İnsan kalp dokusu hücre dışı matriks hidrojel Vitro ve In Vivo uygulamaları için kendi kendine montaj doğru işlenmesi

Bu prosedürün genel amacı, kardiyak hücre dışı matrisi bir hidrojele işlemektir, bu da matrisin çeşitli hücre bazlı tahlillerde etkisinin incelenmesini sağlar. Bu yöntem, hücre dışı matrisin hücre davranışını nasıl etkilediği gibi kardiyak alandaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, in vitro veya in vivo olarak büyük ölçekli deneyler yapmak için hücre dışı matrisin kullanımını kolaylaştırmasıdır.

Bu tekniğin uygulamaları, miyokard enfarktüsü için bir tedaviye doğru genişletilebilir, çünkü matris temel sağkalım ipuçlarını sağlayabilir. Deneye başlamak için, daha önce elde edilmiş bir sol ventrikül miyokarından yağ dokusunu çıkarmak için on numaralı bıçaklı steril bir neşter kullanın. Miyokard'ı bir neşter kullanarak yaklaşık 1 x 1 x 1 cm küpler halinde kesin.

Ardından, küpleri 50 mL'lik steril bir tüpe yerleştirin. Küpleri içeren tüpleri 80 santigrat derecede saklayın. Hazırlanan küpleri içeren tüpü dondurucudan çıkarın ve buz üzerinde kriyostata taşıyın.

Kriyostatın nesne ve oda sıcaklığını 15 santigrat dereceye ayarlayın. Haznedeki boş 50 mL'lik tüpleri ve pulları soğutun. Soğuk damganın üzerine bir kat kriyoseksiyon ortamı ekleyin ve beyaz ve katı olana kadar donmasına izin verin.

İkinci bir kriyoseksiyon ortamı katmanı ekleyin ve ikinci katmana bir miyokard tüpü yerleştirin. Kriyoseksiyon ortamının ve miyokardın tamamen donduğundan emin olun. Ardından, donmuş miyokard içeren damgayı tutucuya yerleştirin ve tüm vidaları sıkın.

Düz bir kesit yüzeyi elde edilene kadar dokunun yüzeyini kesin. Düzgün kesim kesitlerini garanti etmek için donmuş miyokardları otomatik kesitlerle bölümlere ayırın. Bir küpten yaklaşık 30 ila 40 bölüm dilimlenebilir.

Her dilimi, bölümlere ayırdıktan sonra, önceden soğutulmuş 50 mL'lik bir tüpe gevşek bir şekilde yerleştirin. Doldurulmuş tüpleri kapatın ve buzun üzerine yerleştirin. 50 mL'lik tüplerin donmuş kısımlarını tek bir steril behere aktarın.

Miyokard dilimleri içeren 50 mL tüp başına 50 mL lizis çözeltisi ekleyin. Daha sonra, miyokard dilimlerini steril bir beherde çalkalayın. Sıvıyı doku dilimleriyle birlikte kaba bir süzgeçten geçirin.

Daha sonra, doku dilimlerini künt bir cımbızla yeni bir steril behere aktarın. İlk 50 mL miyokard dilimi tüpü başına PBS'de 50 mL% 0.5 SDS ekleyin. Beheri oda sıcaklığında 100-150 rpm'de altı saat boyunca sürekli olarak çalkalayın.

Çalkaladıktan sonra, sıvıyı doku dilimleri ile birlikte kaba bir süzgeçten geçirin. Künt cımbız kullanarak, doku dilimlerini yeni bir steril behere aktarın ve dilimleri 50 mL PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, dilimleri gece boyunca PBS'de,% 1 penisilin streptomisin ve% 1 nistatin ile yıkayın.

Ertesi gün, yıkama solüsyonunu çıkarın ve ilk 50 mL miyokard dilimleri tüpü başına hücreden arındırılmış dilimlere% 1 penisilin streptomisin ve% 1 nistatin ile 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış 25 mL FBS ekleyin. Matristen kalan DNA'yı çıkarmak için dilimleri 37 santigrat derecede üç saat inkübe edin. Daha sonra dilimleri yeni bir steril behere aktarın ve 50 mL PBS ile üç kez yıkayın.

ECM dilimlerini yeni bir steril altı kuyulu plakaya gevşek bir şekilde yerleştirin. ECM'yi 80 santigrat derecede dondurun ve bir liyofilize içinde iki gün boyunca liyofilize edin. ECM diliminin toz haline getirilmesi için 1,4 mm seramik boncuklar içeren freze boruları kullanın.

Steril, künt cımbız kullanarak tüpleri liyofilize ECM ile gevşek bir şekilde doldurun. Tüpleri sıvı nitrojen içinde dondurun. Dondurulmuş boruları freze makinesine yerleştirin ve ECM'yi toz haline getirin.

Süreyi 30 saniye olarak ayarlayın, maksimum hızı ayarlayın ve cihazı başlatın. Toz haline getirdikten sonra, tüpleri çıkarın ve tekrar sıvı nitrojen içinde dondurun. Tüp başına 1 mL ddH20 ekleyerek mikropartikülleri tüplerden yıkayın ve tam çözünme için çalkalayın.

Daha sonra, heterojen çözeltiyi 200 mikrometre ağından 50 mL'lik bir tüpe süzün. Tüpü sıvı nitrojen içinde dondurun. Tozun tüpten dışarı akmasını önlemek için standart tüp kapağını 0.22 mikrometre filtre ile değiştirin.

Tüpü liyofilizatöre yerleştirin ve suyu yıkama adımından çıkarmak için tekrar liyofilize edin. Önceden hazırlanmış liyofilize insan ECM tozunu pepsin çözeltisi içinde, mL başına 10 mg'lık bir nihai konsantrasyona çözün. Çözeltiyi, tüp başına 1 mL hacimli 2 mL tüplere aktarın.

İyice karıştırmak için çözeltiyi pipetleyin. Ardından, tüpleri çalkalayıcıya yerleştirin ve 27 santigrat derecede 48 saat boyunca 1200 rpm'de çalkalayın. Tüpleri çalkalayıcıdan çıkarın ve buzun veya önceden soğutulmuş bir tüp tutucunun üzerine yerleştirin.

Soğuk 10X PBS'nin ECM çözeltisinin hacminin 1/9'unu, soğuk 0.1 molar sodyum hidroksitten oluşan ECM çözeltisinin 1/10'u ile önceden soğutulmuş bir tüpte karıştırın ve sindirilmiş ECM çözeltisini nötralize etmek ve pepsini etkisiz hale getirmek için buzun üzerine yerleştirin. Son olarak, ECM çözeltisini nötralizasyon karışımına ekleyin ve pipetleme veya girdaplama yoluyla iyice karıştırın. Bireysel ECM bileşenleri için kantitatif tahliller, tek başına SDS ile hücreden arındırmaya kıyasla daha eksiksiz bir DNA uzaklaştırması ve toplam kollajen, elastin ve glikosominoglikanların daha iyi korunduğunu ortaya koydu.

RT-PCR, spontan farklılaşma geçiren Murine ESC'de yapısal kardiyomiyosit proteinlerinin, erken ve geç kardiyomiyojenik transkripsiyon faktörlerinin ve endotel hücrelerinin yüzey marker genlerinin ekspresyonunu ölçmek için kullanıldı. cECM ile temas, pluripotent kök hücreleri, tercihen kardiyomiyosit benzeri bir fenotipe doğru yönlendirir. Faz kontrast ışık mikroskobu, cECM'nin 48 saat boyunca enzimatik sindiriminin daha homojenize bir ECM çözeltisi ile sonuçlandığını göstermektedir.

İnsan kardiyak fibroblastlarının cECM hidrojel üzerinde canlı / ölü boyanması, canlılığın arttığını gösterir. Hem cECM mikropartikülleri hem de cECM hidrojeli, standart kültürdeki hücrelere kıyasla iskemik koşullarda kasılma HL-1 hücrelerinin metabolik aktivitesini arttırır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa, dokudan hidrojele kadar bir hafta içinde yapılabilir.

Geliştirildikten sonra, bu teknik, kardiyak rejenerasyon alanındaki araştırmacıların, in vitro ve in vivo model sistemlerde kardiyak hücre dışı matrisin etkilerini keşfetmelerinin yolunu açtı.