4.3: Mitozisin Canlı Hücre Görüntülemesi

Mitoz, hücre döngüsü sırasında meydana gelen nükleer içeriğin yüksek düzeyde organize ve kontrollü bir şekilde bölünmesidir. Mitoz, uygun organizma gelişimi ve doku büyümesi, bakımı ve onarımı için temel olarak önemlidir. Kanser gibi bazı hastalıklarda bu sürecin bozulması belirtilmiştir. Hızlandırılmış floresan mikroskobu ile canlı hücre görüntüleme, günümüzde laboratuvarlarda mitoz bölünmeyi incelemenin en yaygın yöntemlerinden biridir.

Bu videoda, mitozun aşamalarını kısaca tanıtacağız ve ardından bu hücresel sürecin canlı hücre görüntülemesi için deneysel hususları tartışacağız. Ayrıntılı bir veri toplama ve analiz protokolü gösterilecek ve bu tekniğin birkaç uygulamasıyla sonuçlandıracağız.

Bilim adamlarının bu görüntüleme deneylerinde ne aradıklarını daha iyi anlamak için önce mitozun aşamalarını inceleyelim.

Hücre döngüsü, genel hücre büyümesi ve bölünme sürecini tanımlar. Mitotik faz, bu döngünün kısa bir bölümünü temsil eder ve bu kısım altı faza ayrılabilir: profaz, prometafaz, metafaz, anafaz, telofaz ve sitokinez.

Profaz sırasında, DNA, sentromerde birleşen kardeş kromatitlere yoğunlaşır. Sitoplazmada, sentrozom olarak adlandırılan iki ana organel, mikrotübül yapılarını (yaygın olarak iğ lifleri olarak bilinir) tekerlek benzeri bir düzende bir araya getirmeye başlar.

Bir sonraki aşama olan prometafaz, nükleer zarın parçalanmasını ve sentromerlerde kinetokol olarak bilinen bir protein kompleksinin montajını görür. Bu aşama aynı zamanda iğ liflerinin kinetokol ile bağlanmasına da tanık olur.

Metafazda, kromozomlar, iki sentromerden eşit uzaklıkta hayali bir düzlem olan metafaz plakasında sıralanır. Anafaz sırasında, kromozomlar sentromerde "parçalanır" ve bireysel kardeş kromatitler hücrenin zıt uçlarına göç eder. Telofazda, mitotik iğ sökülür ve kromatin yoğunlaşmaya başlar. Son olarak, sitokinez sırasında - "bölünme karıkını" oluşturan bir aktin / miyozin halkasının kasılması yoluyla - ana hücre iki yavru hücreye bölünür.

Mitotik ilerlemenin bu anlayışıyla, canlı hücre görüntüleme kullanarak bu süreci görüntülemek için pratik hususlara bir göz atalım.

Sorulması gereken ilk soru şudur: mitozu görselleştirmek için hücreler nasıl etiketlenir? Bu deney için en yaygın olarak kullanılan "etiketler", bir dalga boyunda ışığı emen ve başka bir dalga boyunda ışık yayan floresan molekülleridir.

Nükleik asitleri etiketlemek için, Hoechst gibi hücre geçirgen bir DNA bağlayıcı boya kullanılabilir. Mikrotübüller gibi proteinleri etiketlemek için, floresan etiketli antikorlar kullanılabilir. Bunlar genellikle membran geçirimsizdir ve bu nedenle numunelere yerleştirmek için mikroenjeksiyon teknikleri kullanılır.

Başka bir strateji, hücrelerin, kromozomlar gibi mitozda aktif olarak yer alan bileşenleri etiketleyen floresan etiketli proteinleri ifade etmek için manipüle edilebildiği genetik etiketlemedir. Floresan moleküllerle çalışırken, fotoağartmayı önlemek için aşırı ışığa maruz kalmaktan kaçınmalısınız.

Doğru mikroskobu seçmek de aynı derecede önemli bir karardır. En sık kullanılan iki mikroskop epifloresan ve konfokaldir. Epifloresan veya geniş alan mikroskobu, ışığı tüm görüş alanı boyunca geçirirken, konfokal mikroskopi, ışığı tek noktalara odaklamak için lazerler kullanır.

Epifloresan mikroskoplar tipik olarak daha ucuz olsa da, nokta aydınlatması daha yüksek optik çözünürlük sağlayarak daha net görüntüler ürettiği için konfokal mikroskoplar tercih edilir. Tek aydınlatma noktası ayrıca fototoksisiteyi veya aşırı ışığa maruz kalmanın neden olduğu hücre ölümünü artırır.

Artık bazı deneysel hususları gözden geçirdiğimize göre, mitozu görselleştirmek için canlı hücre görüntüleme deneyinin nasıl yürütüleceğini görelim.

Hücreler, mitozun en iyi şekilde görselleştirilmesini sağlayan cam tabanlı tabaklar veya lameller üzerinde kültürlenmelidir. Daha sonra, etiketleme yapılana kadar kontrollü bir ortamda tutulmalıdırlar. Daha önce de belirtildiği gibi, etiketleme tekniğinin seçimi eldeki deneye bağlıdır. Etiketlemeden sonra, hücre kültürü kabını mikroskop üzerindeki özel odaya yerleştirin. Bu, görüntüleme sırasında hücre kültürü koşullarının korunmasına izin verir.

Daha sonra, etiketleme molekülüne bağlı olarak, mikroskopta uyarma ve emisyon dalga boylarını ayarlayın. Veri toplama için, görüntü yakalama için zaman noktalarını ve konumu ayarlayın. Bu bağlamda, zaman noktaları, tüm mitotik aşamalar için tam görsel kapsama sağlamak için görüntülerin elde edileceği durumlardır. Pozisyonlar, kültür çanağı üzerindeki XY koordinatlarını ifade eder. Ek olarak, her konum için farklı alan derinliklerinde görüntüler elde edilebilir. Her görüntü, Z ekseninde optik bir dilimi temsil eder. Bu nedenle, topluca Z-yığınları olarak bilinirler. Tüm parametreleri girdikten sonra ayarları test edin ve ardından arkanıza yaslanın ve keyfini çıkarın!

Hızlandırılmış verileri elde ettikten sonra, bunu sunmanın birkaç yolu vardır. Bu yollardan birkaçını tartışalım.

Montaj, birden fazla görüntünün zamana dayalı olarak ızgara benzeri bir düzende dizildiği, hızlandırılmış verileri sunmanın en yaygın yollarından biridir. Bunlar mitotik ilerlemeyi açıkça gösterebilir ve araştırmacıların bireysel mitotik fazlarda geçirilen zaman gibi bilgileri belirlemesine izin verebilir. Bir "film" yapmak için bu görüntüleri sırayla birleştirmek daha dinamik bir sunum olabilir.

Son olarak, konfokal bir mikroskop kullanılarak elde edilen Z-yığınları, bir numunenin 3 boyutlu bir rekreasyonunu sunmak için birleştirilebilir. Bu, mitotik makinenin parçaları arasındaki uzamsal ilişkileri doğru bir şekilde ortaya çıkarabilir. Bu önemlidir, çünkü 2D'de yan yana görünen bileşenler aslında üç boyutta birbirinden çok uzak olabilir.

Artık canlı hücre görüntüleme deneyinin nasıl yürütüleceğini bildiğinize göre, bu tekniğin bazı uygulamalarını gözden geçirelim.

Mitoz, gelişimin önemli bir parçasıdır. Burada araştırmacılar, nöral progenitör hücrelerde mitozu gözlemlemek için embriyonik fare beyinlerini izole ettiler. Bu hücrelerin kontrollü bölünmesi, uygun beyin büyümesi ve işlevi için kritik öneme sahiptir. İzolasyonu takiben, beyinler bir vibratom kullanılarak kesitlere ayrıldı, membran geçirgen nükleik asit bağlayıcı boya ile boyandı ve nöral progenitör hücrelerin mitozunu net bir şekilde görselleştirmek için konfokal mikroskopi ile görüntülendi.

DNA onarımı, hücre büyümesi ve bölünmesinde rol oynayan kritik bir hücresel süreçtir. Bu deneyde araştırmacılar, DNA hasarına yanıt olarak oluşturulan noktasal noktalar olan odakları oluşturan bir DNA onarım proteini üzerinde çalıştılar. Canlı hücre görüntüleme ve 3D analiz sonuçları, hücre bölünmesi süreci boyunca DNA onarım proteininin lokalizasyonunu vurguladı.

Son olarak, araştırmacılar, bölünme devam etmeden önce hücresel koşulların değerlendirildiği "duraklama" noktaları olan mitotik kontrol noktalarını inceler. Mitozda, mil montaj kontrol noktası veya SAC, mitotik iğ ile kromozomlar arasında uygun bağlantı sağlar. Bunu incelemek için, bilim adamları SAC indükleyen reaktifleri transgenik sinek embriyolarına mikroenjekte ettiler ve canlı hücre görüntüleme kullanarak mitozu analiz ettiler. Sonuçlar, mitoz boyunca ilerleyemeyen hücreleri gösteren tutuklanmış kinetokorları göstermektedir.

Az önce JoVE'nin mitozun canlı hücre görüntülemesi hakkındaki videosunu izlediniz. Mitozun aşamalarına bir girişin ardından, bu videoda canlı hücre görüntüleme için önemli hususlar ve veri analizi teknikleri tanıtıldı. Son olarak bu tekniğin uygulamaları sunulmuştur. Canlı hücre görüntüleme, bilim adamlarına gelişim, doku bakımı ve hastalıkla ilgili mitotik mekanizmaları anlamada önemli ölçüde yardımcı olmuştur. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!