January 2nd, 2018
Transkript çürüme oranları izleme ve differentially çürüyen genlerin belirlenmesi için bir protokolü üreten Proliferasyona ve durgun birincil insan dermal fibroblastlar, açıklayın.
Bu prosedürün genel amacı, proliferatif ve hareketsiz fibroblastlarda transkript bozunma oranlarını izlemektir. Bu yöntem, gen ekspresyonundaki değişikliklerin transkript bozunma oranındaki değişikliklerden kaynaklanıp kaynaklanmadığı gibi moleküler biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sadece transkript bolluğu değil, transkript bozulma hızı hakkında da bilgi vermesidir.
Protokole başlamak için, fibroblastların çoğalan ve hareketsiz kültürlerini oluşturun. Prolifere fibroblastlar düzenli olarak tripsiniz edilmelidir. Durgun kültürler, plakaların düzenli ortam değişiklikleriyle birleşmesine izin verilerek oluşturulabilir.
Tüm biyolojik replike hücre kültürü plakaları için önceden ısıtılmış ortama 150 mililitre ActD 10 mikrolitre ekleyin. ActD'yi mililitre ortam başına 15 mikrogram konsantrasyonda ekleyin. Çözeltiyi iyice karıştırın.
Eski ortamı aspire edin ve hücrelere ActD içeren ortam ekleyin. Sıfır zaman noktası örneğini toplamak için, ActD ortamını nazikçe aspire edin ve beş ila 10 mililitre önceden ısıtılmış PBS'yi 100 milimetrelik bir plakaya, 100 milimetrelik bir plaka için beş mililitre çözeltiye, altı oyuklu bir plakanın kuyusu için iki mililitre ve 12 oyuklu bir plakanın kuyusu için bir mililitreye pipetleyin. PBS'yi nazikçe aspire edin.
Daha sonra fenol-guanidin izotiyosiyanat çözeltisini doğrudan doku kültürü plakasına ekleyin. Homojen bir karışım elde etmek için fenol-guanidin izotiyosiyanat çözeltisi hücre karışımını birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha önce açıklanan yöntemi kullanarak uygun süre geçtikten sonra her zaman noktasını toplayın.
RNA protein komplekslerinin tamamen çözünmesini sağlamak için numuneleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Ardından, kullanılan metodoloji ile tespit edilebilen spike-in kontrollü transkriptleri tanıtın. Bu kontrolleri her numuneye bilinen bir miktar ve konsantrasyonda ekleyin.
Bir pipet kullanarak, fenilguanidin izotiyosiyanat çözeltisi karışımını 2.0 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, kullanılan her bir mililitre fenilguanidin izotiyosiyanat çözeltisi için fenilguanidin izotiyosiyanat çözeltisi karışımına 0.2 mililitre kloroform ekleyin. Mikrosantrifüj tüpünü 15 saniye kuvvetlice çalkalayın ve ardından kloroform fenilguanidin izotiyosiyanatı inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, numuneleri dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 12.000 kez g'de döndürün. Numune üç katmana ayrılmalıdır. Sulu tabakayı bir mikropipet kullanarak yeni bir 2.0 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve bu işlem sırasında interfazı bozmamaya dikkat edin.
İnterfaz ve organik fraksiyonları atın. Daha sonra sulu fraksiyona eşit hacimde 2-Propanol ekleyin ve tüpü 10 kez ters çevirin. Özellikle verimin düşük olması bekleniyorsa, 20 mikrolitre numune başına mililitre sulu glikojen başına bir mikrolitre 20 miligram ekleyin.
Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra numuneleri döndürün. Dönüşün sonunda, RNA'nın tüpün dibinde bir süre pelet oluşturacak şekilde çökeldiğinden emin olun.
Bir pipetle, beyaz RNA peletini rahatsız etmemeye özellikle dikkat ederek süpernatanı çıkarın ve atın. Peleti yıkamak için bir mililitre fenilguanidin izotiyosiyanat çözeltisi reaktifi başına bir mililitre% 75 etanol ekleyin. Numuneleri 10 dakika boyunca 12.000 kez g'de döndürün.
Süpernatantın çoğunu çıkardıktan sonra, mümkün olduğu kadar fazla etanolü çıkarmak için bir pipet kullanın, ancak peleti rahatsız etmeyin. Tüm fazla etanolü peletlemek için numuneleri döndürür. RNA peleti bu adımda daha az kompakttır ve hareket etme eğilimindedir.
Sıkma işleminden sonra, peleti bozmadan tüpteki tüm fazla etanolü çıkarın. RNA peletinin beş dakika boyunca kurumasına izin verin. RNA peletine 50 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve peleti nükleaz içermeyen suda yeniden süspanse edin.
DNA'yı çıkarmak için bir mikrolitre Deanaz örneklerini tedavi edin ve ardından Deanaz ve katyonları inaktive edin. RNA örneklerini eksi 80 santigrat derecede 2.0 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde saklayın. RNA'yı ölçün ve bir spektrofotometre kullanarak RNA'nın saflığını kontrol edin.
Saflığı kontrol ettikten sonra, bozunma derecesini görselleştirmek için RNA'yı %1'lik bir agaroz jeli ile analiz edin. 18S ve 28S rRNA'yı temsil eden iki şeffaf bant açıkça görülebilir olmalıdır. Bu bantlar görünmüyorsa, RNA bozulabilir.
Ardından, Gerçek Zamanlı qPCR kullanarak çivili dahili standartla karşılaştırıldığında RNA'nın toplanan alikotlarındaki transkript bolluğunu izleyin. Mikrodiziler, RNA dizilimi veya kuzey lekeleri de kullanılabilir. Zaman içindeki floresan yoğunlukları gen ekspresyonuna karşılık gelir.
Fibroblastlar temas inhibe olurken, yara iyileşmesi sırasında biriken hücre dışı matrisi oluşturmak için çok önemli bir gen olan transkript kodlayan Kollajen 3A1 daha kararlı hale gelir ve eskisi kadar hızlı bozulmaz. Fenol ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve cildinize temas etmesine izin vermemenin önemli olduğunu unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, çoğalan ve hareketsiz fibroblastlarda transkript bozunma oranlarının nasıl izleneceğini iyi anlamış olmalısınız.
Transkript bozunma hızındaki değişiklikler, gen üçgenlemesinin önemli bir mekanizması olabilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Bu makale, hem çoğalan hem de dinlenen birincil insan deri fibroblastlarını üretmek için bir protokol açıklamaktadır. Transkript ayrışma oranlarının izlenmesine ve farklı şekilde ayrılan genlerin tanımlanmasına odaklanır ve gen ekspresyonu dinamikleri hakkında bilgiler sunar.
Genome-wide measurement of transcript decay rates in proliferating and quiescent human fibroblasts enables biopharma teams to distinguish regulatory mechanisms driving gene expression changes beyond transcriptional control. This approach supports mechanistic de-risking and enhances predictive confidence in target validation by clarifying whether observed gene expression differences are due to altered mRNA stability or transcriptional activity. Integrating transcript decay profiling at early discovery inflection points informs portfolio triage and prioritization of disease-relevant targets.
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, providing a reusable capability for transcriptomic analysis.