Name: Dictyostelium discoideum yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Öğrenin Dictyostelium discoideum hücrelerinde akut mekanik stimülasyon yanıtlarını mikroskopi tabanlı analizle değerlendirmeyi. Bu yöntem, hücre göçü ve mekanotransdüksiyon mekanizmalarını hareketlilik etkisi olmadan incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Ulusal Sağlık hibe R35 GM118177 PND Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+chemotaxis%3A+a+network+of+signaling+pathways+controls+motility%2C+directional+sensing%2C+and+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity.</a> Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).</li>
<li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K%2C+cell+polarity%2C+and+directional+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).</li>
<li>Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).</li>
<li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+Protein+Signaling+Events+Are+Activated+at+the+Leading+Edge+of+Chemotactic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells.</a> Cell. 95 (1), 81-91 (1998).</li>
<li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Regulation+of+3-Phosphoinositides+by+PI+3-Kinase+and+PTEN+Mediates+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis.</a> Cell. 109 (5), 611-623 (2002).</li>
<li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Suppressor+PTEN+Mediates+Sensing+of+Chemoattractant+Gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients.</a> Cell. 109 (5), 599-610 (2002).</li>
<li>Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RasC+is+required+for+optimal+activation+of+adenylyl+cyclase+and+Akt%2FPKB+during+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation.</a> EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).</li>
<li>Kamimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP3-Independent+Activation+of+TorC2+and+PKB+at+the+Cell%27s+Leading+Edge+Mediates+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis.</a> Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).</li>
<li>Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C+Regulation+of+Phosphatidylinositol+3%2C4%2C5-trisphosphate-mediated+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).</li>
<li>Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+excitable+signal+integrator+couples+to+an+idling+cytoskeletal+oscillator+to+drive+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration.</a> Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).</li>
<li>Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitable+Signal+Transduction+Induces+Both+Spontaneous+and+Directional+Cell+Asymmetries+in+the+Phosphatidylinositol+Lipid+Signaling+System+for+Eukaryotic+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis.</a> Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).</li>
<li>Gerisch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobile+Actin+Clusters+and+Traveling+Waves+in+Cells+Recovering+from+Actin+Depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization.</a> Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).</li>
<li>Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+modes+of+state+transitions+determine+pattern+in+the+Phosphatidylinositide-Actin+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system.</a> BMC Cell Biol. 12 (1), 42(2011).</li>
<li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Three-Dimensional+Dynamics+of+Actin+Waves%2C+a+Model+of+Cytoskeletal+Self-Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization.</a> Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).</li>
<li>Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Actin-Based+Wave+Generator+Organizes+Cell+Motility%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility.</a> PLOS Biol. 5 (9), e221(2007).</li>
<li>Devreotes, P., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+Networks+that+Regulate+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling Networks that Regulate Cell Migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).</li>
<li>Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+towards+a+paradigm%3A+common+mechanisms+of+chemotactic+signaling+in+Dictyostelium+and+mammalian+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).</li>
<li>Dalous, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+cell+polarity+and+actin-myosin+cytoskeleton+reorganization+under+mechanical+and+chemical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation.</a> Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).</li>
<li>Sato, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+direction+in+electric-signal-induced+cell+migration+by+cyclic+guanosine+monophosphate+and+phosphatidylinositol+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).</li>
<li>Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipids%2C+EGF+receptors%2C+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+j%22%5BJournal%5D)">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).</li>
<li>Decave, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+flow-induced+motility+of+Dictyostelium+discoideum+cells+on+solid+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate.</a> J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).</li>
<li>Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+mechanical+stimuli+act+on+common+signal+transduction+and+cytoskeletal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).</li>
<li>Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+development+and+chemotaxis+in+Dictyostelium+discoideum+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants.</a> Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).</li>
<li>Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Dictyostelium+discoideum+with+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).</li>
<li>Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24535823">PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis.</a> J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).</li>
<li>Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3381519/">Analysis of chemotaxis in Dictyostelium.</a> Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Brenner, M., Thoms, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+blocks+activation+of+cyclic+AMP+synthesis+in+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum.</a> Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).</li>
<li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Actin+Patterns+and+Arp2%2F3+Assembly+at+the+Substrate-Attached+Surface+of+Motile+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells.</a> Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).</li>
<li>Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+protein+Callipygian+defines+the+back+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).</li>
<li>Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Akt%2FPKB-related+kinase+is+essential+for+morphogenesis+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium.</a> Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).</li>
<li>Westendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+of+chemotactic+amoebae+operates+close+to+the+onset+of+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yöntem tanımlamak burada nüfus ve tek hücre davranış yanıt akışı yamultmak için değerlendirmek için kullanışlı bir yol sunar. Önceki çalışmalarda lider ve kenar işaretleri geçiş sırasında geri kalmış yerelleştirme analiz ederken, önemlisi, güncel yaklaşımlar ilk etkisi soruşturma akut kesme akışı uygulayarak sağlar. Bu yöntemi kullanarak aslında, ilk yanıt akışı yamultmak için hücre hücre geçiş gerektirmez, gösterdi. Bunun yerine, ilk kesme akışı uyarana hızlı ve geçici yanıt akışına benzer şekilde chemoattractant degrad...

Geçiş ökaryotik hücre ortamında gradyanlar çözünür veya yüzey bağlı chemoattractants, değişken sertliği yüzeylerde, elektrik alanları veya yamultma akışı dahil olmak üzere çeşitli kimyasal ve fiziksel ipuçları tarafından önyargılı. Moleküler mekanizmalar kemotaksisi sürüş bizim anlamada birçok gelişmeler rağmen daha az yönlendirilmiş göç ve nasıl bu farklı sinyaller Birleşik bir üretmek için hücresel düzeyde entegre edilmiştir diğer türleri hakkında bilinen göçmen yanıt.
Geçiş doğru bir chemoattractant artan bir konsantrasyon içerir üç davranış bileşenleri Yönetmen: hareketliliği, yönlü algılama ve polarite1. Motilite pseudopod çıkıntı tarafından elde hücrelerin rastgele hareket anlamına gelir. Yönlü bir hücre bir chemoattractant kaynağını tespit yeteneği algılama, hangi hatta oluşabilir hücrelerin immobilize. Polarite hücre içi bileşenler arasında önde gelen ve artan sebat hareketine yol açan bir hücrenin, ahşap kaplama kenarı daha istikrarlı asimetrik dağılımı gösterir.
Bir chemoattractant hücresel yanıt dört kavramsal olarak tanımlanmış düzenleyici ağları faaliyete bağlıdır: reseptör / G protein, sinyal iletimi, aktin sitoiskeleti ve polarite1. G protein birleştiğinde reseptör Chemoattractant bağlama heterotrimeric G protein α ve βγ yönlü sinyali güçlendirir aşağı akım sinyal iletim ağ üzerinden sinyal iletir. Birden çok sinyal iletim ağı içinde paralel olarak hareket ve önyargı aktin polimerizasyon ve bunun sonucunda pseudopod çıkıntı, degradenin yönünü aktin sitoiskeleti ağa beslenir. Ras GTPazlar, TorC2, fosfoinositid 3-kinaz (PI3K), fosfataz ve tensin homolog (PTEN) ve guanylyl cyclase kemotaksisi önemli düzenleyiciler arasında vardır. Geri bildirim mekanizmaları sinyal iletim ağı içinde ve arasında sinyal iletimi ve aktin sitoiskeleti ağları daha fazla yanıt yükseltmek. Son olarak, kötü tanımlanmış polarite ağ giriş aktin sitoiskeleti alır ve daha fazla kalıcı degradenin yönünü geçişinde yaymak için sinyal iletim şebeke önyargıları.
Mekanik anlayışımızı kemotaksisi çoğunu fluorescently öğesini biyosensörler düzenleyici ağların çeşitli bileşenleri için gelişimi nedeniyle mümkün yapıldı. Birçok kemotaksisi düzenleyiciler asimetrik bir dağıtım düzenleyici molekül veya faaliyet var. Örneğin, tanımak biyosensörler harekete geçirmek yorum-in küçük GTPases Ras ve Rap1-Raf1 (RBD burada anılacaktır) Ras bağlayıcı etki ve RalGDS, sırasıyla-öncü bir chemotaxing hücre2,3yerelleştirilmesine. Benzer şekilde, PI3K ve onun ürün phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3), pleckstrin homoloji (PH) etki alanı tarafından tanınan da göstermek yerelleştirme ön cep4,5. Buna ek olarak, bir 3-fosfataz PTEN hangi dönüştürür PIP3 geri phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate, hücre6ahşap kaplama kenarı yerelleştirir. Önemlisi, bu biyosensörler onların yerelleştirme yanıt küresel stimülasyon ile bir chemoattractant olarak değiştirin. Sitozolik ya da çıkıntılar resting hücredeki ipucu, kortikal Yerelleştirme ve bulunmadığına kenar işaretleri geri kalmış ise korteks için relocalize öncü işaretleri çıkıntılar resting hücrede ipuçları, sonra sitozolik haline uyarım. Biyoalgılayıcı dağıtım yanıt olarak bir chemoattractant ile küresel stimülasyon analizi katkı kez gözlemleri yıkmak hareketliliği ve polarite, en aza indirir. Bir chemoattractant ile bir hücre süspansiyon genel veya üniforma uyarılması da bir araç olarak protein harekete geçirmek, genellikle protein fosforilasyon7,8,9 tarafından algılanan nüfusu genelindeki değişiklikleri değerlendirmek için kullanılan . Mikroskopi düzenleyici ağların çeşitli bileşenlerinin davranışı hakkında zamansal ve mekansal bilgi toplamak için kullanılan, ancak bu biyokimyasal tahlil öncelikle geçici bilgi, elde etmek için kullanılır.
Sinyal iletim ağ bir telaşlı sistem10,11özellikleri içerir. Supra-eşik kemotaktik uyaranlara yanıt "yaparak" ve ateşe dayanıklı dönemleri görüntülemek. Yanıt-e doğru da stochastically tetiklenir ve salınım davranış gösterebilir. Sinyal iletim olaylar dalgalar12,13,14,15yaymak bölgelere korteksin lokalizedir. Ön ya da geri, işaretçileri için işe veya aktif bölgelerinden yayılıyor dalgaların, ayırmak. Onlar karşılamak üzere active bölge izleyen ateşe dayanıklı bölge nedeniyle karşılıklı yönlendirilmiş dalgalar yok edin. Yayılıyor sinyal iletim dalgalar altında yatan hücre göç10arabuluculuk hücresel çıkıntılar.
Benzer düzenleyici mekanizmaları da nötrofil ve diğer memeli hücre türleri16 uygulanabilir olmasına karşın kemotaksisi olarak yukarıda belirtilen bilgilerin çoğunu sosyal amip Dictyostelium discoideum, iyice düşünülmüş--dan geldi . Dictyostelium tek hücreleri binlerce sonunda sporları içeren çok hücreli bir meyve vücut şekillendirme bir toplama merkezine doğru geçirirken, sırasında şiddetli açlık, güçlü kemotaktik tepki süresine sahip bir iyi kurulmuş model organizmadır. Bakteriyel gıda kaynakları bulmak için bu organizmanın tek hücre büyüme aşamasında kemotaksisi esastır. Önemlisi, geçiş tek Dictyostelium hücre memeli nötrofiller veya metastatik kanser hücrelerinin, Bütün bunlar çok hızlı protozlar türü göç geçmesi geçiş oldukça benzer. Aslında, düzenleyici ağların genel topoloji, hem çok bireysel sinyal iletim yollarının kemotaksisi dahil korunmuş Dictyostelium ve memeli lökosit17arasında. Ayrıca, fibroblastlar gibi diğer hücre reseptör tirozin kinaz (RTK) yerine GPCRs kullanın; Ancak, RTKs-ebilmek beslemek benzer ağlar.
Kemotaksis aksine, yönlendirilmiş göç çeşitli modları sürücü sinyal mekanizmaları konusunda eksiksiz bilgi bulunmuyor. Benzer şekilde chemoattractant Gradyanda geçiş hücreleri için çeşitli çalışmalarda harekete geçirmek ve/veya yerelleştirme tipik öncü işaretleri, aktin polimerizasyonu, PIP3 ve/veya hücre dışı sinyal düzenlenir kinaz (ERK) 1/2, dahil olmak üzere, bildirdin Açık geçiren hücre göç akışı veya elektrik alanları18,19,20,21değişimler yamultmak için yanıt olarak yönetti. Ancak, bu çalışmalarda uyarıcı sürekli maruz Ayrıca hücre göç, örneğin, bir uyarana tepki olarak özellikle öncü işaretleri yerelleştirilmesine, veya sadece öncü yerelleştirmek soru açık bırakarak sonuçlandı pseudopods ön geçirme hücre sayısının artmasına yüzünden.
Hücreleri cevaben kesme akışı hem düzeyinde nüfus ve tek tek hücreler22olarak teslim akut mekanik pertürbasyon gözlemlemek için bize izin deneyleri geliştirdik. Benzer bir chemoattractant, akut yaptığı ile küresel stimülasyonTion kesme akışı ile hareketliliği veya polarite mekanik bir uyarana karıştırıcı katkısı olmadan bir hücresel yanıt çalışma sağlar. Bu biyokimyasal ve mikroskobik deneyleri genetik veya farmakolojik tedirginlikler ile birleştirerek hakkında nasıl mekanik uyaranlara algılandığını öğrenmek için bize izin verir ve iletilen. Ayrıca, bu yaklaşım da yokluğunda böylece sinyal iletim ve aktin sitoiskeleti ağları reseptör/g izole eden bir chemoattractant, chemoattractant reseptör sistemi aşağı faydalanarak için yeni bir yöntem sağlar protein ağ.
Son zamanlarda biz açıklanan teknikleri kullanarak akut kesme stres kemotaktik sinyal iletim ve aktin sitoiskeleti ağlar22birden çok bileşeni etkinleştirme için yol gösterdi. Akut mekanik uyarıcı değişen aralıklarla uygulayarak, biz aynı şekilde chemoattractants için mekanik bizi canlı tutan da altında yanıt yaparak davranışını da dahil olmak üzere bir telaşlı sisteminin özelliklerini sergileyen, gösterdi koşullar ve ateşe dayanıklı bir süre varlığı doyurarak. Son olarak, mekanik ve kimyasal uyarımı birleştirerek iki uyaranlara büyük olasılıkla birden çok uyaranlara karşı önyargı hücre göç entegrasyon için izin sinyal iletim ve aktin sitoiskeleti ağlar, paylaşmak gösterdi.

<table><tbody><tr><td><güçlü >Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Dekstroz</td><td>Fisher</td><td>D16-1</td><td>HL-5 ortamı ve SM plakalarını hazırlamak için kullanın (adım 1.1, 1.2)</td></tr> <tr><td>Proteoz pepton</td><td>Fisher</td><td>DF0120-17-6</td><td>HL-5 ortamını hazırlamak için kullanın (adım 1.1)</td></tr> <tr><td>Maya özü</td><td>Fisher</td><td>50-550-445</td><td>HL-5 ortamını ve SM plakalarını hazırlamak için kullanın (adım 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>Na<alt>2</alt>HPO<alt>4</alt>&orta nokta; 7H2O</td><td>Fisher</td><td>S373-500</td><td>HL-5 ortamını hazırlamak için kullanın ve 10X Fosfat Tamponu (adım 1.1, 1.3)</td></tr><tr><td>KH2P<O>sub4</td><td>Fisher</td><td>P386-500</td><td>HL-5 ortamı, SM plakaları ve 10X Fosfat Tamponu hazırlamak için kullanın (adım 1.1-1.3)</td></tr><tr><td>Streptomisin (dihidrostreptomisin sülfat)</td><td>Fisher</td><td>ICN10040525</td><td>HL-5 ortamını hazırlamak için kullanın (adım 1.1)</td></tr><tr><td>Pepton (Bacto)</td><td>Fisher</td><td>DF0118-17-0</td><td>SM plakalarını hazırlamak için kullanın (adım 1.2)</td></tr><tr><td>K2HPO<>sub4</td><td>Fisher</td><td>P288-100</td><td>SM plakalarını hazırlamak için kullanın (adım 1.2)</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td>SM plakalarını hazırlamak için kullanın (adım 1.2)</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher</td><td>M65-500</td><td>DB Arabelleği hazırlamak için kullanın (adım 1.4)</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>DB Tamponu hazırlamak için kullanın (adım 1.4)</td></tr><tr><td>Kafein</td><td>Fisher</td><td>O1728-500</td><td>Kafein hazırlamak için kullanın (adım 1.5)</td></tr><tr><td>cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenozin 3 ft.,5 ft.-siklik Monofosfat, Sodyum Tuzu)</td><td>Fisher</td><td>11-680-1100MG</td><td>cAMP hazırlamak için kullanın (adım 1.6)</td></tr><tr><td>Folik asit</td><td>Sigma</td><td>F7876</td><td>Folik hazırlamak için kullanın asit (adım 1.7)</td></tr><tr><td>Tris bazı</td>: <td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td>3X numune tamponu hazırlamak için kullanın (adım 1.8)</td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166-500</td><td>3X numune tamponu hazırlamak için kullanın (adım 1.8)</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td>3X numune tamponu hazırlamak için kullanın (adım 1.8)</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610610</td><td>3X numune tamponu hazırlamak için kullanın (adım 1.8)</td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Bio-Rad</td><td>1610404</td><td>3X numune tamponu hazırlamak için kullanın (adım 1.8)</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher</td><td>S299-100</td><td>Proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile numune tamponu hazırlamak için kullanın (adım 1.8)</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Fisher</td><td>50-994-911</td><td>Proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile numune tamponu hazırlamak için kullanın (adım 1.8)</td></tr><tr><td>Sodyum pirofosfat dekahidrat</td><td>Fisher</td><td>S390-500</td><td>Proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile numune tamponu hazırlamak için kullanın (adım 1.8)</td></tr><tr><td>Komple EDTA içermeyen proteaz inhibitör kokteyli (Roche)</td><td>Sigma</td><td>11873580001</td><td>Proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile numune tamponu hazırlamak için kullanın (adım 1.8)</td></tr><tr><td>Latrunculin A</td><td>Enzo Yaşam Bilimleri</td><td>BML-T119-0100</td><td>Latrunculin A'yı hazırlamak için kullanın (adım 1.9)</td></tr><tr><td>% 4-15 Tris-HCl poliakrilamid jel</td><td>Bio-Rad</td><td>3450029</td><td>İmmünoblotlama için kullanın (adım 3.3)</td></tr> <tr><td>Poliviniliden florür membran</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td>İmmünoblotlama için kullanın (adım 3.3)</td></tr> <tr><td>Fosfo-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Tavşan antikoru</td><td>Hücre Sinyali</td><td>2060</td><td>İmmünoblottasyonda kullanım için birincil antikor (adım 3.3)</td></tr> <tr><td>Fosfo-p44 / 42 MAPK (Erk1 / 2) (Thr202 / Tyr204) ( D13.14.4E) XP antikoru</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>4370</td><td>İmmünoblotlamada kullanım için birincil antikor (adım 3.3)</td></tr><tr><td>Tavşan IgG HRP Bağlantılı Bütün Ab (Eşekten)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>İmmünoblottasyonda kullanım için ikincil antikor (adım 3.3)</td></tr><tr><td>Geliştirilmiş kemilüminesans substratı (Clarity Western ECL Substrate)</td><td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td>İmmünoblotlama için kullanın (adım 3.3)</td></tr><tr><td>Sıyırma tamponu (Restore Plus Western leke sıyırma tamponu)</td><td></td><td>İmmünoblotlama için Pierce PI46430 Kullanımı (adım 3.3)</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue</td><td>Fisher</td><td>PI20278</td><td>İmmünoblotlama için kullanın (adım 3.3)</td></tr><tr><td>K. aerogenes suşu (patojenik olmayan)</td><td>Dicty Stock Center (dictybase.org)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>Materials and Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital çalkalayıcı (model G-33 veya karşılaştırılabilir bir alternatif)</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Grow K. aerogenes (adım 2.1.1) ve D. discoideum hücrelerini bazalat etmek ve uyarmak (adım 3). Bu çalkalayıcı için dönme yarıçapı 9,5 mm'dir.</td></tr><tr><td>10 cm Petri kabı</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>SM plakalarını hazırlamak için kullanın (adım 1.2)</td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Fisher</td><td>02-671-51B</td><td>D. discoideum hücrelerini saymak için kullanın (adım 2.1.2)</td></tr><tr><td>35 mm çanak (Corning Falcon Kolay Kavramalı Doku Kültürü Kabı)</td><td>Fisher</td><td>08-772A</td><td>Mekanik stimülasyon için D. discoideumhücreleri plakalamak için kullanın ve ardından hücre lizisi yapın (adım 3.1.1)</td></tr><tr><td>Polistiren kap (5 mL)</td><td>VWR</td><td>13915-985</td><td>Kemoatraktan ile D. discoideum hücre süspansiyonunu uyarmak için kullanın (adım 3.2.2)</td></tr><tr><td>Pompalı akışkan ünitesi (ibidi Pompa Sistemi)</td><td>Ibidi</td><td>10902</td><td>Bir kanaldaki D. discoideum hücrelerine mekanik stimülasyon sağlamak için kullanın (adım 4.1, 4.2 ve 5)</td></tr><tr><td>Kanallı kaydırın (&mu;-Slayt III 3'ü 1 arada ibiTreat: #1.5 polimer lamel, doku kültürü ile tedavi edilmiş, sterilize edilmiş)</td><td>Ibidi</td><td>80316</td><td>Akışkan bir cihaz tarafından sağlanan mekanik stimülasyon için D. discoideum hücrelerini plakalamak için kullanın (adım 4.1, 4.2 ve 5)</td></tr><tr><td>50 mL rezervuarlar (Akışkan Ünite için Ibidi Rezervuar Tutucu)</td><td>Ibidi</td><td>10978</td><td>Bir kanaldaki D. discoideum hücrelerine mekanik stimülasyon sağlamak için akışkan cihazı kurmak için kullanın (adım 4.1, 4.2 ve 5)</td></tr><tr><td>Akışkan ünite için hatlar (Perfüzyon Seti SARI ve YEŞİL)</td><td>Ibidi</td><td>10964</td><td>Bir kanaldaki D. discoideum hücrelerine mekanik stimülasyon sağlamak üzere akışkan cihazı ayarlamak için kullanın (adım 4.1, 4.2 ve 5). Not: İki çizgi 1,6 mm borudan da kesilebilir (katalog numarası 10842).</td></tr><tr><td>Drenaj hattı (1,6 mm iç çap boru)</td><td>Ibidi</td><td>10842</td><td>Bir kanaldaki D. discoideum hücrelerine mekanik stimülasyon sağlamak üzere akışkan cihazı ayarlamak için kullanın (adım 4.1, 4.2 ve 5).</td></tr><tr><td>40X/1.3 yağ objektifi ve 20X/0.3 hava objektifi (veya benzer bir alternatif) ile donatılmış Zeiss Observer.Z1 ters</td><td></td> mikroskop <td>Faz kontrastı veya floresan aydınlatmalı hücreleri D. discoideum görüntülemek için kullanılır (adım 4 ve 5</td>)40&x;/1.25&ndash ile donatılmış UltraView eğirme diski konfokal mikroskop;<td></td></tr><tr><td> 0.75 yağ objektifi (veya karşılaştırılabilir bir alternatif)</td><td>Perkin-Elmer</td><td>DM 16000</td><td>D. discoideum hücrelerini görüntülemek için kullanılan bir alternatif (adım 4.1.4)</td></tr><tr>Eppendorf InjectMan <td>Eppendorf</td><td>5252000021D ve 5192000027</td> <td>ile FemtoJet Mikroenjektör (Eppendorf; model 5247 veya karşılaştırılabilir bir alternatif)</td><td>Bir mikropipet ile D. discoideum hücrelerine mekanik stimülasyon sağlamak için kullanın (adım 4.3). Not: katalog numarası, ekipmanın en yeni sürümü içindir (4i).</td></tr><tr><td>Mikropipet (Femtotip; 1 & mu; m dış çap, 0,5 & mu; m iç çap )</td><td>Eppendorf</td><td>930000035</td><td>D. discoideum hücrelerine bir mikropipet ile mekanik stimülasyon sağlamak için kullanın (adım 4.3)</td></tr><tr><td>Mikro yükleyici uçları (Eppendorf Femtotips Femtojet Mikroenjektör için Mikro Yükleyici Uçları)</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>Mikropipeti (femtotip) tamponla doldurmak için kullanın (adım 4.3.1)</td></tr><tr><td>1 kuyulu hazne (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Odacıklı Kapak Camı)</td><td>Fisher</td><td>12-565-472</td><td>Bir mikropipet tarafından sağlanan mekanik stimülasyon için D. discoideum hücrelerini plakalamak için kullanın (adım 4.3.2)</td></tr><tr><td>8 oyuklu oda (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Odacıklı Kapak Camı)</td> <td>Fisher</td><td>12-565-338</td><td>Toplu tampon ilavesi ile sağlanan mekanik stimülasyon için D. discoideum hücrelerini plakalamak için kullanın (adım 4.4.1)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Analiz Yazılımı (Fiji)</td><td>NIH</td><td>https://fiji.sc/</td> <td>Mekanik stimülasyona yanıtı ölçmek için kullanın (adım 4.5)</td></tr><tr><td>Migrasyon analiz yazılımı (İzleme Aracı PRO)</td><td>Gradientech</td><td>http://gradientech.se/tracking-tool-pro/</td> <td>Hücre hızını ve kalıcılığını ölçmek için kullanın (adım 5.4)</td></tr></tbody></table>

dictyostelium discoideum yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Kemotaksis, ya da bir chemoattractant kadar Degrade geçiş en iyi anlaşılmış, yönlendirilmiş geçiş modudur. Sosyal amip kullanarak çalışmalar ortaya Dictyostelium discoideum paralel yollar karmaşık sinyal iletim ağı chemoattractants cevaben güçlendirir ve önyargılı aktin polimerizasyon ve çıkıntı bir pseudopod yol açar degradenin yönünü. Buna ek olarak, diğer türleri, örneğin, yönlendirilmiş göç akışı veya elektrik alanları, yamultmak için maruz kalma nedeniyle sürüş moleküler mekanizmaları bilinmemektedir. Kemotaksis birçok düzenleyiciler, yerelleştirme ya da harekete geçirmek bir chemoattractant ile küresel stimülasyon sonrasında geçici değişiklikler gösterir yanı sıra, yerelleştirme önde gelen veya geçirme bir hücrenin ahşap kaplama kenarı sergilemek. Moleküler mekanizmalar yönlendirilmiş göç diğer türleri anlamak için hücresel yanıt-e doğru akış yamultmak için kısa (2-5 s) pozlama dayalı akut mekanik stimülasyon incelenmesi sağlayan bir yöntem geliştirdi. Bu uyarımı hücreleri tek hücre davranışı incelemek için biyosensörler fluorescently etiketli ifade görüntüleme sırasında bir kanal olarak teslim edilebilir. Ayrıca, hücre nüfus bir tabak, lysed ve immunoblotted ilgi proteinlerin etkin versiyonlar tanımak antikorları kullanarak teşvik. Her iki deneyleri birleştirerek, bir moleküller hücre altı Yerelleştirme ve/veya fosforilasyon değişikliklerden aktif geniş bir dizi inceleyebilirsiniz. Bu yöntemle akut mekanik stimülasyon kemotaktik sinyal iletim ve aktin sitoiskeleti ağları aktivasyonu tetikler belirledi. Başlatan olaylar kesme akış kaynaklı hareketliliği için gerekli anlamak için önemli hücresel yanıt akut mekanik uyarılması için incelemek için yeteneğidir. Bu yaklaşım da kemotaktik sinyal iletim ağ chemoattractant reseptör karıştırıcı etkisi olmadan çalışmak için bir aracı sağlar.

Zamansal kemotaksisi düzenleyiciler cevaben akut mekanik stimülasyon
D. discoideum hücre mekanik stimülasyon yanıtı değerlendirmek için yapisan toplama yetkili hücreleri için kesme akımı nabız kısa maruz bırakıldı. Toplama yetkili D. discoideum hücreler hücreleri komşu tarafından hissedilen kampı salgılar. Hücre-hücre sinyallemesi katkı üstesinden gelmek için hücreleri gozlemler cyclase D. discoideum için...

Burada akut mekanik stimülasyon hücresel yanıt değerlendirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Mikroskopi tabanlı tahlil fluorescently etiketli biyosensörler kesme akışı ile kısa stimülasyon takip yerelleştirilmesini inceleyin. Ayrıca akut mekanik stimülasyon karşılık olarak ilgi çeşitli proteinlerin aktivasyonu biyokimyasal olarak test ediyoruz.

Dictyostelium discoideum yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Bu prosedürün genel amacı, kısa mekanik bozulmayı takiben hücre içi sinyal iletim ağının çeşitli bileşenlerinin aktivitesini incelemektir. Bu yöntem, hücrelerin mekanik uyaranlar da dahil olmak üzere çeşitli çevresel ipuçlarını nasıl algıladığı ve bunlara doğru yönlü olarak nasıl göç ettiği gibi hücre göçü alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, motilite veya polaritenin yanıta kafa karıştırıcı katkısı olmadan mekanik uyarana ilk tepkinin incelenmesine izin vermesidir.Bu yöntem için ilk olarak, hafif bir ajitasyonla verilen kemoatraktana yapışık hücrelerin tepkisini test ettiğimizde ve araç kontrolü ile uyarılan hücrelerin sağlam bir tepkisini fark ettiğimizde aklımıza geldi. Başlamak için, donmuş stoktan az sayıda hücreyi antibiyotik olmadan HL5 ortamına aşılayarak Klebsiella aerogenes'i hazırlayın ve kültürü gece boyunca inkübe edin. Klebsiella aerogenes bakterilerinin varlığında Dictyostelium'un büyümesi, makropinozomların sayısını azaltacak ve bu da hücrenin dış uyaranlara yanıt verme yeteneğini artıracaktır.Deneyi, bakteriler hazır olduğunda, katlanarak büyüyen Dictyostelium olacak şekilde zamanlayın. Bu Dictyostelium hücrelerini toplayın ve bir hemositometre kullanarak sayın. Daha sonra, 100.000 Dictyostelium hücresi içeren 260 mikrolitre bakteri süspansiyonunu bir SM plakasına yayın.Ayrıca sigorta için, iki kat daha fazla ve yarısı kadar Dictyostelium hücresi içeren plakalar hazırlayın. Oda sıcaklığında bir günlük büyümeden sonra, plakayı ters çevirin ve Dictyostelium hücreleri bakteri çimini temizlemeye başlayana kadar ancak henüz toplanmaya başlamayana kadar plakayı kültürlemeye devam edin. Ardından, plakaya beş mililitre DB tamponu ekleyin ve bir cam yayıcı kullanarak Dictyostelium'u kazıyın.Hücreleri ve çözeltiyi 50 mililitrelik bir polipropilen tüpe aktarın, ardından plakayı beş mililitre DB ile durulayın ve bunu 50 mililitrelik tüpe ekleyin. Gerekirse tekrarlayın. Dictyostelium'u yıkamak için, tüpü DB ile 50 mililitreye kadar doldurun, hücreleri pelet haline getirin ve ardından süpernatanı aspire edin ve atın.Süpernatan berraklaşana kadar hücreleri tekrar tekrar yıkayın. Son olarak, DB tamponundaki Dictyostelium'u mililitre başına yaklaşık beş milyon hücreye yeniden askıya alın. Başlamak için, iki mililitre DB ile 35 milimetrelik tabaklara iki milyon toplama yetkin Dictyostelium yerleştirin. Her zaman noktası için bir plaka ve uyarılmamış bir kontrol hazırlayın.Oda sıcaklığında, hücrelerin plakaya yapışması için 10 dakika bekleyin. Ardından, bağlanmamış hücreleri bir mililitre DB ile iki durulama kullanarak plakadan yıkayın. Plakalar bağlanmamış Dictyostelium'dan temizlendikten sonra, bağlı hücreleri plakaları rahatsız etmeden 30 dakika boyunca bazolasyon tamponunda inkübe edin. Hücrelerin erken uyarılmasını önlemek için yarım saatlik inkübasyon sırasında plakaların herhangi bir hareketinden kaçınmak çok önemlidir.Şimdi, kontrollü bir miktarda mekanik stimülasyon uygulamak için, bir plakayı ayrı ayrı bir orbital çalkalayıcıya aktarın ve çalkalayıcıyı beş saniye boyunca 150 rpm'de çalıştırın. Ardından, istenen süreden sonra, tamponu aspire edin ve plakayı hemen buzun üzerine koyun. Hemen proteaz ve fosfataz inhibitörleri içeren 100 mikrolitre numune tamponu ekleyin ve hücreleri kazıyın.Lizatı 1,5 mililitrelik tüplere toplayın ve hemen 95 derecede 10 dakika ısıtın. Lizatı analiz etmeye devam edin veya saklamak için eksi 20 santigrat dereceye aktarın. Vejetatif veya agregasyona yetkin hücrelerin süspansiyonlarını yaptıktan sonra, mikroakışkan oda kızağına yaklaşık 600 mikrolitre yükleyin.Girişler tamamen doldurulmalıdır, bu nedenle gerekirse tampon ile doldurun. Hücrelerin 10 dakika bağlanmasına izin verin. Cihaz için bir giriş hattını 15 mililitre rezervuarlı bir elektronik pompaya bağlayın.Pompa için yazılım kontrolünü kullanarak vanayı kapatın ve ardından rezervuarı DB ile doldurun. Şimdi basıncı 50 milibar'a ayarlayın ve pompayı açın. Açmak için vanaya tıklayarak hattı DB ile doldurun ve durulayın. Yaklaşık 30 saniye duruladıktan sonra basıncı tekrar sıfıra getirin ve ardından valfi kapatın.Ardından, hattı slaydın bir tarafındaki üç girişten birine bağlayın. Herhangi bir hava kabarcığı tutmayın ve bağlantı yapıldıktan sonra sürgünün o tarafındaki diğer iki girişi kapatın. Şimdi, tahliyeden gelen hattı sürgünün karşı tarafındaki tek çıkışa bağlayarak kurulumu tamamlayın.Ardından, floresan mikroskopta parlak alan veya faz aydınlatması altında, kanalı 20X hava hedefi ile görüntüleyin ve kanalı durulayın. Ardından, basıncı yaklaşık 50 milibar'a ayarlayın ve valfi açın. Sıvı tahliyeden çıktıktan sonra dış basıncı sıfıra düşürün, yaklaşık 30 saniye bekleyin ve vanayı kapatın.Ardından, 40X yağ hedefine geçin, kanalın en geniş kısmına odaklanın ve yazılımı RFP veya GFP aydınlatması ile her üç saniyede bir görüntü toplayacak şekilde hazırlayın. Valf kapalıyken basıncı istenen değere ayarlayın. Ardından, üç saniyelik aralıklarla beş ön stimülasyon görüntüsü elde edin.Ardından, uyaranı iletmek için valfi kısaca açın. Şimdi, 45 saniye içinde en az 15 kare daha veri toplayın. Yanıtı, metin protokolünde açıklandığı gibi nicelleştirin.İlk olarak, önceki bölümde açıklandığı gibi Dictyostelium ile bir mikroakışkan slayt yükleyin. Bu deney için iki giriş satırı hazırlayın. Hatları kapatmak için, arıtma solüsyonunu taşıyan hat üzerinde fiziksel bir kelepçe ve DB solüsyonunu taşıyan hattı araçla kapatmak için yazılım kontrollü vana kullanın.Şimdi, iki satırı uygun çözelti ile doldurun, tek başına tampon artı araç veya bir inhibitör gibi bir işlemle tamponlayın. Hatlar durulandıktan sonra, bunları kanalla birlikte sürgünün yan tarafındaki iki girişe bağlayın ve kullanılmayan girişi kapatın. Ardından, tahliye hattını karşı taraftaki çıkışa bağlayın.Şimdi, daha önce açıklandığı gibi tampon artı aracı kullanarak sürgüyü yıkayın. Ardından, kanalı tedavi ile doldurun. İlk olarak, akışı sıfır milibara düşürün.Ardından, valfleri değiştirin, tedaviyi yaklaşık 15 saniye boyunca akıtın ve inkübasyonu zamanlamaya başlayın. Her 10 dakikada bir, odadaki oksijen seviyelerini yenilemek için hücrelerin üzerine yaklaşık 15 saniye boyunca taze arıtma solüsyonu akıtın. Yapışık agregasyona yetkin hücreler, bir orbital çalkalayıcı kullanılarak beş saniyelik kesme akışına maruz bırakıldı.Dictyostelium, bazal aktivitelerini azaltmak için kafein ile ön işleme tabi tutuldu. Sonuç olarak, PKBR1 ve ERK2'nin bazal aktivitesi çok düşük ve stimülasyon ile bu kinazların anahtar kalıntılarının fosforilasyonunda güçlü bir artış oldu. Çeşitli floresan etiketli biyosensörleri eksprese eden agregasyona yetkin hücrelerde, PIP3 veya yeni polimerize aktin tarafından işe alınan iki öncü kenar belirteci, PHcrac ve LimE, her ikisi de dinlenme hücrelerinde çoğunlukla sitozolik lokalizasyon gösterdi.Beş saniyelik kesme akışının ardından, bu biyosensörler hızla kortekse yeniden lokalize oldu ve sitozole geri döndü. Aktin depolimerize edici ilaç Latrunculin A'nın etkileri, benzer bir kesme kuvveti deneyi kullanılarak test edildi. Bu durumda, vejetatif hücreler önce kontrol koşullarına maruz bırakıldı ve daha sonra istenen test ajanını içeren tampona geçirildi.Latrunculin A tedavisi, ön kenar belirteçlerinin kortekse yeniden lokalizasyonunu engelledi. Şaşırtıcı bir şekilde, akış iki saniye sonra kapatılmadıysa ve deney süresince açık kaldıysa, yine de geçici bir küresel tepki gözlendi. Küresel tepkiyi takiben, vejetatif hücreler akışa karşı göç etti.Bu tahlillerin başarısı için hücrelerin uygun şekilde hazırlanması son derece önemlidir. Vejetatif hücreler, mekanik stimülasyona yanıt vermelerini sağlamak için bakterilerle birlikte büyütülmelidir. Agregasyona yetkin hücreler için, az veya fazla gelişmiş hücreler zayıf yanıt verme eğilimindedir.Biyokimyasal ve mikroskobik yaklaşımlar birbirini tamamlar ve bu, mekanik stimülasyona tepkileri için çok sayıda sinyal iletim ara ürününü değerlendirmemize izin verir. Farmakolojik ve genetik bozulmaları ekleyerek, mekanik uyaranların nasıl algılandığını ve iletildiğini öğrenebiliriz. Bu, kesme akışı gibi fiziksel uyaranlar tarafından yönlendirilen yönlendirilmiş hücre göçünü anlamak için önemlidir.Mekanik stimülasyon, kemoatraktanlarla aynı sinyal iletim ağının aktivasyonunu tetiklediğinden, artık çeşitli uyaranların hücreler üzerindeki entegrasyonunu inceleyebiliriz. Sonuç olarak, bu çalışmalar, kendi bağışıklık hücrelerimiz ve metastatik kanser hücreleri gibi göç eden hücrelerin vücutta nasıl dolaştığını anlamamıza yardımcı olacaktır.

assessment-dictyostelium-discoideum-response-to-acute-mechanical

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Erişilebilir sinaps elektrofizyoloji Uygulama sinaptik mutantlar analiz yararlı sinaptik aktivite ölçülebilir bir ölçü, sağlar. Bu makale, nöromüsküler kavşaklar (NMJ) ortaya çıkarmak için kullanılan bir diseksiyon yöntemi...

C. Elegans Nöromüsküler Kavşağı Diseksiyon ve kayıt

Bu kağıt kültürü canlı hücreleri mekanik uyarılması için entegre bir atom operasyon okuyucu kuvvet optik görüntüleme mikroskop öğretmeyi hedefliyor. Bir adım-adım protokol sunulmuştur. Mekanik stimülasyonu canlı hücre yanıtı gösteren bir temsilci veri seti sunulmaktadır.

Tümleşik Optik ve Atomik Kuvvet Mikroskobu eğitimi Mekanik Uyarım Canlı Hücre Tepki

Prostat enfeksiyonu kronik prostatit pelvik ağrı arabuluculuk katkıda bulunan bir faktör olabilir. Biz standardize edilmiş bakteriyel inokulum, zamanla farelerde dokunsal allodini ölçmek için erkek farelerde ve metodoloji üretra içine bakteri instilasyon hazırlama prosedürü açıklanmaktadır.

Bakteriyel Prostatit bir fare modelinde Dokunsal allodini Ölçümü

Bir protokol C. anoksi / açlıkla kullanan tarif edilir iskemi / reperfüzyon modeli elegans. Fonksiyonel sonuçlar artmış mortalite, GFP etiketli nöronal süreçleri görünür anormallikleri, ve nöronal fonksiyonu gerektiren bozulmuş davranışsal tepkileri içermektedir.

Iskemi / reperfüzyon içinde bir anoksisi-açlık Modeli<em&gt; C. elegans</em

Bu video, bir in vitro fare kolorektum sinir preparatı üzerinde tek lifli elektrofizyolojik kayıtların yürütülmesi için bir protokolü göstermektedir.

Fare Kolorektal Afferent Endings in vitro Fonksiyonel Karakterizasyonu içinde

C. elegans erkeklerin verimli kalsiyum görüntüleme için bir adapte "koku çip" kullanımı burada açıklanmıştır. Gliserol ve bir feromon erkek maruz çalışmaların da gösterilir.

Yanıt olarak erkek C. Elegans baş nöronlar Feromonlar nöronal aktivite görüntüleme için adapte mikrosıvısal koku kozu kullanımı

Anormal duyusal fonksiyonu altında yatan visseral ağrı ve diğer semptomlar işlevsel ve enflamatuar barsak hastalıkları. Bir ex vivo sıçan colorectum hazırlık kolon afferent sinirlerin Elektrofizyolojik kayıt için bir protokol burada sunulmaktadır.

Vitro Sıçanlarda kolon Afferent liflerinin Elektrofizyolojik özellikleri karakterizasyonu

Mechanobiology araştırma için yeni araçlar nasıl mekanik stres anlamak için gerekli biyokimyasal yollar etkinleştirir ve biyolojik yanıt aydınlığa çıkartıyor. Burada, hücresel tepkilerin yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlayan bir mikrosıvısal tuzak ile immobilize hayvanların seçici mekanik uyarılması için yeni bir yöntem vitrin.

Mekanik stimülasyon ve yüksek çözünürlük görüntüleme C. elegans bir havacilik aygıtı kullanma

Bakteriyel enfeksiyon yapisan hücre hücre dışı matriks sertlik etkisi problama için çok iyi biçim polyacrylamide tabanlı tahlil geliştirdik. Bu tahlil akış sitometresi, immunostaining ve çekiş kuvvet mikroskobu, hücreler, hücre dışı matriks ve patojen bakteriler arasında biyomekanik etkileşimlerin nicel ölçümler için izin ile uyumludur.

Hücre dışı matriks sertlik etkisi yapışık hücreleri bakteriyel enfeksiyon türleri çalışmak için çok iyi Format Polyacrylamide tabanlı tahlil

Mekanik kuvvetler hücre göçlerini kontrol etmek için önemlidir. Bu protokol, hücre yapısı ve göç değişiklikleri ortaya çıkarmak için yerel bir sertlik gradyan ile hücreleri uyarmak için bir cam mikropipette ve bir mikromanipülatör kullanılarak deforme edilebilir elastik hidrojellerin kullanımını göstermektedir.

Hücresel Hareketin Mekanik Kontrolünün Ve İlgili Sinyal Olaylarının Değerlendirilmesi için Tek Hücreli Durotaksis Tsay

Bu protokolün amacı, Drosophila larvalarında mekanik nosiception için geliştirilmiş bir tahlilin nasıl gerçekleştirildiğini göstermektir. Buradaki tahlilleri, Drosophila larvalarında mekanik aşırı duyarlılığın (allodynia ve hiperaljezi) var olduğunu göstermek için kullanıyoruz.

Drosophila Larvalarında Mekanik Nosiception Ölçümü için Geliştirilmiş Bir Tahlil ve Araçlar

Öğrenin Dictyostelium discoideum hücrelerinde akut mekanik stimülasyon yanıtlarını mikroskopi tabanlı analizle değerlendirmeyi. Bu yöntem, hücre göçü ve mekanotransdüksiyon mekanizmalarını hareketlilik etkisi olmadan incelemeye olanak tanır.

Dictyostelium discoideum yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet