Name: Eksojen antijenleri Mycobacterium bovis BCG aşısı Avidin-biotin sistemi ile sigara genetik yüzey dekorasyon ile ifade (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Keşfedin, Mycobacterium bovis BCG yüzeyine rekombinant proteinlerle dekorasyon yaparak hızlı antijen sunumu sağlayan bu yenilikçi yöntemi. Aşı geliştirme ve mikobakteriyoloji araştırmalarında genetik manipülasyona alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Dr R Stokes BCG Pasteur zorlanma için ve A. Talal teknik destek için teşekkür ederiz. Ayrıca GenScript gen sentezi ile yardım için teşekkür.

Bütün hayvanlar hayvan bakımı ve kullanımı Komiteler British Columbia Üniversitesi tarafından onaylanmış protokoller uyarınca muhafaza. Deneyler hayvan bakımı ve kullanımı Komiteler tarafından onaylanmış ve hayvan bakım kuralları Kanada Konseyi göre gerçekleştirilen. Hayvan güvence refah A11-0247 sayıdır.
1. nesil Monomeric Avidin füzyon protein plazmid ifade
<ol><li>Alt monomeric avidin sıra12 pDEST17 plazmid 133 için karşılık gelen "CTC" ve "Tanrııı" siteler arasında içine clone-134bp. (Yani, 6-histag ve pDEST17 Attr1 rekombinasyon sitesi arasında) p17-AVI elde etmek için. Not: Monomeric avidin DNA dizisi aşağıda gösterilmiştir. Monomeric avidin elde etmek için vahşi tipi Avidin içinde sunulan üç mutasyonlar kalın karakter gösterilir. gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac acaaGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga</li>
	<li>Tasarım OVA polipeptid757-1035 için karşılık gelen AttB1 ve B2 Attsiteleri ile çevrili astar (ı-Ab- ve H-2_Kb-sınırlı epitopları) DNA dizisi. Astar sıraları şunlardır: Attb1-OVA GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT ve Attb2-OVA GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 ve Attb2 dizileri kalın olan).<ol>
<li>PCR yükseltmek OVA polipeptit757-1035 DNA dizisi ile pUC57-OVA plazmid şablon olarak kullanıp yukarıda astar.</li>
		<li>PCR ürünleri pDONR-221 pDONR-OVA elde etmek için bir siteye özel vitro Rekombinasyon tepkimesi (örneğin, BP Clonase) aracılığıyla içine kopyalayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Faiz gen LR Clonase reaksiyon p17-AVI-OVA elde etmek için kullanarak p17-AVI içine aktarın. Not: kan basıncı ve LR rekombinasyon klonlama ayrıntıları için üreticinin el kitabına bakın.</li>
</ol>2. monomeric Avidin füzyon Protein ifade, arıtma ve Refolding
<ol><li>E. coli BL21 p17-AVI-OVA plazmid dönüştürmek ve E. coli BL21 kültür IPTG (0,1 M) ile 37 ° C'de 3 h için 250 mL teşvik</li>
	<li>
Bakteri ve dahil organları Solubilization lizis
	<ol>
<li>Santrifüjü 4000 g x ve 4 ° C'de 30 dk tarafından indüklenen BL21 kültür 250 mL cips</li>
		<li>Granül lizis arabellek 10 ml toplamak (50 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, 6 M guanidin-HCL, pH 1,5-2,5) ve 95 ° C'de 15 dakika kuluçkaya Gecede, oda sıcaklığında bir rotator üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>15.000 x g ve 4 ° C ve toplamak süpernatant, 30 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
AVI-OVA Ni-NTA sütunları kullanarak süpernatant (çözündürüldükten dahil organları kesir) üzerinden arındırmak.
	<ol>
<li>Dahil organları 1:2 ile lizis arabellek sulandırmak.</li>
		<li>Ni-NTA reçine kültür kaynaklı dahil organlarının 250 mL başına 4 mL kullanın.</li>
		<li>3 x 10 mL lizis arabelleği (pH 7,0) ile yıkayın.</li>
		<li>10 mL elüsyon arabelleği (lizis tampon pH 7,0 ile 250 mM imidazole) ile elute.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eluted protein kademeli seyreltme (1:10) tarafından refold ve hızlı vortexing Tris arabelleği (pH 7.5) içeren 1 mM DTT, 200 mM NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0,5 mM ara 80, 500 mM arginin ve 200 mM NaCl, oda sıcaklığında 30 dakika.</li>
	<li>De-tuz ve arabellek Satım Tris arabellek protein PBS protein yoğunlaştırıcıları göre üreticinin iletişim kuralları ile refolded.</li>
	<li>Santrifüjü 3.500 x g ve 4 ° C'de 30 dk için toplamları kaldırmak ve aliquots çözünür protein-20 ° C'de depolayın</li>
</ol>3. Biotinylation BCG hücre yüzey
<ol><li>BCG Middlebrook 7 H içinde büyümek 9 suyu 10 ile % OADC (oleik asit, albümin ve dekstroz çözüm) ve %0,05 37 ° C kadar OD 50 RPM bir shaker platformda Tween 80 = 0,5-1. Not: BCG Biyogüvenlik seviye 2 patojen ve BCG ile ilgili tüm deneylerin bir biyogüvenlik uygun kişisel koruyucu ekipman ile kabine içinde yapılmalıdır.</li>
	<li>109 BCG 3 kat 500 µL buz gibi endotoksin ücretsiz PBS artı % 0,1 Tween80 (PBST) (pH 8.0) ile yıkayın. BCG Pelet steril endotoksin ücretsiz PBS askıya alma.</li>
	<li>
Kullanımdan hemen önce 1 mL steril süzülmüş su 10 mM Sulfo-NHS SS biotin hazırlayın.
	<ol>
<li>1 mL 0.5 mm Sulfo-NHS SS biotin, oda sıcaklığında 30 dakika ile bakteri kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3 kez ile sigara tepki biotinylation reaktif kaldırmak için buzlu soğuk PBST 500 µL etiketli bakteri yıkayın.
	<ol>
<li>Pelet 1 mL PBST yeniden askıya alma.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Biotinylation etkinliğini değerlendirmek için 20 dakika oda sıcaklığında 108 biotinylated BCG Streptavidin-FITC (1: 100, 25 µL) ile leke.
	<ol>
<li>1 mL % 2 lekeli bakteri kuluçkaya PFA oda sıcaklığında 20 dakika ve biotinylation düzeyde Akış Sitometresi Analizi ile inceleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Biotinylated mikobakteriler fenotip: büyüme ve hayatta kalma
<ol><li>
BCG suşları Middlebrook 7 H içinde büyümek 9 suyu 10 ile % OADC (oleik asit, albümin ve dekstroz çözüm) ve %0,05 37 ° C 50 RPM bir shaker platformda Tween 80.
	<ol>
<li>Bakteriyel kültür optik yoğunluk (OD600) 8 günlük süre içinde kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
BCG-Luc (yukarıda açıklanan9) makrofajlar içinde bakteri yaşama algılamak için kullanır.
	<ol>
<li>RAW264.7 hücre biotinylated BCG-Luc (MOI 10:1) ile enfekte veya tedavi edilmezse BCG-Luc (kontrol) ve zaman dilimi üzerinde 48 h 37 ° C'de inkübe.</li>
		<li>Hücre monolayers yıkama ve % 0,025 SDS ile alınan bakteriler serbest bırakmak için koşullar.</li>
		<li>Tedbir bioluminescence üretim Luciferase tahlil sistemi ve luminometer. Not: Işıldama sinyal bakteriyel canlılığı göstergesidir. Lütfen üreticinin kullanım kılavuzu luciferase testin bakın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Biotinylated BCG yüzeye Monomeric Avidin-füzyon proteinin bağlama
<ol><li>5 x 108 biotinylated BCG shaker platformda oda sıcaklığında 1 h için AVI-protein (PBS-T finalde 10 μg/mL) ile karıştırın.</li>
	<li>3 kez ile buzlu soğuk PBST ve leke tavşan Anti-avidin antikor (Ab) (1: 100 seyreltme, yukarıda açıklanan10) oda sıcaklığında 20 dakika ve sonra FITC ile 500 µL yıkama bakteri keçi Anti-tavşan IgG Ab aynı koşullarda Birleşik.</li>
	<li>3 kez ile PBST 500 µL bakteri yıkama ve yüzey dekorasyon ölçüde değerlendirmek için Akış Sitometresi tarafından analiz.</li>
</ol>6. mikobakteriler lyophilization
<ol><li>Biotinylate göre adım 3.1-3.4 ve kat biotinylated bakteri ile bakteri AVI-OVA adım 5.1 göre.</li>
	<li>Aliquot biotinylated ve kaplamalı bakteri (108), yıkama ile PBS ve 0.5 mL lyophilization medyada yeniden askıya alma (% 25 Sauton orta, % 75 H2O ve % 1.5 Na-Glutamat).</li>
	<li>Cam Şişeler için bakteri transfer ve gecede-80 ° C dondurucuda dondurma.</li>
	<li>Dolu ve dondurulmuş cam şişeleri için 24 saat bir donma kurutma makinesi kullanarak lyophilize.</li>
	<li>Kurutulmuş örnekleri, oda sıcaklığında saklamak ve gerektiğinde PBS sulandırmak.</li>
	<li>Biotinylation ve istikrar kaplama yüzeyi değerlendirmek için 3.5 arasındaki adımları yineleyin.</li>
</ol>7. fagositoz tahlil
<ol><li>10 cm çapında kültür yemekleri DMEM orta içeren % 5 FCS, % 1'i her L-glutamine, HEPES, non-gerekli amino asitler ve penisilin ve streptomisin ham 264.7 makrofaj hücreleri % 70-80 confluency kadar büyür.</li>
	<li>2 x 106 ham 264.7 makrofaj hücreleri bir 6-şey plaka tohum. Hücreleri gecede 37 ° C ve % 5 CO2' de bağlı kalmak izin verir.</li>
	<li>DsRed BCG oluşturmak (yukarıda açıklanan9) AVI-OVA ile (DsRed BCG-AVI-OVA) adımları 3.1-3,4 ve 5. 1 göre dekore edilmiş.</li>
	<li>DsRed BCG-AVI-OVA veya tedavi edilmemiş DsRed BCG MOI 20:1 37 ° C'de 24 h için ham hücreleri enfekte</li>
	<li>Hücreleri üç kez yıkama ve kısmen müstakil bakteri kaldırmak için 10 dk 37 ° C'de % 0.25 tripsin 1 mL kullanarak trypsinize.</li>
	<li>%2.5 düzeltmek PFA PBS için oda sıcaklığında 20 dakika içinde.</li>
	<li>3 x PBS ile yıkama ve Akış Sitometresi tarafından analiz.</li>
</ol>8. hücre içi OVA kaçakçılığı Biotinylated BCG makrofajlar içinde dekore edilmiş
<ol><li>
Floresans mikroskobu
	<ol>
<li>3 x 105 çiğ 264.7 makrofaj hücreleri coverslips 24-şey plaka üzerinde tohum. Hücreleri gecede 37 ° C ve % 5 CO2' de bağlı kalmak izin verir.</li>
		<li>Makrofaj hücreleri mikobakteriler (MOI 10:1) bakım medya olmadan antibiyotik 37 ° C ve 4-24 h için % 5 CO2 ile enfekte.</li>
		<li>Hücreleri yıkama ve yüzey ekli, Sigara yutulur bakteri olduğu gibi adım 7.5 kaldırmak için trypsinize.</li>
		<li>Düzeltme enfekte hücrelerde % 2.5 PBS ile 3 yıkar PFA PBS için oda sıcaklığında 20 dk içinde izledi.</li>
		<li>Engelleme/permeabilization arabellek hücrelerde permeabilize (% 0,1 Triton X-100, PBS % 3 BSA) oda sıcaklığında 20 dakika.<ol>
<li>Kullanım spesifik antikor ilgi (örneğin, Anti-avidin Ab tavşan) oda sıcaklığında 20 dk için arabellek permeabilization 10 μg/mL devam 20 dk için ikincil antikor (örneğin, FITC-keçi Anti-tavşan IgG) tarafından.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Yıkama su ve sulu montaj orta floresan photobleaching en aza indirmek için 10 μL slaytlarda bağlama ile bir kez PBS ile 3 x hücreleri.</li>
		<li>Slayt 63 x ile donatılmış bir epifluorescence mikroskop kullanarak dijital confocal mikroskobu tarafından incelemek / 1.4 planı-Apochromat amaç. Kayıt görüntüleri kullanarak bir dijital fotoğraf makinesi için belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı birleştiğinde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunogold boyama ve elektron mikroskobu
	<ol>
<li>2 x 106 ham 264.7 makrofaj hücreleri 6-şey tabak içinde tohum.</li>
		<li>%4 ile enfekte BCG makrofajlar düzeltmek PFA oda sıcaklığında 4 h için.</li>
		<li>Örnekleri iki kez PBS ile yıkayın.</li>
		<li>% 4 düşük erime noktası özel örnekleri katıştır ve % 70 etanol kurutmak.</li>
		<li>Akrilik Reçine için örnekler aktarmak ve 50 ° C'de polimerize</li>
		<li>60 nm bölümleri ile bir microtome kesmek ve bölümler nikel Izgaralar üzerinde toplamak.</li>
		<li>Etiket örnekleri 10 μg/mL avidin antikor için 1 h, oda sıcaklığında veya 4 ° C'de gecede kuluçka çözüm (PBS ve % 0.1 BSA) ile ve sonra yıkayın kuluçka çözüm altın Birleşik F(ab')2 ultra-küçük keçi-anti-tavşan ile Oda 1 h için IgG (1/20) Kuluçka çözüm sıcaklığında.</li>
		<li>Distile su bölümlerde yıkama, % 2 oxazolidin leke, yine, hava kuru yıkama ve elektron mikroskobu ile inceleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. hayvan bağışıklama ve Organ işlemi
Not: Tüm adımları bir biyogüvenlik kabini yapılmalıdır.
<ol><li>Pass biotinylated ve protein kaplı bakteri 271/2G iğne ile 10 kat tek hücre süspansiyon yapmak.</li>
	<li>
1 x 106 bakterilerde endotoksin-Alerjik PBS 100 μL al ve bir kadın C57BL/6 fareler (ı-Ab, H - 2 Kb, 5-6 haftalık) subkutan boyun scruff bağışıklık.
	<ol>
<li>Denetim fare PBS yalnız 100 μL ile enjekte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Servikal çıkığı tarafından takip CO2 Solunduğunda aşılı fareler 20 gün sonrası aşılama ötenazi.
	<ol>
<li>Dalak yalıtmak ve RPMI medya içine aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dalak 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla 5 mL şırınga pompası ile püre.
	<ol>
<li>RPMI 5 mL ile yıkayın. Santrifüj (800 x g, 3 dk) bir tek hücre süspansiyon yalıtmak için.</li>
		<li>RBC ile fare biotin pozitif seçim teçhizat biotin-Ter119/Erythroid hücreleri Ab ile tüketmek.</li>
		<li>Santrifüj ve yeniden askıya hücrelerinde (% 10 FCS, %1 L-glutamine, % 1 penisilin, % 1 streptomisin ve 50 μm kalınlığında 2-ME) tam RPMI 10 mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. ı-Ab tetramer antijen spesifik CD4 frekansları+ T hücreleri ve hücre içi sitokin boyama belirlemek Frekanslar, antijen spesifik T hücreleri serbest sitokinler hayvanlarda aşı için karar vermek için boyama
<ol><li>
Tetramer boyama
	<ol>
<li>Splenocytes kontrol ve aşılı fareler (~ 20 x 106 hücreler) PE Birleşik ı-Abile leke-OVA323-339 tetramers (1/12,5 seyreltme) bağlama arabellek (PBS % 2 FCS ve %0,1 NaN3ile) 37 ° C'de 1 h için.</li>
		<li>AF647 CD4 Ab (1:25) ve (ölü hücreleri bulmak için) 7-AAD splenocytes oda sıcaklığında 20 dakika için ekleyin.</li>
		<li>Örnekleri Akış Sitometresi tarafından analiz.</li>
		<li>500.000 etkinliklere tetramer olumlu olayları sıklığını belirlemek için CD4 pozitif elde etmek. Not: Toplam splenocytes SSC/FSC dot blot tarafından canlı hücreleri tarafından 7-AAD olumlu olaylar dışlanması ve CD4 alt kümeleri AF647 olumlu olaylar çoğunluğuna tarafından tanımlanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
T hücreleri serbest antijen belirli hücre içi sitokin sıklığı
	<ol>
<li>Transfer yaklaşık 1 × 107 splenocytes içine altı-şey plakaları veya rekombinant OVA olmadan tam RPMI ortamda 4 mL (10 µg/mL) ve 16 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Ek bir 5 h için Brefeldin A (1:1, 000) ile hücreleri tedavi.</li>
		<li>Yıkama ile PBS ve hücre içi sitokin aşağıdaki gibi boyama tabi:<ol>
<li>PE-CD8 veya PE-Cy7-CD4 Ab (1:50 bağlama arabellek) ile hücre örneklerinde oda sıcaklığında 30 dakika leke.</li>
			<li>%4 oranında tamir PFA, oda sıcaklığında 20 dakika.</li>
			<li>Permeabilization çözüm, kullanarak üreticinin yönergelerine göre permeabilize.</li>
			<li>Hücreleri ve AF647 Birleşik IFN γ Ab (1:50) 20 dk için etiketle oda sıcaklığında yıkayın.</li>
			<li>Hücreleri yıkayın ve Akış Sitometresi Analizi için yukarıda açıklandığı gibi.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Horwitz, M. A., Harth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vaccine+against+tuberculosis+affords+greater+survival+after+challenge+than+the+current+vaccine+in+the+guinea+pig+model+of+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis.</a> Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).</li>
<li>Pym, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+BCG+exporting+ESAT-6+confers+enhanced+protection+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis.</a> Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).</li>
<li>Grode, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+vaccine+efficacy+against+tuberculosis+of+recombinant+Mycobacterium+bovis+bacille+Calmette-Guerin+mutants+that+secrete+listeriolysin%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin.</a> The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).</li>
<li>Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Mycobacterium+bovis+BCG%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Recombinant Mycobacterium bovis BCG.</a> Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).</li>
<li>Mederle, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmidic+versus+insertional+cloning+of+heterologous+genes+in+Mycobacterium+bovis+BCG%3A+impact+on+in+vivo+antigen+persistence+and+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses.</a> Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).</li>
<li>Singh, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Approach+to+Cancer+Immunotherapy+Tumor+Cells+Decorated+with+CD80+Generate+Effective+Antitumor+Immunity+A+Novel+Approach+to+Cancer+Immunotherapy+Tumor+Cells+Decorated+with+CD80+Generate+Effective+Antitumor+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity.</a> Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).</li>
<li>Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+requirements+for+enhanced+antigen+cross-presentation+to+CD8+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes.</a> J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).</li>
<li>Sharif-Paghaleh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+efficacy+of+dendritic+cell+vaccination+by+early+detection+of+%2899m%29+Tc-HMPAO-labelled+CD4%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells.</a> Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broad-range+of+recombination+cloning+vectors+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria.</a> Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).</li>
<li>Laitinen, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+an+active+avidin+monomer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rational design of an active avidin monomer.</a> J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).</li>
<li>Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+interferon+gamma+in+resistance+to+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection.</a> J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).</li>
<li>Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+immunogenicity+of+the+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccine+by+non-genetic+bacterial+surface+decoration+using+the+avidin-biotin+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system.</a> PLoS ONE. 10 (12), e0145833(2015).</li>
<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin+and+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Avidin and streptavidin.</a> Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).</li>
<li>Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+quantum+dots+to+surface+proteins+in+living+cells+with+biotin+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase.</a> PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).</li>
<li>Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin-biotin+technology+in+targeted+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Avidin-biotin technology in targeted therapy.</a> Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).</li>
<li>Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioimmunotherapy+of+brain+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Res%22%5BJournal%5D)">Radioimmunotherapy of brain tumor.</a> Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).</li>
<li>Cummings, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+immunogenicity+of+a+plant-produced+recombinant+monomer+hemagglutinin-based+influenza+vaccine+derived+from+influenza+A+%28H1N1%29pdm09+virus%3A+a+Phase+1+dose-escalation+study+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults.</a> Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).</li>
<li>Kolotilin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-based+solutions+for+veterinary+immunotherapeutics+and+prophylactics%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics.</a> Vet Res. 45, 114-117 (2014).</li>
<li>Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+engineering+of+streptavidin+monomer+with+a+reduced+biotin+dissociation+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate.</a> Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).</li>
<li>Deghmane, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoamide+dehydrogenase+mediates+retention+of+coronin-1+on+BCG+vacuoles%2C+leading+to+arrest+in+phagosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation.</a> J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).</li>
<li>Soualhine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+bovis+bacillus+Calmette-Guerin+secreting+active+cathepsin+S+stimulates+expression+of+mature+MHC+class+II+molecules+and+antigen+presentation+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages.</a> J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).</li>
<li>Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+antibodies+to+avidin+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22ImmunolLett%22%5BJournal%5D)">Natural antibodies to avidin in human serum.</a> ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).</li>
<li>Petronzelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+use+of+avidin+is+not+hampered+by+antiavidin+antibodies+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biother+Radiopharm%22%5BJournal%5D)">Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans.</a> Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).</li>
<li>Bigini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fate+of+avidin-nucleic+acid+nanoassemblies+as+multifunctional+diagnostic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools.</a> ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

BCG yüzeyinde belirli antijenleri veya bakteri'nın immünojenisite verimli bir şekilde geliştirmek için beklenen belirli fonksiyonel özellikler eklemek için hızlı ve etkili görüntü eksojen proteinlerin için genetik olmayan bir yaklaşım bu çalışmada bildirdi. BCG hücre yüzeyine kolayca biotinylated avidin füzyon protein ile anlık yüzey dekorasyon için olabilir gösterdi. Genetik dönüşümü ve olumlu klonlar yelpazesi gerektirir iken 2-3 ay zaman lag toplam yordam içinde 2 h, gerçekleştirilebilir. Yüzey modifikasyonu Bakteriye...

Çeşitli stratejileri geçerli TB aşı BCG protein adjuvan sistemleri, viral vektörlü teknolojileri, zayıflatılmış canlı M.tb suşları ve genetiği değiştirilmiş BCG suşları, ya genlerinin tanıtmak için de dahil olmak üzere, eski yerine koymak için önerilen yeterince enfeksiyon1 ya da Mtbsırasında gösterilir değil BCG antijenleri aşırı ifade-belirli antijenleri BCG2' mevcut değil. Genetik mühendisliği, ancak, birçok engeller Emanet, zaman alan işlem ve düşük verimlilik ifade vektörel çizimler4,5belirsiz düzey de dahil olmak üzere karşı karşıya. BCG iyileştirilmesi açısından, alternatif bir yaklaşım immünojenisite belirsiz genetik değişiklikler için gerek kalmadan geliştirmek için gereklidir.
Bu çalışmada, biotin tanınmış yüksek afinite avidin etkileşim dayanır BCG hücre yüzeyi ilgi rekombinant proteinlerin görüntü için yeni bir strateji tanıtmak. Bu yaklaşım hızlı ve tekrarlanabilir eki rekombinant avidin füzyon proteinlerin biotinylated maksimal iyileştirme onun etkinliğinin onun mükemmel emniyet koruyarak ulaşmak için BCG geniş işlemler kolaylaştırır BCG yüzeyi sağlar kayıt, kullanım yılda gözlenen.
Biotin için avidin ilgi son derece yüksektir (Kd 10−15 M =) ve bir kez kurulan, biotin avidin karmaşık çok kararlı ve yalnızca koşullar6denaturing altında bozulmuş. Ancak, bu tür bir gen transferi yöntemi alternatif olarak hizmet için etkileşim için uzun vadeli ama geri döndürülebilir ekran rekombinant proteinlerin gereklidir. Böylece, biz burada bir düşük benzeşme monomeric avidin tanıttı (Kd 10−7 M =) protein tersinir sürümü götürür yüzey hücreleri sunulması antijen içinde bir kez yutulur BCG dekore edilmiştir. Kavramının bir kanıtı olarak sağlamak için bu yöntem ovalbumin (OVA)7,8' den türetilmiş bir vekil antijen karşılık gelen bir monomeric avidin chimeric protein kullanarak test ettik. BCG hücre yüzeyine kolayca ve hızla monomeric avidin füzyon proteinler ile dekore edilebilir olduğunu ve bu bağlama BCG yüzeye istikrarlı ve bakteriyel büyüme ve hayatta kalma tespit değişiklikler olmadan tekrarlanabilir sonuçlar gösterdi. Ayrıca, monomeric avidin OVA (AviOVA) ile erimiş süslenmiş BCG BCG tarafından indüklenen için benzer bir bağışıklık yanıtı tetikleyebilir genetik olarak aynı antijen ifade bulduk vitro ve içinde vivo. Bu teknoloji bakteri yüzeyindeki ilgi proteinlerin geri döndürülebilir ekran bu nedenle geleneksel gen transferi yaklaşımlar etkili bir yerini ve BCG geniş işlemler ve daha fazla aşı uygulamaları için bir platform sağlayabilir geliştirme.

<table><tbody><tr><td>Endotoksin İçermeyen RPMI 1640</td><td>Kök Hücre Teknolojileri&nbsp;</td><td>36750</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS SS biotin</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>21328</td><td></td></tr><tr><td>FITC ile konjuge streptavidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3762</td><td></td></tr><tr><td>Fikoeritrin (PE) ile konjuge I-A b-OVA 323-339 tetramer ve nbsp;</td><td>MBL Uluslararası&nbsp;</td><td>TS-M710-1</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>TALON polihistidin-Tag saflaştırma reçinesi&nbsp;</td><td>Clontech</td><td>635501</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor (AF) 647 konjuge sıçan anti-fare CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>557681</tr><tr><td>AF647 sıçan anti-fare IFN-g</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>557735</tr><tr><td>AF647 sıçan anti-fare I-A/I-E</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>562367 PeCy7 sıçan anti-fare CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>552775</tr><tr><td>PE sıçan anti-fare CD8 Ab</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>561095</tr><tr><td>AF 647 sıçan anti-fare H-2kb</td><td>BD Bioscience</td><td>562832</td><td></td></tr><tr><td>FITC konjuge keçi anti tavşan antikoru</td><td>Thermo Fisher</td><td>31635</td><td></td></tr><tr><td>AF 647 sıçan anti-fare CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>557681</tr><tr><td>Ultra küçük altın konjuge keçi tavşan karşıtı IgG</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>25100</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 et suyu</td><td>BD Teşhis Sistemleri</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>OADC</td><td>BD Teşhis Sistemleri</td><td>B11886</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 murin makrofaj hücre hatları</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pDEST17 plazmid&nbsp;</td><td>İnvitrojen</td><td>11803012</td><td></td></tr><tr><td>pUC57-OVA plazmid&nbsp;</td><td>GenScript</td><td>SD1176</td><td></td></tr><tr><td>BP klonaz&nbsp;</td><td>İnvitrojen</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>LR klonaz&nbsp;</td><td>İnvitrojen</td><td>11791043</td><td></td></tr><tr><td>pDONR221 plazmid</td><td>Invitrogen</td><td>12536017</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA kolonları&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>Pierce protein yoğunlaştırıcıları&nbsp;</td><td>Termo Balıkçı&nbsp;</td><td>88527</td><td></td></tr><tr><td>Flurosave</td><td>Calbiochem-Novabiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan II epifloresan mikroskobu</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD dijital kamera&nbsp;</td><td>Retiga EX, QImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai G2 200kV elektron mikroskobu&nbsp;</td><td>FEI Şirketi</td><td>G2 200Kv&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>70&mu; m Falcon hücre süzgeci&nbsp;</td><td>Termo Balıkçı&nbsp;</td><td>87712</td><td></td></tr><tr><td>EasyStep fare biotin pozitif seçim kiti&nbsp;</td><td>StemCell</td><td>18556</td><td></td></tr><tr><td>biotin-Ter119/Ertyroid hücreleri antikoru</td><td>BioLegend</td><td>116203</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>BD Pharmingen</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm kiti&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Glo Lusiferaz test sistemi</td><td>Promega</td><td>e2620</td><td></td></tr><tr><td>Turner Biosystem luminometre ve nbsp;</td><td>Promega</td><td>TD-20/20</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM UC6 mikrotom</td><td>&nbsp; Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Novalyphe NL 500 dondurarak kurutucu</td><td>Savant Instruments</td><td>&nbsp;NL 50</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton boroscilicate cam şişeler</td><td>Wheaton</td><td>&nbsp; VWR 66011-675</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

eksojen antijenleri mycobacterium bovis bcg aşısı avidin-biotin sistemi ile sigara genetik yüzey dekorasyon ile ifade

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Tüberküloz (TB) ciddi bir bulaşıcı hastalık ve biricik elde edilebilir aşı M. bovis bacillus Calmette-Guerin (BCG) çocuk şiddetli TB menenjit ve Dissemine TB bazı türlerinin karşı koruma için güvenli ve etkili ama başaramamak-e doğru korumak olduğunu Akciğer TB karşı hangi hastalığın en yaygın biçimidir. Şu anda BCG geliştirmek için umut verici stratejileri ya dönüştürmenin immunodominant M. tuberculosis (Mtb)kodlama genlerimizle itimat-belirli antijenleri ve/veya tamamlayıcı antijen teşvik etkenler kodlama genler ile hücreleri sunulması. Bu yaklaşımlara büyük sınırlamalar düşük verimlilik, düşük istikrar ve güvenliğini ifade vektörel çizimler belirsiz düzeyini içerir. Bu çalışmada, BCG uluslara bakteri, tercihan--dan dönüştürme yüzeyinde ilgi eksojen proteinler ile ilgili genlerin kodlama Plasmid'ler ile oluşur aşı geliştirme için alternatif bir yaklaşım sunuyoruz. İlk olarak, proteinler ilgi erime içinde standart E. coli monomeric avidin ile ifade edilir ifade sistemleri ve biotinylated BCG yüzeyine süslemek için kullandı. Hayvan deneyleri BCG yüzey yedek ovalbumin antijen ile dekore edilmiş kullanarak değiştirilmiş bakteri tamamen immunojenik ve belirli T hücre yanıt ikna yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir. Tamamen, kesinlikle burada sunulan veri uluslara zahmetli geleneksel yaklaşım eksojen nükleik asitler ile değiştirir geçerli BCG aşısı yeniden şekillendirilmesi için bir roman ve verimli yöntem destekler.

Yukarıda açıklanan genel yordamlar ile fizibilite BCG yüzey biotinylation ve vekil antijen OVA ile dekorasyon incelenmiştir. Sonra değiştirilmiş BCG immünojenisite oldu test içinde vivo. Bakteriyel yüzey kolayca avidin chimeric antijenleri bakteriyel fenotipleri tespit herhangi bir değişiklik olmadan hızlı ekran için biotin ile etiketli oldu. Elde edilen değiştirilmiş BCG verimli antijen sunumu hücreleri tarafından yutulur ve OVA özgü bağışıklık yanıtının farelerde tetikleyebilir...

Bakteriyel bir yüzey hızlı antijen görüntülemek için yeni bir teknik olan yüzey biotinylation proteinler füzyon monomeric avidin ile ilgi maruz takip içerir sunulur. BCG seçili antijenleri ile başarıyla yükleme yüzey dekorasyon geleneksel genetik yaklaşımlar yerine düşündüren onun immünojenisite geliştirir.

Eksojen antijenleri Mycobacterium bovis BCG aşısı Avidin-biotin sistemi ile sigara genetik yüzey dekorasyon ile ifade

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

Bu prosedürün genel amacı, geleneksel, genetik temelli yaklaşımlara alternatif olarak rekombinant proteinlerle yüzey dekorasyonu kullanarak mikobakteri üzerindeki yüzey proteinlerini eksprese etmektir. Bu yöntemler, mikobakteriyoloji alanında, özellikle hastane etkileşimleri ve aşı gelişmeleri alanında önemli araştırma sorularının yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, potansiyel girişim faktörlerini veya antijen adaylarını taramak için kullanılabilir.Titiz ve zaman alıcı geleneksel genetik temelli yaklaşımlarla hızlı bir şekilde karşılaştırılabilir. Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımda araştırma görevlisi olan Amina Talal olacak. Protokolün bu kısmı, P17 Aviden OVA plazmidinin E.Coli BL21'e dönüştürülmesiyle başlar.Bunu yapmak için, 37 santigrat derecede üç saat boyunca IPTG ile 250 mililitre E.Coli BL21 kültürünü indükleyin. Üç saat sonra, önce indüklenen BL21 kültürünü peletleyerek ve süpernatanı atarak inklüzyon cisimciklerini çözündürmek için bakterileri parçalayın. Daha sonra peleti 10 mililitre lizis tamponunda tekrar süspanse edin ve hücrelerin 15 dakika boyunca parçalanmasına izin verin.Daha sonra, çalkalama için bir döndürücü kullanarak inkübasyona oda sıcaklığında devam edin ve gece boyunca gitmesine izin verin. Sabahları karışımı yarım saat santrifüjleyin. Daha sonra çözündürülmüş inklüzyon cisimciklerini içeren süpernatanı toplayın.Daha sonra, bir nikel NTA sütunu kullanarak Aviden OVA proteinlerini saflaştırın. İlk olarak, süpernatanı lizis tamponunda bir ila iki oranında seyreltin ve hacmi tahmin edin. Daha sonra, 250 mililitre seyreltilmiş süpernatan başına dört mililitre nikel NTA reçinesi içeren bir sütun hazırlayın ve seyreltmeyi sütuna yükleyin.Daha sonra, yıkama başına pH yedi'de 10 mililitre lizis tamponu kullanarak sütunu üç kez yıkayın. Rekombinant proteini toplamak için, sütunu imidazol içeren lizis tamponu ile yıkayın ve elüatı toplayın. Rekombinant proteininiz inklüzyon cisimlerinden arındırılmışsa, laboratuvarımızdaki birçok protein için iyi olacak prosedür aşağıdadır.İlk olarak, yeniden katlama çözeltisinin pH'ını, proteinin izoelektrik noktasının bir birim üstünde veya altında olacak şekilde ayarlayın. Daha sonra, proteini yavaş yavaş girdaplayın ve yeniden katlama çözeltisinde 1 ila 10 seyreltmeye seyreltin. Daha sonra, yeniden katlama işlemini tamamlamak için proteini oda sıcaklığında 30 dakika manyetik bir karıştırıcı üzerinde inkübe edin.Daha sonra, tuzdan arındırma ve tamponlama, yeniden katlanmış proteinleri bir protein yoğunlaştırıcı kullanarak PBS'ye dönüştürür. Sütunu santrifüjleyerek takip edin ve çözünür proteinin alokuatlarını 20 santigrat derecede saklayın. BCG 2. seviye bir patojen olduğu için kişisel koruyucu ekipman kullanarak bir biyogüvenlik kabininde çalışın.BCG hücrelerinin yüzeyini biyotinile etmek için, önce hücreleri bir çalkalayıcı platformda uygun yoğunluğa kadar büyütün. Yaklaşık bir milyar hücre toplayın ve 500 mikrolitre buz gibi, endotoksin içermeyen PBST kullanarak üç kez yıkayın. Daha sonra, hücreleri döndürün ve steril, endotoksin içermeyen PBS'de askıya alın.Daha sonra, steril filtrelenmiş suda taze 10 milimolar sulfo-NHSSS biyotin hazırlayın. Daha sonra bakterileri 0.5 milimolar sülfo-NHSSS Biotin içeren bir mililitre et suyunda inkübe edin. İnkübasyonu oda sıcaklığında 30 dakika boyunca gerçekleştirin.Daha sonra, reaksiyona girmemiş re-ajanı çıkarmak için şimdi etiketlenmiş bakterileri daha önce olduğu gibi 500 mikrolitre buz gibi soğuk PBST ile üç kez yıkayın. Ardından, peleti bir mililitre PBST'de yeniden askıya alın. Biyotinilasyon verimliliğini değerlendirmek için, 100 milyon biyotinile BCG'nin bir aloquat'ını 25 mikrolitre Strepravidin-FITC ile boyayın.Daha sonra, lekeli bakterileri para-formaldehit içinde kısaca inkübe edin ve ardından akış sitometrisi kullanarak biyotinilasyon seviyesini ölçün. Biyotinile mikobakterilerin büyümesini ve hayatta kalmasını değerlendirdikten sonra, Aviden füzyon proteinini bunlara bağlamaya devam edin. İlk olarak, mililitre başına 10 mikrogram proteinin nihai konsantrasyonu için 500 milyon biyotinile BCG'yi Aviden füzyon proteini ile karıştırın.Bu reaksiyonun bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında bir saat gitmesine izin verin. Daha sonra, bakterileri 500 mikrolitre buz gibi soğuk PBST ile üç kez yıkayın. Daha sonra bakterileri tavşan anti-Aviden antikoru ile oda sıcaklığında 20 dakika boyayın.20 dakika sonra, 500 mikrolitre buz gibi soğuk PBST ile bir yıkama adımı gerçekleştirin. Daha sonra, bakterileri FITC konjuge keçi anti-tavşan IGG antikoru ile boyayın. Daha sonra, bakterileri 500 mikrolitre buz gibi soğuk PBST kullanarak yıkayın ve yüzey dekorasyonunu değerlendirmek için bakterileri akış sitometrisi ile analiz edin.Tarif edilen protokolü takip ettikten sonra, sitoloji, biyotinile edilmemiş bakterilere minimum düzeyde OVA bağlanması ve biyotinile edilmiş bakterilere önemli düzeyde OVA bağlanması olduğunu göstermektedir. Daha da önemlisi, bakteri yüzeyindeki Aviden OVA seviyeleri, liyofilizasyon ve oda sıcaklığında depolamadan bir ay sonra stabil ve tespit edilebilir kaldı. Daha sonra, bir fagositoz testi yapmak için RAW hücreleri ve dsRed bakterileri kullanıldı.Sevindirici bir şekilde, makrofaj fenotipinde caydırıcılık yoktu. Aviden OVA'nın makrofajlar içindeki BCG'lerinin kaderini incelemek için, yapışık RAW hücreleri enfekte edildi ve floresan mikroskobu ile incelendi. Aviden OVA sadece bakteri yüzeyinde mevcut değildi, aynı zamanda bakterilerden uzak sitoplazmaya ayrıldı ve trans-lokalize oldu.Bir immüno-altın boyama deneyi, Aviden OVA antijenlerinin BCG yüzeyinden ayrılabildiğini, fagozomal membranı geçebildiğini ve sitozole doğru ilerleyebildiğini gösterdi. Aviden OVA BCG ile enfekte olan makrofajlar, Avi OVA'nın IA molekülleri ile birlikte lokalizasyonunu gösterdi. Bu, Aviden füzyon proteinlerinin, MHC2 moleküllerine yüklenmek üzere antijen sunum bölmelerine ayrıldığını ve trans-local olduğunu göstermektedir.Aviden OVA peptitleri ayrıca, H2K boyama ile gösterildiği gibi, BCG fagozomları içindeki sınıf I molekülleri ile birlikte lokalize edilmiştir. Bu nedenle, makrofaj tarafından CD8 pozitif T hücrelerine Avi OVA antijeninin potansiyel sunumu vardır. Bu videoyu izledikten sonra, mikobakterilerdeki proteinleri nasıl ifade edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız ve bu organizmanın mevcut genetik yöntemlerle manipüle edilmesi zordur.Teknikten sonra, aşıyı mikobakteri antijeni ile yüklemek için altıda başarılı bir şekilde kullanıyoruz. Daha sonra, modifiye edilmiş aşıların fare modelinde spesifik immün yanıt olarak kullanma fırsatı olduğunu gösterdik. Şu anda bu yaklaşımı teratinde araştırmak için işbirliği yapıyoruz: Seçilmiş antijen veya immünbulatörlerle yükseltilmiş BCG'yi kullanmayı önerdik.

expression-exogenous-antigens-mycobacterium-bovis-bcg-vaccine-via-non

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Mikobakterilerin numaralandırma için alternatif bir yaklaşım...

Mikobakteriler canlılık Tedbir Fonksiyonel Tam Kan Testi, Reporter Gen BCG veya M. Tb (BCG Takip edilen konu kullanarak Lüks / M. Tb Lüks)

Bu video, anestezi uygulanmış bir farede sistemik inflamasyonun indüksiyonunu göstermektedir. Mikobakteriyel antijen adjuvan depolarının enjeksiyonu sitokin salınımını ve lokalize inflamasyonu tetikler. Lenfatik damarlar açılarak bağışıklık hücresinin lenf düğümlerine girmesini ve proinflamatuar sitokinleri serbest bırakan T hücrelerinin aktivasyonunu sağlayarak yaygın iltihaplanmaya yol açar.

Bir Murin Modelinde Sistemik İnflamasyonu İndüklemek için Deri Altı Bakteriyel Antijen Enjeksiyonu

Bu video, biyolüminesans testi ve koloni oluşturan birimlerin sayımı kullanılarak Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin lux inokulumunun hazırlanmasını ve miktar tayinini göstermektedir. Hazırlanan aşı enfeksiyon çalışmaları için kullanılabilir.

Enfeksiyon için Mycobacterium bovis BCG lux İnokulumunun Hazırlanması ve Miktar Tayini

Bu videoda, çok değerlikli dış zar vezikülü (OMV) aşıları oluşturmak için bir yöntem gösterilmektedir. Memeli hücreleri, bir SpyTag ve bir polihistidin etiketine kaynaşmış viral antijenleri eksprese etmek ve salgılamak için transfekte edilir. Bu antijenler daha sonra bir nikel-nitrilotriasetik asit (Ni-NTA) afinite sütunu kullanılarak saflaştırılır. Saflaştırılmış antijen, yüzeye bağlı SpyCatcher (SC) proteinini eksprese eden dış zar vezikülleri ile karıştırılır. Çoklu antijenler,...

Çok Değerlikli Gösteren Bir Dış Membran Vezikül Aşısı Oluşturulması

Video, immünojenik özelliklerini geliştirmek için Mycobacterium bovis BCG'ye antijen yükleme tekniğini göstermektedir. Yöntem, bakteri yüzeyini ekzojen antijenlerle kaplamak için avidin-biotin sistemini kullanır.

Mycobacterium bovis BCG Üzerinde Hedef Antijenlerin Sunulması İçin Bir Avidin-Biotin Konjugasyon Tekniği

Uzun süreli kültürlenmiş interferon-γ enzime bağlı immünospot deneyi merkezi bellek tepkilerinin bir ölçüsü olarak kullanılır ve koruyucu, anti-mikobakteriyel aşı cevabı ile bağıntılı olduğu ortaya konmaktadır. Bu testte, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri, mikobakteriyel antijenlerin ve interlökin-2, 14 gün için, etkinleştirme farklılaşma ve merkezi bellek T hücrelerinin genişlemesi ile stimüle edilir.

Sığırlarda Efektör ve hafıza T Hücre Yanıtları değerlendirilmesi için uzun vadeli kültürlü İnterferon-γ Enzim-linked immünospot Testi Uygulaması

Burada, fare modelinde BCG ile intranazal ve subkutan bağışıklamanın neden olduğu koruyucu etkinliği ve akciğer immün yanıtını karşılaştırmak için izlenen metodolojiyi detaylandırıyoruz. Sonuçlarımız, pulmoner aşılamanın faydalarını göstermekte ve aşı kaynaklı korumada IL17 aracılı yanıtın rolünü önermektedir.

Koruyucu etkinliği ve Pulmoner Bağışıklık Tepkisi Fare Subkutan ve Burun BCG İdaresi ardından

Mevcut protokol, dış zar veziküllerinin biyomühendisliğini, üretim, saflaştırma, biyokonjugasyon ve karakterizasyon dahil olmak üzere bir "Tak ve Göster" aşı platformu olarak tanımlamaktadır.

SARS-CoV-2 Reseptör Bağlama Etki Alanını Gösteren Dış Membran Veziküllerine Dayalı Bir "Tak ve Görüntüle" Nanopartikül Aşı Platformu

Bu protokol, Mycobacterium smegmatis'in (Msm) aksenik kültürlerinden doğal mikobakteriyel hücre dışı veziküllerin (mEV'ler) zenginleştirilmesini ve mCherry (kırmızı floresan raportör) içeren rekombinant MsmEV'lerin nasıl tasarlanabileceğini ve zenginleştirilebileceğini detaylandırır. Son olarak, Mycobacterium tuberculosis'in EsxA proteinini içeren MsmEV'lerin zenginleştirilmesiyle yeni yaklaşımı doğrulamaktadır.

Mikobakterilerin Doğal ve Rekombinant Hücre Dışı Veziküllerinin Zenginleştirilmesi

Burada, C57BL/6 farelerde deneysel otoimmün ensefalomiyeliti aktif olarak indüklemek için alternatif bir protokol sunuyoruz, ısıyla öldürülen Mycobacterium avium alt türü paratüberkülozu içeren tamamlanmamış Freund adjuvanında asılı duran immünojenik epitop miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG)35-55'i kullanıyoruz.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Sırasında Otoantijenlerin İmmünojenitesinin Arttırılmasında Mycobacterium Paratuberculosis'in Adjuvan Aktivitesi

Koloni oluşturan birimlerin (CFU) belirlenmesi, görünür koloniler oluşturması haftalar sürebilen Mycobacterium tuberculosis de dahil olmak üzere bakterilerin miktarını belirlemek için altın standart tekniktir. Burada, artan zaman verimliliği, azaltılmış laboratuvar alanı ve reaktif maliyeti ve orta ve yüksek verimli deneylere ölçeklenebilirlik ile CFU belirleme için bir mikro-CFU'yu açıklıyoruz.

Tüberküloza Karşı Aşıların Etkinlik Değerlendirmesi için Mikro Koloni Oluşturan Birim Testi

Keşfedin, Mycobacterium bovis BCG yüzeyine rekombinant proteinlerle dekorasyon yaparak hızlı antijen sunumu sağlayan bu yenilikçi yöntemi. Aşı geliştirme ve mikobakteriyoloji araştırmalarında genetik manipülasyona alternatif sunar.

Eksojen antijenleri Mycobacterium bovis BCG aşısı Avidin-biotin sistemi ile sigara genetik yüzey dekorasyon ile ifade

Daha fazla video keşfet