsülin sinyal aktivasyonunu daha fazla analiz etmek için, insülin aşağı akış sinyal molekülü olan fosforile serin 4-7-3 Akt seviyeleri de değerlendirildi. Daha sonra, kontrol ACSF ile tedavi edilen farelerde insülin zorluğu AKT sinyali artmıştır, ancak CCL-5 antagonisti ile tedavi edilen farelerde artmamıştır.

Mikro-ozmotik pompanın yerleştirilmesi ustalardan sonra, uygun şekilde yapılırsa sadece yarım saat sürecektir. Bu prosedürü denerken, fare kafasının hafifçe yukarı kaldırıldığından ve omurganın stereotaktik aparat üzerinde düz olduğundan emin olmak önemlidir. Bu teknik, araştırmacıya endokrinolojide bir ilacın, bir kemokinin veya kemirgenin beynindeki bir protein fonksiyonunun etkisini keşfetmesi için bir yol sağlar.

Bu prosedürü takiben, C-C-L-5 ve reseptör C-C-L-5'in gıda sindirimi ve metabolizma devresine nasıl katıldığı gibi ek soruları yanıtlamak için bir virüsün intraserebral iletimi veya daha keskin 9 ile gen ekspresyonunun manipüle edilmesi gibi ek bir önlem gerçekleştirilebilir.