Dictyostelium discoideum yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi
9 Kasım 2017
Burada akut mekanik stimülasyon hücresel yanıt değerlendirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Mikroskopi tabanlı tahlil fluorescently etiketli biyosensörler kesme akışı ile kısa stimülasyon takip yerelleştirilmesini inceleyin. Ayrıca akut mekanik stimülasyon karşılık olarak ilgi çeşitli proteinlerin aktivasyonu biyokimyasal olarak test ediyoruz.
Bu prosedürün genel amacı, kısa mekanik bozulmayı takiben hücre içi sinyal iletim ağının çeşitli bileşenlerinin aktivitesini incelemektir. Bu yöntem, hücrelerin mekanik uyaranlar da dahil olmak üzere çeşitli çevresel ipuçlarını nasıl algıladığı ve bunlara doğru yönlü olarak nasıl göç ettiği gibi hücre göçü alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, motilite veya polaritenin yanıta kafa karıştırıcı katkısı olmadan mekanik uyarana ilk tepkinin incelenmesine izin vermesidir.
Bu yöntem için ilk olarak, hafif bir ajitasyonla verilen kemoatraktana yapışık hücrelerin tepkisini test ettiğimizde ve araç kontrolü ile uyarılan hücrelerin sağlam bir tepkisini fark ettiğimizde aklımıza geldi. Başlamak için, donmuş stoktan az sayıda hücreyi antibiyotik olmadan HL5 ortamına aşılayarak Klebsiella aerogenes'i hazırlayın ve kültürü gece boyunca inkübe edin. Klebsiella aerogenes bakterilerinin varlığında Dictyostelium'un büyümesi, makropinozomların sayısını azaltacak ve bu da hücrenin dış uyaranlara yanıt verme yeteneğini artıracaktır.
Deneyi, bakteriler hazır olduğunda, katlanarak büyüyen Dictyostelium olacak şekilde zamanlayın. Bu Dictyostelium hücrelerini toplayın ve bir hemositometre kullanarak sayın. Daha sonra, 100.000 Dictyostelium hücresi içeren 260 mikrolitre bakteri süspansiyonunu bir SM plakasına yayın.
Ayrıca sigorta için, iki kat daha fazla ve yarısı kadar Dictyostelium hücresi içeren plakalar hazırlayın. Oda sıcaklığında bir günlük büyümeden sonra, plakayı ters çevirin ve Dictyostelium hücreleri bakteri çimini temizlemeye başlayana kadar ancak henüz toplanmaya başlamayana kadar plakayı kültürlemeye devam edin. Ardından, plakaya beş mililitre DB tamponu ekleyin ve bir cam yayıcı kullanarak Dictyostelium'u kazıyın.
Hücreleri ve çözeltiyi 50 mililitrelik bir polipropilen tüpe aktarın, ardından plakayı beş mililitre DB ile durulayın ve bunu 50 mililitrelik tüpe ekleyin. Gerekirse tekrarlayın. Dictyostelium'u yıkamak için, tüpü DB ile 50 mililitreye kadar doldurun, hücreleri pelet haline getirin ve ardından süpernatanı aspire edin ve atın.
Süpernatan berraklaşana kadar hücreleri tekrar tekrar yıkayın. Son olarak, DB tamponundaki Dictyostelium'u mililitre başına yaklaşık beş milyon hücreye yeniden askıya alın. Başlamak için, iki mililitre DB ile 35 milimetrelik tabaklara iki milyon toplama yetkin Dictyostelium yerleştirin. Her zaman noktası için bir plaka ve uyarılmamış bir kontrol hazırlayın.
Oda sıcaklığında, hücrelerin plakaya yapışması için 10 dakika bekleyin. Ardından, bağlanmamış hücreleri bir mililitre DB ile iki durulama kullanarak plakadan yıkayın. Plakalar bağlanmamış Dictyostelium'dan temizlendikten sonra, bağlı hücreleri plakaları rahatsız etmeden 30 dakika boyunca bazolasyon tamponunda inkübe edin. Hücrelerin erken uyarılmasını önlemek için yarım saatlik inkübasyon sırasında plakaların herhangi bir hareketinden kaçınmak çok önemlidir.
Şimdi, kontrollü bir miktarda mekanik stimülasyon uygulamak için, bir plakayı ayrı ayrı bir orbital çalkalayıcıya aktarın ve çalkalayıcıyı beş saniye boyunca 150 rpm'de çalıştırın. Ardından, istenen süreden sonra, tamponu aspire edin ve plakayı hemen buzun üzerine koyun. Hemen proteaz ve fosfataz inhibitörleri içeren 100 mikrolitre numune tamponu ekleyin ve hücreleri kazıyın.
Lizatı 1,5 mililitrelik tüplere toplayın ve hemen 95 derecede 10 dakika ısıtın. Lizatı analiz etmeye devam edin veya saklamak için eksi 20 santigrat dereceye aktarın. Vejetatif veya agregasyona yetkin hücrelerin süspansiyonlarını yaptıktan sonra, mikroakışkan oda kızağına yaklaşık 600 mikrolitre yükleyin.
Girişler tamamen doldurulmalıdır, bu nedenle gerekirse tampon ile doldurun. Hücrelerin 10 dakika bağlanmasına izin verin. Cihaz için bir giriş hattını 15 mililitre rezervuarlı bir elektronik pompaya bağlayın.
Pompa için yazılım kontrolünü kullanarak vanayı kapatın ve ardından rezervuarı DB ile doldurun. Şimdi basıncı 50 milibar'a ayarlayın ve pompayı açın. Açmak için vanaya tıklayarak hattı DB ile doldurun ve durulayın. Yaklaşık 30 saniye duruladıktan sonra basıncı tekrar sıfıra getirin ve ardından valfi kapatın.
Ardından, hattı slaydın bir tarafındaki üç girişten birine bağlayın. Herhangi bir hava kabarcığı tutmayın ve bağlantı yapıldıktan sonra sürgünün o tarafındaki diğer iki girişi kapatın. Şimdi, tahliyeden gelen hattı sürgünün karşı tarafındaki tek çıkışa bağlayarak kurulumu tamamlayın.
Ardından, floresan mikroskopta parlak alan veya faz aydınlatması altında, kanalı 20X hava hedefi ile görüntüleyin ve kanalı durulayın. Ardından, basıncı yaklaşık 50 milibar'a ayarlayın ve valfi açın. Sıvı tahliyeden çıktıktan sonra dış basıncı sıfıra düşürün, yaklaşık 30 saniye bekleyin ve vanayı kapatın.
Ardından, 40X yağ hedefine geçin, kanalın en geniş kısmına odaklanın ve yazılımı RFP veya GFP aydınlatması ile her üç saniyede bir görüntü toplayacak şekilde hazırlayın. Valf kapalıyken basıncı istenen değere ayarlayın. Ardından, üç saniyelik aralıklarla beş ön stimülasyon görüntüsü elde edin.
Ardından, uyaranı iletmek için valfi kısaca açın. Şimdi, 45 saniye içinde en az 15 kare daha veri toplayın. Yanıtı, metin protokolünde açıklandığı gibi nicelleştirin.
İlk olarak, önceki bölümde açıklandığı gibi Dictyostelium ile bir mikroakışkan slayt yükleyin. Bu deney için iki giriş satırı hazırlayın. Hatları kapatmak için, arıtma solüsyonunu taşıyan hat üzerinde fiziksel bir kelepçe ve DB solüsyonunu taşıyan hattı araçla kapatmak için yazılım kontrollü vana kullanın.
Şimdi, iki satırı uygun çözelti ile doldurun, tek başına tampon artı araç veya bir inhibitör gibi bir işlemle tamponlayın. Hatlar durulandıktan sonra, bunları kanalla birlikte sürgünün yan tarafındaki iki girişe bağlayın ve kullanılmayan girişi kapatın. Ardından, tahliye hattını karşı taraftaki çıkışa bağlayın.
Şimdi, daha önce açıklandığı gibi tampon artı aracı kullanarak sürgüyü yıkayın. Ardından, kanalı tedavi ile doldurun. İlk olarak, akışı sıfır milibara düşürün.
Ardından, valfleri değiştirin, tedaviyi yaklaşık 15 saniye boyunca akıtın ve inkübasyonu zamanlamaya başlayın. Her 10 dakikada bir, odadaki oksijen seviyelerini yenilemek için hücrelerin üzerine yaklaşık 15 saniye boyunca taze arıtma solüsyonu akıtın. Yapışık agregasyona yetkin hücreler, bir orbital çalkalayıcı kullanılarak beş saniyelik kesme akışına maruz bırakıldı.
Dictyostelium, bazal aktivitelerini azaltmak için kafein ile ön işleme tabi tutuldu. Sonuç olarak, PKBR1 ve ERK2'nin bazal aktivitesi çok düşük ve stimülasyon ile bu kinazların anahtar kalıntılarının fosforilasyonunda güçlü bir artış oldu. Çeşitli floresan etiketli biyosensörleri eksprese eden agregasyona yetkin hücrelerde, PIP3 veya yeni polimerize aktin tarafından işe alınan iki öncü kenar belirteci, PHcrac ve LimE, her ikisi de dinlenme hücrelerinde çoğunlukla sitozolik lokalizasyon gösterdi.
Beş saniyelik kesme akışının ardından, bu biyosensörler hızla kortekse yeniden lokalize oldu ve sitozole geri döndü. Aktin depolimerize edici ilaç Latrunculin A'nın etkileri, benzer bir kesme kuvveti deneyi kullanılarak test edildi. Bu durumda, vejetatif hücreler önce kontrol koşullarına maruz bırakıldı ve daha sonra istenen test ajanını içeren tampona geçirildi.
Latrunculin A tedavisi, ön kenar belirteçlerinin kortekse yeniden lokalizasyonunu engelledi. Şaşırtıcı bir şekilde, akış iki saniye sonra kapatılmadıysa ve deney süresince açık kaldıysa, yine de geçici bir küresel tepki gözlendi. Küresel tepkiyi takiben, vejetatif hücreler akışa karşı göç etti.
Bu tahlillerin başarısı için hücrelerin uygun şekilde hazırlanması son derece önemlidir. Vejetatif hücreler, mekanik stimülasyona yanıt vermelerini sağlamak için bakterilerle birlikte büyütülmelidir. Agregasyona yetkin hücreler için, az veya fazla gelişmiş hücreler zayıf yanıt verme eğilimindedir.
Biyokimyasal ve mikroskobik yaklaşımlar birbirini tamamlar ve bu, mekanik stimülasyona tepkileri için çok sayıda sinyal iletim ara ürününü değerlendirmemize izin verir. Farmakolojik ve genetik bozulmaları ekleyerek, mekanik uyaranların nasıl algılandığını ve iletildiğini öğrenebiliriz. Bu, kesme akışı gibi fiziksel uyaranlar tarafından yönlendirilen yönlendirilmiş hücre göçünü anlamak için önemlidir.
Mekanik stimülasyon, kemoatraktanlarla aynı sinyal iletim ağının aktivasyonunu tetiklediğinden, artık çeşitli uyaranların hücreler üzerindeki entegrasyonunu inceleyebiliriz. Sonuç olarak, bu çalışmalar, kendi bağışıklık hücrelerimiz ve metastatik kanser hücreleri gibi göç eden hücrelerin vücutta nasıl dolaştığını anlamamıza yardımcı olacaktır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, mikroskopiye dayalı bir analiz kullanarak hücresel tepkileri akut mekanik stimülasyona değerlendirmek için bir yöntem sunmaktadır. Yaklaşım, floresan etiketli biyosensörlerin lokalizasyonunu incelemeyi ve kesme akışına tepki olarak belirli proteinlerin aktivasyonunu test etmeyi içermektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücresel biyoloji
- Mekanotransdüksiyon
- Sinyal iletimi
Arka Plan
- Hücrelerin mekanik uyaranlara nasıl tepki verdiğini anlamak, hücre göçü hakkındaki bilgiler için çok önemlidir.
- Bu yöntem, ilk hücresel tepkiyi hareketlilik ve polarite etkilerinden izole eder.
- Önceki gözlemler, hücrelerin mekanik rahatsızlıklara güçlü bir tepki verdiğini gösterdi.
- Klebsiella aerogenes kullanımı, hücrelerin dış uyaranlara tepkilerini artırır.
Çalışmanın Amacı
- Mekanik rahatsızlık sonrası hücre içi sinyal iletim bileşenlerinin aktivitesini araştırmak.
- Hücrelerin mekanik işaretleri nasıl algıladığını ve bunlara doğru nasıl göç ettiğini keşfetmek.
- Akut hücresel tepkileri incelemek için güvenilir bir yöntem sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- HL5 ortamında Klebsiella aerogenes hazırlanması.
- Biyosensör lokalizasyonunu gözlemlemek için mikroskopiye dayalı analiz.
- Kesme akışına tepki olarak protein aktivasyonunun biyokimyasal test edilmesi.
- Mekanik uyaranlara hücresel tepki değerlendirmesi.
Ana Sonuçlar
- Hücreler, mekanik stimülasyon sonrası biyosensörlerin farklı lokalizasyon paternlerini sergiledi.
- Kesme akışına tepki olarak belirli proteinlerin aktivasyonu gözlendi.
- Yöntem, mekanik işaretlere ilk hücresel tepkiyi etkili bir şekilde izole ediyor.
- Klebsiella aerogenes varlığında yetiştirildiğinde hücrelerin tepki gücü arttı.
Sonuçlar
- Bu yöntem, hücresel mekanotransdüksiyon mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sağlamaktadır.
- Hareketlilik etkisinden bağımsız olarak akut tepkileri incelemeyi mümkün kılar.
- Bulgular, hücre göçü dinamiklerini daha iyi anlamak için katkıda bulunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding how cells sense and respond to mechanical cues such as shear flow is critical for de-risking target validation in cell migration pathways. This method enables mechanistic interrogation of signal transduction networks without confounding motility or polarity effects, supporting predictive confidence in early discovery. By isolating acute responses to mechanical stimulation, it aids in distinguishing direct mechanotransduction effects from secondary cellular adaptations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by linking mechanical stimuli to chemotactic pathway activation.
- Operational Value: Enables functional target validation through biosensor re-localization and phosphorylation readouts.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying whether targets are engaged by physical cues relevant to disease microenvironments.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening under mechanical stress conditions.
- Quantitative Output: Generates reproducible localization and activation metrics for high-content screening integration.
- Scalability: Supports both single-cell imaging and population-based biochemical assays for flexible workflow adoption.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models microenvironmental mechanical cues encountered by immune and cancer cells in tissues.
- Translational Continuity: Links discovery-phase mechanosensing to preclinical validation of migration inhibitors.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from direct mechanotransduction or compensatory signaling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for pathways influenced by physical microenvironmental cues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing how shear flow activates chemotactic networks independent of receptor ligation.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantifiable biosensor translocation and kinase activation endpoints.
- Analytics: Provides phosphorylation and subcellular localization data enabling comparison across stimulation conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling shear flow conditions relevant to vascular and interstitial environments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for probing mechanosensitive targets across multiple disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by isolating primary mechanotransduction events from downstream motility effects.
- Operational Value: Standardizes stimulation timing and duration (2–5 seconds) for reproducible response capture.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by clarifying target engagement under physiologically relevant mechanical stress.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on responsiveness to mechanical cues in disease contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, microfluidics, and fluorescence microscopy for accurate stimulus delivery and readout.
- Depends on access to orbital shakers, pressure-controlled pumps, and microfluidic chamber slides for mechanical stimulation.
- Necessitates cross-team standardization of stimulation protocols to ensure consistency between imaging and biochemical assays.
- Involves adaptation considerations when translating from Dictyostelium to mammalian model systems.
- Limited by the need for careful cell preparation to avoid premature activation during basolation and washing steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Growth and Collection of Vegetative D. discoideum
2:51
Acute Mechanical Stimulation Using an Orbital Shaker
4:18
Acute Mechanical Stimulation Using a Microfluidic Chamber
6:33
Applying Pharmacological Treatments Using the Microfluidic Chamber
7:48
Results: Observed Shear Force Responses in D. discoideum
9:18
Conclusion
