Name: Kordon kan kaynaklı CD34 megakaryocyte farklılaşma ve trombosit oluşumu insan+ hücreleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Öğrenin, kordon kanından CD34+ hücre izolasyonu ve megakaryosit farklılaşması için güvenilir bir yöntem. Bu teknik, trombosit biyolojisi ve hematoloji alanındaki araştırmaları destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Avustralya sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (grant 1012409 BHC için bağlı proje) desteğiyle kabul etmiş oluyorsunuz.

Bu iletişim kuralı Güney Doğu Sydney insan araştırma Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve University of New South Wales insan araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Göbek Kordon kanı sağlıklı bağış elde Sydney Kordon Kanı Bankası tarafından (Sydney, NSW, Avustralya) sağlandı. Yaklaşık 100 mL hacimli bu yordam için kullanılmıştır.
Not: Sınıf II Biyogüvenlik aseptik teknik kullanılarak kabine çalışmaz. Kordon kan torbası % 70 etanol ile dış dezenfekte etmek. Steril aletlerin (makas, cımbız) için bu yordamı kullanın.
1. kordon kan hücresi hazırlık ve CD34 yalıtım+ hücreleri
<ol>
	<li>Steril ayrılık arabellek (SB) fosfat tamponlu tuz (PBS) ile pH 7.2 ve içeren % 0.5 sığır serum albümin ve 2 mM EDTA, hazır olun.</li>
	<li>SB 10 mL (bir tüp 10 mL kan başına gereklidir) 50 mL konik tüp içine dağıtmak. Bir 10 mL şırınga monte G18 künt iğne kullanarak, 10 mL kan çantasından çizmek ve SB 10 mL içeren 50 mL tüpler içine dağıtmak.</li>
	<li>Lenfosit ayrılık medya ( Tablo malzemelerigörmek) 15 mL tüp iki katman oluşturma seyreltilmiş kan içeren altýna ekleyin. Not: medya yavaş yavaş farklı katmanları karıştırma önlemek için tüp altındaki dağıtmak.</li>
	<li>Tüpler, 1200 × g (RT) oda sıcaklığında 30 dakika santrifüj kapasitesi yok break ve hiç ivme ile.</li>
	<li>Aktarım katmanı içeren mononükleer hücreler (yaklaşık 5-10 mL her tüp) Pasteur pipet kullanarak yeni 50 mL tüp tüp merkezine yakın. SB her tüpün toplam hacmiyle 50 mL ekleyin.</li>
	<li>400 × g RT. atma, 10 min için de süpernatant santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Askıya alınan hücrelerin hücre topakları SB. birleştirin 5-10 ml Pasteur pipet ile dikkatli bir şekilde resuspend ve 50 mL ile SB ses getirmek.</li>
	<li>Trypan mavi boyama ve bir hemasitometre kullanarak veya otomatik hücreleri hesaplama counter ( Tablo malzemelerigörmek) hücre. CD34 yüzdesini belirlemek için+ örnek, resuspend 2.5 × 105 100 µL SB ve leke hücrelerde 4 ° C'de anti-CD34-PE antikor için 15-30 dakika 10 µL ekleyerek hücreleri Akış Sitometresi (şekil 1A) tarafından analiz.</li>
	<li>Santrifüj tüpleri 4 ° C'de 10 dakika için 400 × g de Süpernatant atmak. Not: Eğer değilse hemen gerekli, mononükleer hücreler bu aşamada donmuş olabilir.</li>
	<li>SB 300 µL 108 hücre başına hücrelerde resuspend. FcR insan IgG 100 µL ekleyin (Reaktif, engelleme bkz: Malzemeler tablo) ve CD34 manyetik boncuklar 108 hücre başına 100 µL. Karışımı yavaşça ve 30-40 dk 4 ° C'de kuluçkaya. Not: Bir tek hücre süspansiyon gereklidir (gerekirse, hücreleri yine de 30 µm filtre reaktifler eklemeden önce geçmek). Burada açıklanan 108 hücreler için veya daha az reaktif birimler kullanın. 10'dan fazla8 hücreler için buna göre reaktifleri (SB, çözüm ve CD34 manyetik boncuklar engelleme) ölçeklendirin.</li>
	<li>LS ayrılık sütun kuluçka döneminde LS sütun bir manyetik tutucu içinde yerleştirerek ve atık SB. atma 3 mL ile yıkama hazırlayın. Not: LS ayrılık sütunları ilâ 2 × 108 toplam hücreleri ile yüklenebilir. Küçük ve büyük sütunlar kullanılabilir.</li>
	<li>5-10 mL SB hücre karışıma ekleyin ve 10 dakika süreyle 400 × g, santrifüj süpernatant atın.</li>
	<li>Hücreleri SB 1.5 ml resuspend ve LS sütun üzerine hücre süspansiyon (1,5 mL) yükleyin. 15 mL toplama tüp (negatif kesir #1) etiketlenmemiş hücreleri içeren aracılığıyla akış toplamak. Sıvı drenaj ve sütun SB 1,5 mL ile yıkamak izin.</li>
	<li>(3 mL) ile toplanan akışı sütuna geri yüklemek ve aynı 15 mL toplama tüp (negatif kesir #1) aracılığıyla akış toplamak. LS sütun 3 kez SB 3 mL ile yıkayın. Not: gerekirse, negatif kesir (12 mL) hücrelerde CD34 yakalanması tespit etmek için anti-CD34 antikoru ile Boyanabilen+ hücreleri tarafından LS sütun.</li>
	<li>Sütun manyetik ayırıcı kaldırın ve hücrelerin yavaş yavaş şırınga lavabo pompası ile SB 2 mL ile yeni bir 15 mL tüp içine boşalt.</li>
	<li>Sütun geri manyetik ayırıcı ve yük hücreleri 2 mL sütuna yerleştirin. Aracılığıyla akış toplamak ve 2 mL SB ile yıkayın. Bu negatif kesir #2 (4 mL) olduğunu.</li>
	<li>Manyetik ayırıcı LS sütun kaldırın ve 2 mL SB. Flush hücre sürekli ve sıkıca ekleyin CD34 toplamak için enjektör pompası ile+ hücre kesir. Trypan mavi boyama ve bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri saymak.</li>
	<li>Santrifüj tüpü ile 400 × g 4 ° C'de 15 dakika de olumlu kesir Süpernatant atmak. CD34 için serum-Ücretsiz medya hücrelerde resuspend+ hücreleri (SFM, Tablo malzemelerigörmek). Not: Eğer değilse hemen gerekli, hücreler sıvı azot içinde bu aşamada donmuş olabilir.</li>
</ol>
2. saflık denetimi izole CD34+ hücreleri
<ol>
	<li>Pozitif kesir 10 µL anti-CD34-PE antikor ve 20 µL anti-CD45-PerCP antikor 4 ° c (ayrı bir tüp kullanımı izotip denetimleri) 15 dakika ile 2 x 104 hücrelerden leke (şekil 1B).</li>
	<li>SB yıkamak için 1 mL ekleyin. 400 × g 10 dakika süreyle de SB 200 µL Resuspend Pelet santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Akış sitometrik çözümlemesi gerçekleştir ve enkaz (şekil 1B) dışlamak için canlı hücre nüfus kapısı. Kapıyı PE ve PerCP izotip denetimleri (şekil 1B) kullanarak PE ve PerCP olumlu nüfus için ayarla ve CD34 yüzdesini belirlemek+/CD45+ hücreleri.</li>
</ol>
3. megakaryocyte farklılaşma
<ol>
	<li>Tohum 5 × 105 hücre/mL CD34+ hücreleri iyi bir 12-şey plaka başına 50 ng/mL rekombinant insan thrombopoietin ile (rhTPO) takıma SFM 2 ml. Hücreleri 37 ° c, % 5 CO2 oksijen bir atmosferde kuluçkaya. Önce analiz için gerekli Konfluent hücrelerdir, hücreleri hasat ve birden çok wells taze medya ve rhTPO ile ayrılmıştır. Not: İki ya da üç kuyular farklılaşma farklı zaman noktalarda (örneğin, gün 7, 9 ve 10) izlemek için özel olarak hazırlanmalıdır.</li>
	<li>Hücre farklılaşması hücre diğer Wells bozmadan izlemek için bir kenara kuyulardan hasat.</li>
	<li>20 µL anti-GPIIb/CD41-FITC antikor hücrelerle leke ve 10 µL anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 antikor son hacmi 100 µL. bir denetim kurmak tüp ilgili izotip kontrol antikorları kullanarak. 15-30 dk 4 ° C'de için kuluçkaya</li>
	<li>SB yıkamak için 1 mL ekleyin.</li></ol>400 × g 10 dk. atma süpernatant için de santrifüj kapasitesi ve Pelet SB. analiz 200-300 µL içinde Akış Sitometresi tarafından resuspend.
	<li>Her fluorophore için analiz etmek için FITC ve Alexa un 647 olumlu nüfus çoğunluğuna ayarlamak için izotip kontrol eder. CD41 yüzde belirlemek için lekeli hücre örnekleri analiz+/CD42a+ çift olgun MK (şekil 1 c) temsil pozitif hücrelerinin.</li>
	<li>Hücre mikroskobik görselleştirme için 3,3 içinde açıklandığı gibi hücre yüzey işaretleyicileri leke.<ol>
		<li>SB yıkamak için 1 mL ekleyin. Vasıl 400 × g 10 dakika süreyle santrifüj Resuspend Pelet 100 µL SB ve spin 1000 x g 5 dk. düzeltme hücrelerin metanol için 30 s. hava kuru, daldırma tarafından slayt üzerinde de bir cam slayt üzerine eklemek DAPI içeren medya montaj 20 µL ( Tablo malzemelerigörmek) , kapak ile coverslip ve floresan mikroskop (şekil 2A) kullanarak görselleştirmek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Görselleştirme hücre içi antijenleri için PBS hücrelerde resuspend ve paraformaldehyde (% 1 son konsantrasyonu) oda sıcaklığında 15 dakika ile düzeltin. Hücreleri permeabilize için triton-X 100 (% 0,1) ekleyin ve 2 mL içeren 15 dk. yıkama hücreler için kuluçkaya PBS/0.1% triton-X 100. PBS/0.1% triton-X 100 100 µL içinde resuspend, vWf ve anti CD62p antikorları (1: 200 seyreltme) eklemek ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.<ol>
		<li>2 mL PBS/0.1% triton-X 100 ile yıkayın ve vasıl 400 × g 10 dk santrifüj kapasitesi, aynı arabellek 100 µL içinde resuspend ve anti-fare IgG-Alexa 594 ve anti-tavşan IgG-Alexa 488 (1: 100) ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya, 2 mL PBS/0.1% triton-X 100 ile yıkayın, aynı arabellek 100 µL içinde resuspend ve CD42b-APC anti, 20 µL ekleyin. Sonra hücreleri cam slayta 3.6.1. adımda açıklandığı gibi spin ve örnekleri mikroskobik görselleştirme için 3.6.1. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ploitlik belirlenmesi için günde 12-13 farklılaşma hücre hasat. SB yıkamak için 1 mL ekleyin. 10 dk ve son hacmi 100 µL. 20 µL anti-GPIIb/CD41-FITC antikor ile leke için 400 × g, santrifüj Incubate 4 ° c 30 dk için.<ol>
		<li>Bir keresinde SB 1 mL ile yıkama ve Pelet Hipotonik sitrat arabellek (1,25 mM sodyum sitrat, 2.5 mM Sodyum Klorür, 3.5 mM dekstroz) içeren 20 µg/ml propidium iyodür ve %0,05 300 µL resuspend Triton-X 100. Işıktan korunan 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.</li>
		<li>20 µg/mL nihai bir konsantrasyon RNase ekleyin ve ışıktan korunan 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya. Propidium iyodür yoğunluğunu Akış Sitometresi tarafından 30.000-50.000 olaylar (şekil 2C) CD41-FITC+ nüfusunun toplayarak belirlemek.</li>
	</ol>
	</li>

4. proplatelet sayımı, trombosit numaralandırma ve trombosit aktivasyon
<ol>
	<li>Günde 8 veya 9 farklılaşma ve tohum 1 × 104 hücreleri/kuyuda taze SFM 50 ng/mL rhTPO ile takıma 200 µL 48-şey levha, hücrelerden (Adım 3.1) hasat. 37 ° C, % 5, 5 gün boyunca kültür CO2. Not: nüsha wells Nefelometri amaçlar için tohum. Bu düşük yoğunluklu görselleştirme için gereklidir ve proplatelet-MK. Proplatelets genellikle yatak saymaya başla kültür 2 gün sonra görünen. 4 ve 5 gün tepedir.</li>
	<li>Yatak proplatelet MK tüm iyi bir ters ışık mikroskobu 10 X-20 X hedefleri kullanarak üzerinde saymak. Not: hücreleri oda sıcaklığında uzun süre tutarak büzülme proplatelet uzantıları neden olur bu yana bir ısıtmalı (37 ° C) mikroskop sahne, tercih edilir. Proplatelets MK vücuttan uzun uzantıları olarak gözlenir. Her MK birkaç proplatelet çıkıntılar olabilir. Proplatelets geliştirirken, MK gövdesi boyutu azalır.</li>
	<li>Hücre hasat ve vasıl 400 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi. 20 µL Anti-insan CD41-FITC antikor, hücrelerle 3.3 ve 3.4 adımlarda açıklandığı gibi leke. Yatak proplatelet MK (pbMK) yüzdesini hesaplamak: pbMK (%) = [(Proplatelet taşıyan MKs/de) / (Toplam CD41+ hücreleri / de)] x 100</li>
	<li>Trombosit kültür orta serbest saymak için yavaşça hücreleri Pasteur pipet ile karıştırın ve 100 µL gün 14 veya 15 kültür toplamak.<ol>
		<li>20-30 dk 4 ° C'de 20 µL Anti-insan CD41-FITC antikor ile leke İlgili izotip kontrol antikor kullanarak bir denetim tüp kadar ayarla.</li>
		<li>SB 150 µL ve boncuk sayma 50 µL ekleyin.</li>
		<li>Akış sitometrik çözümlemesi için FSC ve SSC ölçek oturum için ayarlayın. Kullanım normal insan kan trombosit trombosit açısından zengin plazma üzerinden CD41-FITC ile trombosit (şekil 3A) geçişi ayarlamak için 4.4.1 bölümünde açıklandığı gibi lekeli.</li>
		<li>Akış Sitometresi tarafından boncuk sayma ile lekeli trombosit analiz. FSC SSC dağılım çizim (şekil 3A) karşı kullanarak boncuk sayma 1000 olayları toplamak. Formülü kullanarak CD41-FITC olumlu olayları üzerinde (şekil 3B) alan trombosit sayısını hesaplar: Trombosit µL başına = [(CD41-FITC olumlu olayların numara)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/örnekleme birimi)]</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trombosit aktivasyon analiz etmek için yavaşça hücreleri Pasteur pipet ile karıştırın ve 100 µL gün 14 veya 15 kültür toplamak. 1 mL Tyrode'nın arabellek (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 0.2 mM Na2HPO4, 12 mM NaHCO3, 5.5 mM D-glikoz, pH 6,5) ve santrifüj 200 x g hücreleri cips için 5 dakika için ekleyin.<ol>
		<li>Toplamak süpernatant ve santrifüj vasıl 800 x g platelet boyutlu parçacıklar cips için 10 dakika için.</li>
		<li>Süpernatant atın ve Tyrode'nın arabellek 100 µL içinde resuspend. PAC1-FITC antikor ve adenozin nükleotittir (ADP) 20 µL bir son konsantrasyon 20 µM. için eklemek FITC olumlu olaylar yüzdesini belirlemek için Incubate, oda sıcaklığında 20 dk. analiz Akış Sitometresi ile için. Pozitif kontrol (şekil 3 c) olarak aynı şekilde tedavi taze insan trombosit kullanın.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Nakeff, A., Maat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+megakaryocytes+from+mouse+bone+marrow+by+velocity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation.</a> Blood. 43 (4), 591-595 (1974).</li>
<li>Zeigler, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+megakaryocytopoietic+and+thrombopoietic+activity+of+c-mpl+ligand+%28TPO%29+on+purified+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells.</a> Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).</li>
<li>Reems, J. -A., Pineault, N., Sun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Megakaryocyte+Production+and+Platelet+Biogenesis%3A+State+of+the+Art%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).</li>
<li>Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+generated+in+vitro+from+proplatelet-displaying+human+megakaryocytes+are+functional%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional.</a> Blood. 85 (2), 402-413 (1995).</li>
<li>Perdomo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monopartite+sequence+is+essential+for+p45+NF-E2+nuclear+translocation%2C+transcriptional+activity+and+platelet+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production.</a> J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).</li>
<li>Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profile+of+primary+human+CD34%2BCD38lo+cells+differentiating+along+the+megakaryocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage.</a> Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).</li>
<li>Feng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+generation+of+universal+platelets+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reports%22%5BJournal%5D)">Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).</li>
<li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+megakaryocyte+differentiation+of+fresh+and+ex-vivo+expanded+cord+blood+cells%3A+rapid+and+transient+megakaryocyte+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution.</a> Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).</li>
<li>Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+thrombocytopenia%3A+antiplatelet+autoantibodies+inhibit+proplatelet+formation+by+megakaryocytes+and+impair+platelet+production+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro.</a> Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).</li>
<li>Lev, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+proplatelet+formation+in+immune+thrombocytopenia%3A+a+novel+mechanism+contributing+to+decreased+platelet+count%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count.</a> Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).</li>
<li>Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+for+generating+platelet-like+fragments+from+megakaryocytic+cell+lines+and+human+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol.+Dis%22%5BJournal%5D)">A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells.</a> Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).</li>
<li>Lu, S. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+generated+from+human+embryonic+stem+cells+are+functional+in+vitro+and+in+the+microcirculation+of+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice.</a> Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).</li>
<li>Moreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+production+of+megakaryocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+by+chemically+defined+forward+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commun%22%5BJournal%5D)">Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming.</a> Nature Commun. 7, 11208(2016).</li>
<li>De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+of+megakaryocyte+progenitor+cells%3A+cord+blood+versus+mobilized+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood.</a> Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).</li>
<li>Nimgaonkar, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+population+of+CD34%2B+cells+in+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">A unique population of CD34+ cells in cord blood.</a> Stem cells. 13 (2), Dayton, Ohio. 158-166 (1995).</li>
<li>Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+proplatelet+elaboration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Mechanics of proplatelet elaboration.</a> J Thromb Haemost. 5, Suppl 1. 18-23 (2007).</li>
<li>Matsunaga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+large-scale+generation+of+human+platelets+from+cord+blood+CD34%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells.</a> Stem cells. 24 (12), Dayton, Ohio. 2877-2887 (2006).</li>
<li>Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+continuous+in+vitro+human+platelet+production+using+three-dimensional+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds.</a> Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).</li>
<li>Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+ex+vivo+expansion+of+megakaryocytes+from+human+cord+blood+CD34%2B-enriched+cells+in+the+presence+of+thrombopoietin+and+limiting+amounts+of+stem+cell+factor+and+Flt-3+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hematother.+Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand.</a> J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).</li>
<li>Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+megakaryocytes+do+not+complete+maturation%2C+as+indicated+by+impaired+establishment+of+endomitosis+and+low+expression+of+G1%2FS+cyclins+upon+thrombopoietin-induced+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation.</a> Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).</li>
<li>Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23714310">Drug-induced Immune Thrombocytopenia.</a> Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).</li>
<li>Stasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+thrombocytopenic+purpura%3A+Current+concepts+in+pathophysiology+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management.</a> Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada açıklanan protokol MK ve trombosit kültür göbek kordon kanı üzerinden tutarlı üretimi için uygundur. Bu hücreler MK yayılması, farklılaşma, proplatelet oluşumu ve trombosit üretim uyuşturucu veya biyolojik etkinlikler etkisi gibi çeşitli işlemler çalışma için kullanılabilir.
Çeşitli kültür medya ve sitokin kombinasyonları literatürde mevcuttur. Toplama+ kök hücre faktörü, Flt-3 ligand, IL-3 ve Il-6 destekler CD34 gibi sitokinler, hücre çoğalması. Ancak, bu genişleme azaltılmı...

Yalıtım birincil insan megakaryocytes (MK) düzenli labaratuar kullanımı için yeterli sayıda burada çekirdekli hücreler1~0.01% için hesap onların düşük frekanslı kemik iliğinde nedeniyle mümkün değildir. Ex vivo genişleme ve hematopoetik kök ve belirli büyüme faktörleri varlığında progenitör hücre farklılaşması bir uygun alternatiftir. Sitokinler kök hücre faktörü (SCF; c-kit ligand) ve İnterlökin (Il) -3 ve IL-11 de dahil olmak üzere bir dizi olmuştur MKs. Thrombopoietin (TPO) üretmek için kültür sistemlerinde istihdam megakaryocytic kültürler için en etkili büyüme ve farklılaşma faktörü olduğunu ve tek başına veya diğer sitokinler, SCF ve IL-32gibi ile etkilidir. TPO kök hücre popülasyonlarının yayılması ve MKs2olgunlaşma neden üzerinde hareket edebilir.
MK üretmek trombosit proplatelets adı verilen sitoplazmik çıkıntılar üzerinden ve, içinde vivo, yaklaşık 1 x 1011 trombosit günlük trombosit sayısı 150-400 x 109/l trombosit üretim vitro sürdürmek için kurulan 1000 kadar olmasıdır -kat vivo içinde 3tahmin ediyor ve bu artış CD34 kullanarak çok sayıda kültür koşulları vermiştir daha düşük+ MK ve trombosit üretim vitrogeliştirmek için hematopoetik progenitör hücre. CD34 ilk kaynak+ MK farklılaşma için kullanılan hücre insan periferik kan4oldu. Diğer hücre kaynakları kemik iliği5,6, embriyonik kök hücre/indüklenen pluripotent kök hücreler (ESC/IPSC)7ve göbek kordon kanı (UCB)8,9,10 yer alıyor . İnsan kemik iliği CD34+ 11 ve fare lineage negatif kemik iliği hücreleri5 üretmek MK ve trombosit içinde vitro; Yine de, insan kemik iliği kullanılabilirlik eksikliği CD34 kaynağı olarak kullanılmasını sınırlar+ hücreleri. Buna ek olarak, ESC ve IPSC hücre vitro trombosit üretim için sınırsız bir kaynağı temsil eder. Trombosit üretim bu hücrelerden besleyici hücreler fare OP9 hücreleri ve daha uzun kültür süre gibi gerektirir. Trombosit koşullarda besleyici-Alerjik türetilmiş daha az işlevsel12görünmektedir. trombosit IPSC kaynaklı ondan beri onlar-ebilmek var olmak genişlemek için büyük ölçüde klinik ortamlarında kullanımı olması muhtemel. Bu işlem lentiviral-aracılı iletim transkripsiyon faktörleri ve uzun vadeli hücre kültür13gerektirir.
UCB CD34 erişilebilir bir kaynak olduğunu+ kolayca kullanılabilir hücre araştırma ayarları. TPO yalnız kordon farklılaşma teşvik kan kaynaklı CD34+ hücreleri ve bu son derece saf, olgun MKs ezelî belgili tanımlık lüzum için serum takviyesi ya da besleyici hücreler ile ortak kültür için artış verir. Diğer sitokinler SCF farklılaşma UCB CD34 dan düşebilir gibi Flt-3 ligand ve IL-11 olgunlaşmamış megakaryocytes14üretimini teşvik ederken+ , hücreleri. Bu protokolünü açıklar yüksek saf MK kültürler kordon kanı CD34+ üretim koşullarında serum içermeyen hücreler.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Hücre Kültürü Reaktifleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan TPO</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-013</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM II</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>9605</td><td>CD34+ hücreleri için serumsuz ortam</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td><güçlü > Yorumlar</td></tr><tr><td>CD34 İzolasyon Reaktifleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD34 MicroBead kiti ultra saf</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-453</td><td>Bu kit, FcR insan IgG bloke edici reaktifi ve CD34 mikro boncuklarını içerir. Bu boncuklar, anti-CD34 antikor klonu QBEND / 10'u içerir. Saflık kontrolü için farklı bir anti-CD34 klonu kullanın (örn. klon 8G12).</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Alere Technologies</td><td>1114545</td><td>Lenfosit ayırma ortamı (yoğunluk 1.077 g/mL)</td></tr><tr><td>Steril ayırma tamponu (SB)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td>Bu tampon, fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.2 %0.5 sığır serum albümini ve 2 mM EDTA içerir. Steril, hücre kültürü dereceli bileşenler kullanılarak hazırlanabilir. Kullanmadan önce gazı boşaltın, çünkü hava kabarcıkları kolonu tıkayabilir.</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>strong>Katalog Numarası<<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>Flow Sitometri ve Hücre Boyama Reaktifleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Fare anti-İnsan CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>340669</td><td>Klon 8G12. Bu, CD34 saflık kontrolü için kullanılabilir. Son antikor konsantrasyonu 1:10 seyreltme.</td></tr><tr><td>PerCP fare anti-insan CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>347464</td><td>1:10 seyreltme</td></tr><tr><td>PerCP izotip kontrolü</td><td>BD Biosciences</td><td>349044</td><td>1:10 seyreltme</td></tr><tr><td>FITC Fare anti-İnsan CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>340929</td><td>Son antikor konsantrasyonu 1:5 seyreltme.</td></tr><tr><td>APC Fare Anti-İnsan CD42b</td><td>BD Biosciences</td><td>551061</td><td>Bu antikor, olgun MK'yi tespit etmek için de kullanılabilir (pozitif hücrelerin yüzdesi genellikle anti CD42a'dan daha düşüktür). Son antikor konsantrasyonu 1:10 seyreltme.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Fare Anti-İnsan CD42a</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1227A647T</td><td>Şu anda Bio-Rad tarafından dağıtılmaktadır. Son antikor konsantrasyonu 1:10 seyreltme.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Fare Negatif Kontrolü</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA928A647</td><td>Şu anda Bio-Rad tarafından dağıtılmaktadır. İzotip kontrol antikoru</td></tr><tr><td>Anti von Willebrand faktör tavşan poliklonal</td><td>Abcam</td><td>AB6994</td><td>1:200 seyreltme</td></tr><tr><td>V450 fare anti-humna CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>58425</td><td>1: 20 seyreltme</td></tr><tr><td>V450 izotip kontrolü</td><td>BD Biosciences</td><td>580373</td><td>1:20 seyreltme</td></tr><tr><td>PAC1-FITC antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>340507</td><td>1:10 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti CD62p fare monoklonal</td><td>Abcam</td><td>AB6632</td><td>1:200 seyreltme</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 keçi anti tavşan IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:100 seyreltme</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 keçi anti fare IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11020</td><td>1:100 seyreltme</td></tr><tr><td>Ig İzotip Kontrol kokteyli-C</td><td>BD Biosciences</td><td>558659</td><td>İzotip kontrol antikoru</td></tr><tr><td>Propidium iyodür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Mutlak Sayma Boncukları</td><td>Moleküler Problar, Invitrogen</td><td>C36950</td><td>Sayma boncukları</td></tr><tr><td><güçlü>Ad</güçlü</td><td>><güçlü>Şirket</güçlü></td><td><güçlü>Katalog Numarası</güçlü></td><td>güçlü<güçlü>Yorumlar</güçlü</td></tr><tr><td>><güçlü>Malzemeler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS sütunları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Daha küçük ve daha büyük sütunlar da ticari olarak temin edilebilir</td></tr><tr><td>MidiMACS Ayırıcı mıknatıs</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5mL yuvarlak tabanlı polipropilen FACS tüpler, Çıtçıtlı Kapaklı, Steril</td><td>In Vitro teknolojiler</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Cam slaytlar</td><td>Menzel-Glaser</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1200</td><td>ile montaj ortamı DAPI ile Antifade montaj ortamı</td></tr><<tr><td>strong>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td> <td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Leica</td><td>DMIRB ters mikroskop</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Vert.A1</td><td></td></tr><tr><td>Hücre analizörü</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin santrifüj</td><td>ThermoScientific</td><td>Cytospin 4</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Sayı</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell analizör yazılımı</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Diva Yazılımı</td><td></td></tr><tr><td>Tek hücre analiz yazılımı</td><td>Tree Star</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskop yazılımı</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2 mavi baskı</td><td></td></tr></tbody></table>

kordon kan kaynaklı cd34 megakaryocyte farklılaşma ve trombosit oluşumu insan+ hücreleri

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Trombosit üretim başta olmak üzere thrombopoiesis bilinen bir işlem kemik iliğinde görülür. Thrombopoiesis sırasında hematopoetik progenitör hücre ölümcül trombosit proplatelets olarak adlandırılan uzun sitoplazmik işlemlerden serbest bırakmak için ayırt megakaryocytes denilen formu trombosit öncüleri ayırt etmek. Megakaryocytes nadir hücreler kemik iliği sınırlı ve bu nedenle labaratuar kullanımı için yeterli sayıda hasat etmek zordur. Verimli üretim insan megakaryocytes, CD34 kültür tarafından elde vitro olabilir+ hücreleri uygun koşullar altında. Burada ayrıntılı protokolünü CD34 yalıtım açıklar+ hücreleri göbek kordonu kan örnekleri sıralama manyetik hücre. Serum-Alerjik koşullar altında son derece saf, olgun megakaryocytes üretmek için gerekli adımları açıklanır. Fenotipik analiz megakaryocyte farklılaşma ve proplatelet oluşumu ve trombosit üretim belirlenmesi ayrıntılarını da temin edilmektedir. Megakaryocyte farklılaşma ve/veya anti-trombosit antikorlar veya thrombopoietin mimetics gibi proplatelet oluşumu etkilemek effectors kültürlü hücrelere biyolojik işlevi incelemek için eklenebilir.

Bu iletişim kuralı son derece saf MK kültürler kablosu hazırlanması sağlayan kan kaynaklı CD34+ hücreleri. CD34 yüzdesi+ hücreleri kablosunu prize kan mı yaklaşık %1,315 (şekil 1A) ve mononükleer hücreler (Adım 1.8) Aralık 90-300 x 10'dan toplam sayısı6 UCB birim başına. CD34 saflığı +/ hücreleri CD45 + 90 yalıtım aralığından % 99 (şekil 1B) sonra. MK (CD41 tanımlanan+...

Megakaryocytes son derece saf bir nüfusa kablosunu elde edilebilir kan kaynaklı CD34+ hücreleri. CD34 için bir yöntem+ hücre izolasyon ve megakaryocyte farklılaşması burada açıklanmıştır.

Kordon kan kaynaklı CD34 megakaryocyte farklılaşma ve trombosit oluşumu insan+ hücreleri

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Bu prosedürün genel amacı, ilgilenilen spesifik ilaçların megakaryosit farklılaşması, proplatelet oluşumu ve trombosit üretimi üzerindeki etkilerini incelemek için saf CD34 pozitif hücreleri izole etmek için insan kordon kanı örneklerini kullanmaktır. Bu yöntem, belirli bir tedavinin megakaryosit farklılaşması ve trombosit üretimi ve işlevi üzerindeki etkileri gibi megakaryosit ve trombosit alanı ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, taze göbek kordonu kanından canlı CD34 pozitif hücrelerin tutarlı bir şekilde izole edilmesi için bir yöntem sağlamasıdır.Bu yöntem sayesinde megakaryopoez hakkında bilgi sağlayabilir, lenfositler, eritrositler ve makrofajlar gibi diğer hücre tipleri de incelenebilir. Her 10 mililitre kordon kanı için 150 mililitre konik tüpe 10 mililitre ayırma tamponu ekleyerek başlayın. 10 mililitrelik bir şırıngaya monte edilmiş 18 gauge künt bir iğne kullanarak, her tüpe 10 mililitre kan aktarın, ardından her tüpün dibine 15 mililitre lenfosit ayırma ortamı ekleyin.Hücreleri yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile ayırın, daha sonra dönüşün sonunda, numune başına bir yeni tüpe buffy coat tabakası içeren beş ila 10 mililitre mononükleer hücreyi dikkatlice toplayın. Her tüpteki toplam hacmi yeni bir ayırma tamponu ile 50 mililitreye getirin ve hücreleri tekrar santrifüjleyin. Peletleri beş ila 10 mililitre taze ayırma tamponunda yeniden süspanse edin ve hücre örneklerini bir araya getirin.Sayım için taze ayırma tamponu ile hacmi 50 mililitreye ayarlayın ve akış sitometrisi ile CD34 pozitif hücrelerin yüzdesini belirlemek için 100 mikrolitre hücre ayırın. Hücreleri tekrar santrifüjleyin ve peleti 300 mikrolitre ayırma tamponu, 100 mikrolitre FC reseptörü insan IgG bloke edici reaktif ve 100 mikrolitre CD34 manyetik boncuk içinde bir kez 10 ila sekizinci hücrelerde yeniden süspanse edin. Hücreleri 30 ila 40 dakikalık bir inkübasyon için dört santigrat dereceye yerleştirmeden önce hafifçe karıştırın.İnkübasyon sırasında, ilgili manyetik tutucuya uygun boyutta bir manyetik boncuk ayırma sütunu yerleştirin ve sütunu üç mililitre ayırma tamponu ile yıkayın. İnkübasyonun sonunda, bağlanmamış boncukları beş ila 10 mililitre ayırma tamponunda santrifüjleme yoluyla çıkarın ve manyetik boncuk ve hücre peletini 1.5 mililitre taze ayırma tamponunda yeniden süspanse edin. Etiketli hücreleri sütuna yükleyin ve etiketsiz akışı 15 mililitrelik bir toplama tüpünde toplayın.Atık suyu tekrar kolona yükleyin ve ikinci akış turunu aynı toplama tüpüne toplayın. Daha sonra sütunu üç mililitre ayırma tamponu ile üç kez yıkayın ve sütunu mıknatıstan çıkarın. Kolon pistonunu kullanarak, iki mililitre ayırma tamponunu kolondan kademeli olarak 15 mililitrelik yeni bir tüpe akıtın ve kolonu mıknatısa geri koyun.Temizlenen hücreleri sütuna geri yükleyin. Akışı toplayın ve sütunu az önce gösterildiği gibi iki mililitre ayırma tamponu ile yıkayın. Kolonu mıknatıstan çıkardıktan sonra, CD34-pozitif hücre fraksiyonunu az önce gösterildiği gibi toplamak için kolonu iki mililitre taze ayırma tamponu ile yıkayın ve CD34-pozitif hücreleri santrifüjleme ile toplayın.Daha sonra peleti CD34 pozitif hücreler için serumsuz ortamda yeniden süspanse edin. Megakaryosit farklılaşması için, 37 santigrat derecede inkübasyonları için 12 oyuklu bir plakada oyuk başına rekombinant insan trombopoietini ile desteklenmiş 2 mililitre serumsuz ortamda mililitre başına beş x 10 ila beşinci CD34 pozitif hücreyi tohumlayın ve% 5 karbondioksit, nemlendirilmiş bir atmosferde. Uygun farklılaşma izleme zaman noktalarında, diğer kuyucuklardaki hücreleri rahatsız etmeden hücreleri zaman noktası başına iki ila üç oyuktan hasat edin ve toplanan hücreleri anti-CD41 ve anti-CD42a antikorları ile boyayın.Hücre yüzeyi işaretleyicilerinde mikroskobik görselleştirme için, hasat edilen hücreleri 1 mililitre ayırma tamponunda yıkayın ve peleti 100 mikrolitre taze tamponda yeniden süspanse edin. Hücreleri bir cam slayt üzerine tohumlamak için bir cytospin kullanın ve hücreleri metanole 30 saniyelik bir daldırma ile slayta sabitleyin. Havayla kuruduktan sonra, hücreleri 20 mikrolitre DAPI takviyeli montaj ortamı ile etiketleyin ve floresan mikroskobu ile görselleştirmek için hücreleri bir kapak fişi ile örtün.Proplateletleri saymak için, hücreleri farklılaşmanın sekizinci veya dokuzuncu gününde hasat edin ve toplanan hücreleri, 48 oyuklu bir plakada oyuk başına rekombinant insan trombopoietini ile desteklenmiş 200 mikrolitre taze serumsuz ortam başına bir x 10 ila dördüncü hücrede tohumlayın. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte beş gün sonra, 10 veya 20 kat objektifi kullanarak, ters çevrilmiş bir ışık mikroskobunda oyuk başına proplatelet taşıyan megakaryositlerin sayısını sayın. Trombosit aktivasyonunu analiz etmek için, kültürün 14. veya 15. gününde, hücreleri bir Pasteur pipeti ile hafifçe karıştırın ve 100 mikrolitre hücre toplayın.Hücrelere 1 mililitre Tyrode tamponu ekleyin ve santrifüjleme ile peletleyin. Trombosit boyutundaki partikülleri peletlemek için santrifüjleme için süpernatanı toplayın ve partikülleri 100 mikrolitre taze Tyrode tamponunda yeniden süspanse edin, daha sonra partikülleri anti-PAK1 antikoru ile etiketleyin, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca adenozin difosfat ile aktive edin ve akış sitometrisi ile PAK1 pozitif olayların yüzdesini analiz edin. Kordon kanındaki CD34 pozitif hücrelerin tipik yüzdesi yaklaşık% 1.3'tür ve izolasyondan sonra CD34 pozitif CD45 pozitif hücrelerin saflığı% 90 ila 99 arasında değişir CD41 pozitif megakaryositler, serum içermeyen CD34 pozitif hücre kültürlerinde erken gözlenir, olgun CD41 pozitif CD42a-pozitif megakaryositlerin yüzdesi 7. güne kadar% 30 ila 40'a ulaşır ve farklılaşmanın 10. ve 12. günleri arasında gözlenen en yüksek çift pozitif hücre seviyeleri.Kültürlenmiş megakaryositler, sitoplazmalarında CD42b, Von Willebrand faktörü ve P-selektini eksprese eden büyük, genellikle çok çekirdekli hücreler olarak görünür. Bu hücre kültürlerinde en az üç ploidi sınıfı da yaygın olarak gözlenir. Megakaryosit gövdesinden uzanan uzun boncuklu lifler olan proplateletleri taşıyan megakaryositlerin yüzdesi tipik olarak %1.3 civarındadır. Hücre kültürü süpernatantındaki trombositlerin çoğu, periferik kan trombositlerinin analitik kapısı içine girer, CD41 trombosit markörü için pozitiftir, aktivasyona özgü PAK1 monoklonal antikorunun artan bağlanmasıyla gösterildiği gibi, adenozin difosfat gibi trombosit agonistleri tarafından aktive edilebilir.Bu videoyu izledikten sonra, CD34 pozitif hücrelerin kordon kanından nasıl izole edileceğini iyi anlayacaksınız. Ayrıca megakaryosit farklılaşma kültürleri kurabilecek, proplateletleri sayabilecek ve in vitro olarak üretilen trombositleri ve megakaryositleri analiz edebileceksiniz. İnsan numuneleri ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman sınıf II biyolojik güvenlik kabininde çalışmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

megakaryocyte-differentiation-platelet-formation-from-human-cord

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, megakaryositlerin farklılaşması ve trombosit oluşumu için bir teknik göstermektedir. İnsan göbek kordonu kanından izole edilen hematopoietik kök progenitör hücreler, trombopoietin varlığında olgun megakaryositlere farklılaşır. Olgun megakaryositler, tek tek trombositlere yol açan proplateletler adı verilen sitoplazmik uzantılar üretir.

Megakaryositlerin Farklılaşması ve Trombosit Oluşumu için İn Vitro Yöntem

Burada, insan pluripotent kök hücre (hPSC) kültür hPSCs CD34 ayırt etmek için kullanılan iletişim kuralları, mevcut+ hematopoetik ataları. Bu yöntem kurallı WNT ya kesin veya ilkel hematopoetik program sadece hücrelere belirtmek sinyal manipülasyon sahne özgü kullanır.

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

Burada, dört miyeloid soya immünotipik karakterizasyon ve sitokin kaynaklı cd34+ hematopoetik kök ve ataat hücrelerinin farklılaşması için bir protokol sıyoruz. Bu protokolün uygulamaları cd34+ hücrelerin miyeloid farklılaşması üzerinde miyeloid hastalık mutasyonları veya küçük moleküllerin etkisi üzerine araştırmalar içerir.

İnsan Kordon Kanı Kaynaklı CD34 Pan-miyeloid Farklılaşması+ Hematopoetik Kök ve Progenitor Hücreleri

Bu yöntem, MEP ve MKp'nin fare femurları, kaval kemiği ve pelvik kemiklerden akış sitometrisi ile saflaştırılmasını açıklar.

Fare Megakaryosit Progenitors İzolasyonu

Bu protokol, lökofilter türevi CD34+ hematopoetik progenitörlerin elde edilmesi ve bunların kültür ortamında trombositleri serbest bırakabilen proplatelet taşıyan megakaryositlere in vitro farklılaşması ve olgunlaşması ile ilgili tüm adımları ayrıntılı olarak açıklar. Bu prosedür, megakaryopoezleri kontrol eden hücresel ve moleküler mekanizmaların derinlemesine analizi için yararlıdır.

Megakaryosit Farklılaşması ve Trombosit Oluşumunu İncelemek için Hücre Kaynağı Olarak Leukodepletion Filtreleri-Türetilmiş CD34+ Hücreler

Burada, megakaryosit farklılaşmasının karakterizasyonu için bir immünofenotyping stratejisi sunuyoruz ve bu stratejinin floresan ile aktive edilmiş bir hücre sıralayıcısı ile megakaryositlerin farklı aşamalarda sıralanmasına nasıl izin verdiğini gösteriyoruz. Metodoloji insan birincil dokularına uygulanabilir, aynı zamanda kültür in vitroundaüretilen megakaryositlere de uygulanabilir.

İnsan Birincil Kaynaklarından veya Hematopoetik Progenitörlerden Farklılaştırılmış In Vitro'dan İnsan MK'larının İmmünofenoping ve Hücre Sıralama

Eritropoezin modellenmesi, bu süreçteki aktörlerin biyolojik önemini kavramak ve farklılaşma kusurlarını hafifletebilecek yeni terapötik yaklaşımları değerlendirmek için değerli bir şans sağlar. Burada, CD34+ hematopoietik kök ve progenitör hücreleri ex vivo olarak etkili bir şekilde ayırt etmek için basit ve güvenilir bir yöntem tanımlanmıştır.

İnsan Eritropoezinin Etkinliğini Değerlendirmek için Kapsamlı Bir Boru Hattı İn Vitro ve Ex Vivo

Biz tek bir insan kan bağışında düzenleyici, bellek ve naif T hücreleri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Polarize Tregs sonra da burada ayrıntılı bir bastırma testi dahil olmak üzere genetik homojenlik ile genetik ve fonksiyonel uygulamalar çeşitli diğer komutlara göre olabilir.

İlköğretim İnsan naif ve Bellek T Hücreleri gelen İsteyerek Düzenleyici T Hücreleri Üretimi

Bir CD19 özgü kimerik antijen reseptör (SYR) eksprese eden T hücrelerinin ilk-in-insan gen tedavi denemelerinde B-hücreli kanserlerin araştırılan tedavi olarak infüze edilir. Bu kullanılarak T hücre genetik modifikasyonu...

Klinik Uygulama<em&gt; Sleeping Beauty</emGenetiği Periferik ve Göbek Kordon Kanı alınan T hücreleri Değiştir Sunan Hücreler&gt; ve Yapay Antijen

Burada vasküler inflamasyon ve canlı farelerde trombüs oluşumu sırasında aktive endotel üzerindeki heterotipik trombosit-nötrofil etkileşimleri görselleştirmek için floresan intravital mikroskobu deneysel bir tekniktir rapor. Bu mikroskobik teknoloji vasküler hastalığın moleküler mekanizmasını incelemek ve patofizyolojik durumlardaki farmakolojik ajanları test için değerli olacaktır.

Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme

Öğrenin, kordon kanından CD34+ hücre izolasyonu ve megakaryosit farklılaşması için güvenilir bir yöntem. Bu teknik, trombosit biyolojisi ve hematoloji alanındaki araştırmaları destekler.

Kordon kan kaynaklı CD34 megakaryocyte farklılaşma ve trombosit oluşumu insan⁺ hücreleri

Daha fazla video keşfet