Name: Genom çapında transkript çürüme oranları Proliferasyona ve durgun insan fibroblast belirleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Öğrenin, insan dermal fibroblastlarda transkript çürüme oranlarını izlemeyi. Proliferasyon ve durgunluk durumlarında gen ifadesi dinamiklerini anlamak için bu yöntemi kullanın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

HAC Milton E. Cassel bilgin Rita Allen Vakfı (http://www.ritaallenfoundation.org) yapıldı. Bu eser mükemmellik hibe P50 GM071508 Ulusal Enstitüsü genel Tıp Bilimleri Merkezi'nden HAC (Özel Dedektif David Botstein), ilaç Vakfı Hibe 2007RSGl9572, Ulusal Bilim Vakfı Hibe OCI-1047879 David Ağustos hibe tarafından finanse edildi, Ulusal Enstitüsü genel Tıp Bilimleri R01 GM081686, Ulusal Enstitüsü genel Tıp Bilimleri R01 GM0866465, Eli &#38; Edythe geniş merkezi rejeneratif tıp &#38; kök hücre araştırmaları, Iris Cantor kadın Sağlık Merkezi/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124 ve lösemi Lenfoma Derneği. Bu yayında bildirilen Araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası P50CA092131 altında Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu. HAC Eli bir üyesidir &#38; Edythe rejeneratif tıp geniş merkezi &#38; kök hücre araştırmaları, UCLA moleküler biyoloji Enstitüsü ve UCLA Biyoinformatik bölümler arası programı.

Tüm deneyler açıklanan Princeton Üniversitesi ve University of California, Los Angeles, kurumsal inceleme kurulları tarafından kabul edildi.
1. ActD zamanlı Kurs için Proliferasyona ve iletişim inhibe fibroblastlar hazırlayın
Not: Bu protokol ile dört timepoints bir timecourse kullanır. Bir deney farklı doku kültürü levha toplayarak timepoint üç biyolojik olarak bağımsız örnekleri toplanabilir veya deneme birden çok kez farklı hücre kültürleri ile tekrar edilebilir. Deneyim, bir 10 cm (çap) doku kültürü çanak (bir tabak) analiz için yeterli RNA sağlar. Gerekirse, birden fazla doku kültürü yemekleri her timepoint, hücre sayısını artırmak her örnek için havuza. Buna ek olarak, aynı deneyi gerçekten bağımsız biyolojik çoğaltır gibi farklı bireyler izole fibroblastlar ile gerçekleştirilebilir.
<ol>
	<li>Transkript çürüme analiz için hücreleri Proliferasyona ve durgun kültürleri kurmak. İletişim inhibe hücreleri temas inhibe gelmektedir iken Proliferasyona hücreler için üç günde hücreleri bölün.
	<ol>
		<li>İlgili kişi inhibe hücreler için orta 2 günde 7 gün için değiştirin. 2 gün önce iletişim inhibe fibroblastlar koleksiyonu için hazır Proliferasyona hücreleri bölün. Bir hücre kültür düzeni örneği şekil 1' de gösterilen. Bu bölümdeki kalan adımları oluşturma ve hücreleri bölme için detaylı bir protokol sağlar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Birincil dermal fibroblastlar göre kurulan iletişim kuralları13yenidoğan cilt üzerinden ayırma. Geçit fibroblastlar içerebilen bir homojen nüfus sağlamak için. Not: Fibroblastlar dondurulmuş ve çözülmüş, gerekirse.</li>
	<li>Çözülme veya fibroblastlar, gerekirse replate. Doku kültürü kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2steril koşullarda % 10 serum ile DMEM içinde fibroblastlar büyümek. 10'dan az pasajlar için yetiştirilen olmuştur fibroblastlar kullanın. Fibroblastlar-meli var olmak &#60; % 80 birleşmesi Proliferasyona ve durgun nüfus yapmak için hücreleri bölme gün.</li>
	<li>Bir doku kültürü tabak birden çok kalıplara bölmek için PBS, tripsin ve serum 20 dk 37 ° C su banyosunda ile orta prewarm.</li>
	<li>Aspire edin veya bir damlalıklı her doku kültürü plaka kaplanarak hücrelerle orta kaldırmak için kullanın.</li>
	<li>Üzerine her plaka (150 mm plaka, 5 mL 100 mm plaka için çözüm de, bir de 6 iyi plaka için 2 mL için çözüm 10 mL) ve bir de 12 iyi plaka için 1 mL damlalıklı sıcak PBS.</li>
	<li>Aspire edin veya damlalıklı PBS her doku kültürü plaka kaldırmak için.</li>
	<li>Yavaşça damlalıklı 1 x tripsin-EDTA her plaka (8 mL 150 mm tabağı, 3 mL 100 mm plaka, bir de 6 iyi plaka için 2 mL ve 1 mL 12 iyi plaka bir kuyu için çözüm çözeltisi) üzerine. : Not 1 x steril 10 sulandrarak tarafından tripsin-EDTA tripsin-EDTA steril PBS içinde x. Son 1 x çözüm % 0.05 tripsin ve %0.02 EDTA olmalıdır.</li>
	<li>Tripsin 5 min için hücreler kuluçkaya.</li>
	<li>Plaka hücrelerden çıkarmak için plaka hafifçe dokunun.</li>
	<li>Damlalıklı hücreleri tek hücre süspansiyon resuspend.</li>
	<li>Tripsin çözüm hücrelerde DMEM aynı hacmi % 10 serum (8 mL 150 mm tabağı, 3 mL 100 mm tabağı, 2 mL 6 iyi plaka bir kuyu için çözüm çözeltisi ile içeren bir konik tüp transfer ve bir de bir 12 için 1 mL de plakası).</li>
	<li>Spin aşağı hücreleri 4 ° C'de 5 dakika tripsin kaldırmak için 1000 x g de.</li>
	<li>Uygun hacmi orta ve sayısı hücrelerde hücre konsantrasyonu belirlemek için hemacytometer ile resuspend.</li>
	<li>5 x 10 Proliferasyona için 100 mm doku kültürü plaka başına5 hücre ve hücre iletişim inhibe tohum.</li>
	<li>Bu yöntemi kullanarak, analiz (şekil 1) için gerekli Proliferasyona ve iletişim inhibe örnekleri kurmak.</li>
</ol>
2. ActD zamanlı Kurs
<ol>
	<li>ActD hisse senedi konsantrasyonu 1 mg/mL (ActD, steril PBS kullanım 950 µL ve steril DMSO 50 µL için 1 mg) resuspend. Not: ActD donmuş hisse senedi çözümleri-20 ° C'de bir aydır kararlı olmalıdır Seyreltik çözüm atılır ve daha fazla kullanmak için saklanan değil.</li>
	<li>ActD prewarmed orta uygun birime Ekle tüm biyolojik Çoğalt hücre kültürü bu Tabaklar için 0, 120, 240 ve 480 dk timepoints (Şekil 2) için ayarlanmış. ActD orta mL başına 15 µg bir konsantrasyon ekleyin. İyice karıştırın, eski orta Aspire edin ve orta ActD içeren hücrelere ekleme.
	<ol>
		<li>1 mg/mL stok için 15 µL eklemek ActD için Beher ml'de orta, örneğin, orta 100 mm tabağı, 10 mL için eklemek 150 µL ActD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sıfır timepoint örnek toplamak, yavaşça ActD orta ve damlalıklı kapalı Aspire için PBS hücreleri prewarmed. Damlalıklı çözüm 150 mm tabağı, çözüm için 100 mm plaka, bir de 6 iyi plaka için 2 mL ve bir de 12 iyi plaka için 1 mL 5 mL 10 mL.</li>
	<li>Yavaşça Aspire edin veya damlalıklı PBS kapalı. Not: Tüm adımları RNA izolasyon içeren RNase ücretsiz su, RNase free microcentrifuge tüpler ve RNase free Pipetler ile yapılmalıdır. Eldiven giyilir ve RNA ile çalışırken sık sık değişti.</li>
	<li>Fenol-guanidin isothiocyanate çözüm (4 x 105 4 x 107 hücrelere 1 mL/10-cm tabak) doku kültürü plakasına ekleyin. Not: Hücreleri lysing ve RNA, DNA ve protein birbirinden ayıran ise RNA kalitesini korur bir monophasic çözüm fenol-guanidin isothiocyanate çözümdür. Dikkat: Fenol ve guanidin isothiocyanate aşındırıcı. Uygun koruma kullanın.</li>
	<li>Damlalıklı fenol guanidin isothiocyanate çözüm hücreli karışımı homojen bir karışım yapmak birkaç kez yukarı ve aşağı. Not: Fenol-guanidin isothiocyanate çözüm lysate gecede 4 ° C'de veya -20 ° C'de için bir yıl kadar saklanabilir.</li>
	<li>Adımları 2.3-2,6 açıklanan yöntemi kullanarak uygun süreyi geçtikten sonra her zaman noktası toplamak.</li>
</ol>
3. Lysate fenol-guanidin Isothiocyanate çözümden toplam RNA izolasyonu
<ol>
	<li>Örnekleri, oda sıcaklığında RNA-protein kompleksleri tam çözünme sağlamak 5 min için kuluçkaya. Not: Adım fenol-guanidin isothiocyanate çözüm protokolünün oda sıcaklığında aksi belirtilmedikçe gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Kullanılan metodoloji ile tespit edilebilir spike kontrol transkript tanıtmak.</li></ol>Bu denetimleri içine her örnek, bir bilinen miktar ve konsantrasyon tanıtmak. Not: Harici RNA denetim Konsorsiyumu (ERCC) spike kontrol mix '14 özellikle spike denetimdir RNA-devamı için tasarlanmıştır Ayrıca Kuzey lekesi veya gerçek zamanlı qPCR için kullanılabilir. Mikroarray teknolojileri için özel olarak tasarlanmış spike içinde de kullanılabilir (bakınız Tablo reçetesi) denetimleridir.
	<li>Fenol-guanidin isothiocyanate çözüm karışımı bir pipet ile 2.0 mL microcentrifuge tüp aktarın. Fenol-guanidin isothiocyanate çözüm karışımı için her 1 mL kullanılan fenol-guanidin isothiocyanate çözeltisi 0.2 mL kloroform ekleyin (örneğin, 0.3 mL kloroform 1,5 mL fenol-guanidin isothiocyanate çözüm karışıma ekleyin).</li>
	<li>Microcentrifuge tüp 15 için şiddetle sallamayın s ve kloroform-fenol-guanidin isothiocyanate karışımı 3 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>4 ° C'de 20 dakikadır örnekleri 12.000 x g de spin Not: ilk tur sonra örnek 3 katmanlara - kırmızı organik katman alt, beyaz/pembe Interphase orta ve üst (şekil 3) açık sulu bir katmanda ayrı olmalıdır.</li>
	<li>Sulu katman bir micropipette kullanarak bir yeni 2.0 mL microcentrifuge tüp için transfer. Not: Bu işlem sırasında Interphase rahatsız etmek dikkat et. Bazı sulu kesir bırakmak iyidir. Ayrıca bazı Interphase dahil olarak interfaz katmanların dahil etmek için katman RNA DNA ile kontamine daha sulu kesir kısmını terk etmek iyidir. Eğer fenol-guanidin isothiocyanate çözüm/kloroform karışımı 1,8 mL sulu katman ilk birimin, yani yaklaşık 0.9 mL yaklaşık olacak.</li>
	<li>Interphase ve organik kesirler atmak.</li>
	<li>2-propanol eşit bir hacmi sulu kesir ekleyin ve tüp 10 kez tersine çevirin. Özellikle verim 10'dan az6 hücre toplanan çünkü düşük olması bekleniyor, en çok 1 µL glikojen örneği, 20 µL başına 20 mg/mL sulu çözüm ekleyin. Not: Bu sonraki spin adımlar sonra izlemek kolay bir yoğun, katı Pelet sonuçlanır.</li>
	<li>Örnekleri, oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.</li>
	<li>4 ° C'de 20 dakikadır örnekleri 12.000 x g de spin Emin, bu tur sonunda, RNA tüpün dibinde beyaz bir Pelet kurmaya çöktürülmüş.</li>
	<li>Bir pipet ile kaldırmak ve beyaz RNA Pelet bozmamaya özen alarak süpernatant atın. Not: el düzenlenen gevşek damlalıklı bahşiş aşırı etanol kaldırmak için kullanılabilir. RNA Pelet rahatsız ama değil atılır, araştırmacı spin tekrar ve tekrar süpernatant kaldırın. Bu tüm yordamı yineleyin için Dedektif gerektirir gibi Pelet atma önlemek.</li>
	<li>% 75 etanol ve % 25 nükleaz ücretsiz su çözeltisi hazırlamak. 1 mL % 75 etanol fenol-guanidin isothiocyanate çözüm reaktif Pelet yıkamak için 1 mL başına ekleyin.</li>
	<li>Örnekleri 12.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de spin</li>
	<li>Süpernatant çoğunu kaldırdıktan sonra bir damlalıklı hala Pelet rahatsız etmek Bakımı sırasında mümkün olduğu kadar etanol kaldırmak için kullanın. Not: RNA Pelet Bu adımda daha az kompakt ve hareket eğilimi. Bu noktada RNA kaybetmemek için Pelet ele alırken çok dikkat.</li>
	<li>Örnekleri 12.000 x g tüm aşırı etanol cips için oda sıcaklığında 2 min için spin.</li>
	<li>Tüm aşırı etanol Pelet bozmamaya dikkat çekici bir micropipette kullanarak tüm tüpünden kaldırın.</li>
	<li>5 min için Kuru RNA Pelet hava girsin.</li>
	<li>RNA Pelet 50 µL nükleaz ücretsiz su ekleyin ve Pelet nükleaz ücretsiz su resuspend.</li>
	<li>1 µL örnekleriyle tedavi Dnaz (2 adet/DNA kaldırıp Dnaz ve katyonlar (bkz. Tablo reçetesi) devre dışı bırakabilirsiniz için µL).</li>
	<li>RNA örnekleri 2.0 mL microcentrifuge tüpler-80 ° C'de depolayın</li>

4. analiz transkript bereket
<ol>
	<li>RNA ölçmek ve RNA bir Spektrofotometre kullanarak saflık için atın. Not: 260 Absorbans oranı nm için 280 nm yaklaşık 2.0 RNA için olmalıdır.</li>
	<li>RNA % 1'özel jel veya bozulma ölçüde görselleştirmek için eşdeğer bir teknoloji ile analiz. Not: İki 18S temsil eden bantları temizleyin ve 28S rRNA açıkça görülebilir (şekil 4) olmalıdır. Bu grup görünür değilse, RNA bozulmuş. Sorun çekim ipuçları RNA bozulması için tartışmaya sağlanır.</li>
	<li>Monitör transkript bolluk içinde RNA'ın toplanan aliquots kullanarak microarrays15, RNA-Seq16, gerçek zamanlı qPCR17çivili içinde iç standart ile karşılaştırıldığında veya Kuzey18engelliyor.
	<ol>
		<li>Bereket her transkript bir çivili denetimi bilinen bereket ile karşılaştırıldığında her zaman noktasında için belirleyin. Not: microarrays için Floresans yoğunluklarda değerleri olacaktır. Kuzey lekesi için röntgen film bands sayısal. Gerçek zamanlı qPCR için transkript bereket 2- σσCT yöntemi19ile bilinen standartları yasland belirlenebilir. RNA-Seq için normalleştirilmiş değerleri FPKM veya eşlenen milyon okuma başına exon kilobaz başına parça olarak belirlenebilir. İzoformu özgü çürüme oranları için RNA-Seq veri DEXSeq20gibi izoformu farkında yöntemlerini kullanarak analiz edilebilir. İzoformu özgü çürüme oranları en iyi RNA-devamı ile belirlenir Eğer onlar Mikroarray verilerle tespit edilecek, sonra verileri bir gen gen olarak yerine bir prob prob olarak çözümlenmesi gerekir. Çözümleyici bilgi sınırlı sayıda probları, üzerinden yorumlarken dikkatli olmanız gerekir. Örneğin, belirli bir izoformu hakkında bilgilendirici 5 veya daha az probları olabilir. Bu durumda, analist sonuçların güvenilir olması bu sondalar davranışını yeterince tutarlı olup olmadığını belirlemek gerekir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>C-Myc ve yavaş yavaş çürüyen bir gen GAPDH o transkript çürüme oranları doğru bir şekilde tespit edildi güven kazanmak için gibi gibi hızla çürüyen genler analiz etmek için toplanan örneklerinde izole RNA17 üzerinde gerçek zamanlı qPCR gerçekleştirin. Not: daha fazla onay için izoformu özel gerçek zamanlı qPCR sondalar olabilir geliştirilen ve belirli izoformlarının bolluk saat21izlemek için kullanılır.</li>
</ol>
5.Çürüme oranı sabit belirlenmesi
<ol>
	<li>Her timepoint için günlüğü-her transkript (gene özgü veya izoformu özgü) için bolluk değerleri dönüştürme. Not: Günlük-dönüşüm değerleri üstel çürüme eğrileri ile doğrusal çürüme model22uygun satırları dönüştürecektir.</li>
	<li>Bir doğrusal çürüme modeli her transkript (gene özgü veya izoformu özgü) ifade profile uyuyor. Böyle bir model için f(t) formülüdür = C - r * t. Bu denklemdeki C bir transkript başlangıç miktarını temsil eden bir sabittir, r hızı ise t zaman deneme başından beri. Bu denklemden çürüme oranı r*ln(10) olarak belirlemek (başvuru11bakınız). Not: MaSigPro regresyon dayalı yaklaşım önemli gen ifade profil saat ders veri23farklılıkları algılamak için tasarlanmış bir yazılım paketidir. Örnek kod ve maSigPro için sonuçlar elde edilebilir vasıl: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf.</li>
	<li>Log-doğrusal çürüme modeli sığacak şekilde başarısız genlerin filtre. Bu ANOVA F-test ile gerçekleştirilebilir. Not: F sınaması varyasyon tanımlanan F-istatistik dayalı örnekleri içinde değişim bölü örnek ortalamaları arasındaki. Doğrusal step-up Benjamini ve Hochberg yanlış bulma yordamı24uygulayarak birden fazla karşılaştırmalar için p değerleri düzeltin. Q 0,05 F-sınaması ile daha büyük değer için log-doğrusal çürüme modeli sığacak şekilde başarısız gen bir kesim kullanılabilir.</li>
	<li>Tutanaklar bir kategorik hücre döngüsü koşul ve saat arasında önemli bir etkileşimde terimi ile belirlemek için bir ANOVA F sınaması gerçekleştirmek (yanlış bulma oranı, FDR &#60; 0,05).</li>
</ol>

<ol><li>Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+reveals+multiple+pathways+for+unique+regulation+of+mRNA+decay+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells.</a> Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).</li>
<li>Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+decay+in+resting+and+activated+primary+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes.</a> Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).</li>
<li>Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+gene+expression+during+T+cell+activation%3A+alternate+regulation+of+mRNA+transcription+and+mRNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability.</a> BMC Genomics. 6, 75(2005).</li>
<li>Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decay+rates+of+human+mRNAs%3A+correlation+with+functional+characteristics+and+sequence+attributes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes.</a> Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).</li>
<li>Hao, S., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability+of+mRNA+influences+the+temporal+order+of+the+induction+of+genes+encoding+inflammatory+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules.</a> Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).</li>
<li>Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+description+of+cellular+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A new description of cellular quiescence.</a> PLoS Biol. 4 (3), 83(2006).</li>
<li>Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cap-to-tail+guide+to+mRNA+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cap-to-tail guide to mRNA turnover.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).</li>
<li>Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+highways+and+byways+of+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The highways and byways of mRNA decay.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).</li>
<li>Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+network+regulates+proliferative+timing+and+extracellular+matrix+synthesis+during+cellular+quiescence+in+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts.</a> Genome Biol. 13 (12), 121(2012).</li>
<li>Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+degradation+controls+differentiation+state-dependent+differences+in+transcript+and+splice+variant+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance.</a> Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).</li>
<li>Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Database+for+mRNA+half-life+of+19+977+genes+obtained+by+DNA+microarray+analysis+of+pluripotent+and+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells.</a> DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).</li>
<li>Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+changes+in+mRNA+stability+contribute+to+quiescence-specific+gene+expression+patterns+in+a+fibroblast+model+of+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence.</a> BMC Genomics. 18 (1), 123(2017).</li>
<li>Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((let-7+Overexpression+leads+to+an+increased+fraction+of+cells+in+G2%2FM%2C+direct+down-regulation+of+Cdc34%2C+and+stabilization+of+Wee1+kinase+in+primary+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts.</a> J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).</li>
<li>Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+spike-in+standards+for+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments.</a> Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).</li>
<li>Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+gene+expression+measurements+from+commercial+microarray+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms.</a> Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Wong, M. L., Medrano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+for+mRNA+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR for mRNA quantitation.</a> Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).</li>
<li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Anders, S., Reyes, A., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+differential+usage+of+exons+from+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Detecting differential usage of exons from RNA-seq data.</a> Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).</li>
<li>Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+splice+variants+using+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Quantification of splice variants using real-time PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).</li>
<li>Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+mammalian+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The kinetics of mammalian gene expression.</a> Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).</li>
<li>Conesa, A., Nueda, M. R package version 1.46.0. maSigPro: Significant Gene Expression Profile Differences in Time Course Gene Expression Data. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://bioinfo.cipf.es">http://bioinfo.cipf.es</a> (2016).</li>
<li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.citeulike.org/user/ccr/article/1042553">Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).</li>
<li>Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+contact+globally+activates+microRNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).</li>
<li>Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+principles+of+mammalian+transcriptional+regulation+revealed+by+RNA+half-life%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life.</a> Nucleic Acids Res. 37 (17), 115(2009).</li>
<li>Soeiro, R., Amos, H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0005278766903832">mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells - A caution.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).</li>
<li>Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+mRNA+decay%3A+methodologies%2C+pathways%2C+and+links+to+other+stages+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression.</a> J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).</li>
<li>Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Messenger+RNA+half-life+measurements+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells.</a> Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).</li>
<li>Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+polyadenylation+diversifies+post-transcriptional+regulation+by+selective+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions.</a> Mol Syst Biol. 10, 719(2014).</li>
<li>Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+isoform+half-lives+reveals+stabilizing+and+destabilizing+elements+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast.</a> Cell. 156 (4), 812-824 (2014).</li>
<li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anchor-away+technique%3A+rapid%2C+conditional+establishment+of+yeast+mutant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes.</a> Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).</li>
<li>Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthetic+labeling+of+RNA+with+uracil+phosphoribosyltransferase+allows+cell-specific+microarray+analysis+of+mRNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay.</a> Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).</li>
<li>Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+RNA+uncovers+principles+of+RNA+production+and+degradation+dynamics+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).</li>
<li>Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+dynamics+of+microRNAs+revealed+by+a+novel+pulse-chase+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach.</a> Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa etmek rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip.

Sendika mitogens veya serum geri çekilmesi, hücre adezyon ve iletişim inhibisyon eksikliği de dahil olmak üzere dış sinyalleri tarafından indüklenen. Temas inhibisyonu, sendika, inducing için birden fazla olası yönteminden birini hücreleri hücre hücre kişiye yanıt proliferatif Hücre döngüsünde çıkmak çok örümceklerle korunmuş bir süreçtir. Temas inhibisyonu sendika ikna etmek için bir yöntem örneği olarak üzerinde odaklanabilir. Önceki çalışmalarda hücre-hücre iletişim mikroRNA Biyogenez25etkileye...

Transkript düzeyde kararlı duruma katkı transkript sentezi ve transkript çürüme yansıtır. Düzenlenmiş ve koordine transkript çürüme biyolojik süreçlerin1,2,3,4kontrol etmek için önemli bir mekanizmadır. Örneğin, transkript çürüme oranları etkinleştirme aşağıdaki olaylar zamansal serisi için katkıda bulunmak için inflamatuar sitokin tümör nekrozis faktör5tarafından gösterilmiştir.
Biz daha önce yayılması ve birincil insan fibroblast sendika arasında geçiş değişiklikleri birçok genler6transkript düzeyleri ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu değişikliklerin bazıları bu iki devlet arasında transkripsiyon faktörleri Faaliyet farklılıkları yansıtmaktadır.
Transkript'ın çürüme oranı değişiklikleri de değişiklikleri bir transkript iki farklı devletler7,8ifade düzeyde katkıda bulunabilir. Yayılması ve sendika arasında geçiş değişiklikleri birden çok mikroRNA'lar9düzeyleri ile ilişkili olduğunu bizim önceki bulgular dayanarak, biz de değişiklikleri fark transkript çürümesi bir katkı olup sordu karşı sakin fibroblastlar Proliferasyona içinde gen ekspresyonu.
Transkript istikrar izlemek için transkript genom genelinde karşı sakin hücreleri Proliferasyona çürüme oranı belirlenir. Bunu başarmak için yeni transkripsiyon bir inhibitörü tanıtımı ve hangi zaman içinde bireysel transkript kayboldu oranı izleme karşı sakin fibroblastlar Proliferasyona içinde çürüme oranları izlenir. Bu yaklaşımın avantajı yeni transkript sentezini inhibe tarafından genel gen ekspresyonu, sade bir şekilde izlemek yöntemleri ile karşılaştırıldığında, biz bu Tutanaklar ayrı ayrı hangi onlar are kurundan çürüme oranı belirlemek mümkün olmasını, olur transkripsiyonu.
ActD tedavi yeni transkripsiyonu inhibe ve transkript çürüme hızı birden çok önceki çalışmalarda başarıyla uygulandı. ActD pro-inflamatuar sitokinlerin5ile tedavi sonucu transkript bolca RNA istikrar değişiklikleri önemini incelemek için kullanılmıştır. Benzer bir yaklaşım da farklı kas fenotip10evlat edinmek gibi farklılaştırılmış C2C12 hücreleri karşı Proliferasyona transkript çürüme oranı farklılıkları incelemek için kullanılmıştır. Başka bir örnek olarak, küresel mRNA yarı-hayat da pluripotent tespit edildi ve11farklı fare embriyonik kök hücreleri. Bu örneklerde, mRNA decay transkript bereket düzenleyen ve farklı hücre Birleşik hücrelere geçiş için önemli olduğu gösterilmiştir.
Aşağıda açıklanan yöntemleri uygulayarak, biz fibroblastlar Proliferasyona ve durgun Birleşik12karşılaştırırken transkript çürüme oranları yaklaşık 500 genlerdeki değişikliklerin keşfetti. Özellikle, keşfettiğimiz hücreler sendika için geçiş ne zaman downregulated deneniyor hücrelerdeki olduğunu, mikroRNA miR-29hedeflerini stabilize. Biz burada Proliferasyona ve durgun hücrelerdeki çürüme oranları belirlemek için kullanılan yöntemleri açıklar. Bu yöntemi hızla çürüyen genler hakkında bilgi aranan zaman küresel mRNA decay oranları iki ayrı benzer koşullar içinde karşılaştırmak için yararlıdır. İki boyutlu üç boyutlu kültürler içinde hücre kültür koşulların transkript çürüme, örneğin, üzerinde etkisi gibi diğer soruları gidermek de kullanılabilir. Çürüme oranları microarrays veya RNA-Seq. alternatif olarak, gerçek zamanlı qPCR gibi yöntemler ile kararlı genom çapında olabilir veya Kuzey kurutma çürüme oranları gen gen veya izoformu izoformu olarak belirlemek için kullanılabilir. Bu oranları daha sonra izlenen her gen half-life hesaplamak ve iki koşullarında farklı çürüme oranları ile genlerin tanımlamak için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>12.000 x g ve 4 ° C'ye ulaşabilen mikrosantrifüj tüpleri için santrifüjler; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroz jelleri</td><td></td><td></td><td></td>çalıştırmak için ekipman</tr><tr><td>Steril doku kültürü plakaları ve konik tüpler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>VWR</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü için steril serolojik pipetler, pipetleyiciler ve pipet uçları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA izolasyonu ve analizi</td><td></td><td></td><td></td>için ayrı ayrı sarılmış, tek kullanımlık Rnaz içermeyen pipetler, pipet uçları ve tüpler</tr><tr><td>Reaktifler ve RNA numuneleri</td><td></td><td></td><td></td>kullanılırken giyilecek tek kullanımlık eldivenler</tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td> RNase 2.0 ml eppendorf <td>tüplerinden çalışma yüzeylerini</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> dekontamine etmek için<tr><td>Tripsin-EDTA&nbsp; Çözüm 10X</td><td>Millipore Sigma</td><td>9002-07-07</td><td></td></tr><tr><td>Steril PBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Aktinomisin D</td><td>Millipore Sigma</td><td>A1410-2 mg</td><td>transkripsiyonu inhibe eder</td></tr><tr><td>Aktinomisin D</td><td></td><td></td><td></td> için steril DMSO Fisher Scientific 31-761-00ML çözücü</tr><tr><td>Kloroform</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ICN19400225</td><td>MP Biomedicals, Inc ürünü</td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>BP2618500</td><td>moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP28184</td><td>moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>RNaz içermeyen Glikojen (20 mg / ml sulu çözelti) RNA</td> <td>çökeltmesi</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>için Thermo Fisher Scientific R0551 taşıyıcıTURBO DNA'sız Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1907</td><td>, DNaz ile DNA'yı çıkarır, daha sonra bir sonraki adımda&nbsp; DNA'yı inaktive eder ve iki değerlikli katyonları uzaklaştırır</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ICN820721</td><td>MP Biomedicals, Inc ürünü</td></tr><tr><td>RNA jeli için yükleme boyası</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0641</td>, <td>elektroforezin denatüre edilmesi için bile uygundur</td></tr><tr><td>Millenium RNA belirteçleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7150</td><td>RNA merdiveni</td></tr><tr><td>Tek Renkli RNA Spike-in Kiti</td><td>Agilent Technology</td><td>5188-5282</td><td>Agient mikrodizi analizi için örnek spike-in kontrolü</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>moleküler biyoloji sınıfı, TAE tamponu için</td></tr><tr><td>Buzul asetik asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>TAE tamponu</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher için Bilimsel</td><td>BP120-500</td><td>elektroforez sınıfı, jeller için</td></tr><tr><td>Moleküler biyoloji için</td><td>Etidyum bromür</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7637</td></tr><tr><td>Harici RNA Kontrolleri Konsorsiyumu RNA Spike-in Karışımı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4456740</td><td>RNA Seq için Spike-in kontrolü</td></tr><tr><td>TruSeq Örgülü mRNA Kütüphanesi Hazırlama Kiti A (48 örnek, 12 indeks)</td><td>RNA Seq için</td> <td>Illumina</td><td>RS-122-2101</td></tr><tr><td>96 kuyucuklu 0,3 ml PCR plakası</td><td>Gerçek zamanlı qPCR için</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0600</td></tr><tr><td>Microseal B yapışkan contalar</td><td></td><td>Gerçek zamanlı qPCR</td><td></td></tr><tr><td>Rnase/Dnassız Reaktif Rezervuarları</td> için Bio-Rad MSB1001 Gerçek <td>zamanlı qPCR için</td><td>VWR</td><td>89094-662</td></tr><tr><td>Rnase/Dnassız Sekiz tüp şeridi ve kapağı</td><td>Gerçek zamanlı qPCR</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>için Thermo Fisher Scientific AM12230Gerçek zamanlı qPCR için SuperScript Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18090010 AMPure XP Beads</td><td>gerçek zamanlı qPCR için</td> <td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td></tr></tbody></table>

genom çapında transkript çürüme oranları proliferasyona ve durgun insan fibroblast belirleme

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Sendika hangi hücreleri hücre bölünmesi kesildiği tarih var, ancak kapasitesi çoğalırlar korumak tersine çevrilebilir, geçici bir durumdur. Bizimki de dahil olmak üzere birden fazla çalışmalar sendika gen ekspresyonu yaygın değişiklikler ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu değişikliklerin bazıları düzeyi veya etkinlik E2F ve MYC gibi nükleer silahların yayılmasına karşı ilişkili transkripsiyon faktörlerin değişiklikleri yoluyla ortaya çıkar. MRNA decay gen ekspresyonu Proliferasyona ve durgun hücreler arasında değişimler de katkıda bulunabilir göstermiştir. Bu protokol için insan dermal sünnet fibroblastlar Proliferasyona ve durgun kültürleri oluşturma yordamı açıklanmaktadır. O zaman Actinomycin D (ActD) ile Proliferasyona ve durgun hücrelerdeki yeni transkripsiyonu inhibe için yordamlar açıklar. ActD tedavi transkript çürüme yeni transkripsiyon dissociating için basit ve tekrarlanabilir bir yaklaşım temsil eder. Bir ActD tedavi ActD hücre canlılığı etkilediğinden zamanlı Kurs için bir kısa zaman dilimi sınırlı olmalıdır dezavantajdır. Transkript düzeyleri transkript çürüme hızı için zaman içinde izlenir. Bu yordam, genler ve karşı sakin fibroblastlar Proliferasyona içinde fark çürüme sergi izoformlarının tanımlanması için verir.

Transkript çürüme oranları Proliferasyona ve iletişim inhibe birincil insan fibroblast Mikroarray analizleri sonuçlarını daha önce üzerinde bir 8 saatlik ders12bildirdin. Genler ile Proliferasyona ve iletişim inhibe fibroblastlar karşılaştırma transkript istikrar önemli bir değişiklik listesi ek tablo 1' de sağlanır. Floresans yoğunluklarda zaman sıfır ve ActD tedavisinden sonra bir saat ders üzerinde sağlanır. Genler listede önemli ölçüde farklı y...

Transkript çürüme oranları izleme ve differentially çürüyen genlerin belirlenmesi için bir protokolü üreten Proliferasyona ve durgun birincil insan dermal fibroblastlar, açıklayın.

Genom çapında transkript çürüme oranları Proliferasyona ve durgun insan fibroblast belirleme

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Bu prosedürün genel amacı, proliferatif ve hareketsiz fibroblastlarda transkript bozunma oranlarını izlemektir. Bu yöntem, gen ekspresyonundaki değişikliklerin transkript bozunma oranındaki değişikliklerden kaynaklanıp kaynaklanmadığı gibi moleküler biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sadece transkript bolluğu değil, transkript bozulma hızı hakkında da bilgi vermesidir.Protokole başlamak için, fibroblastların çoğalan ve hareketsiz kültürlerini oluşturun. Prolifere fibroblastlar düzenli olarak tripsiniz edilmelidir. Durgun kültürler, plakaların düzenli ortam değişiklikleriyle birleşmesine izin verilerek oluşturulabilir.Tüm biyolojik replike hücre kültürü plakaları için önceden ısıtılmış ortama 150 mililitre ActD 10 mikrolitre ekleyin. ActD'yi mililitre ortam başına 15 mikrogram konsantrasyonda ekleyin. Çözeltiyi iyice karıştırın.Eski ortamı aspire edin ve hücrelere ActD içeren ortam ekleyin. Sıfır zaman noktası örneğini toplamak için, ActD ortamını nazikçe aspire edin ve beş ila 10 mililitre önceden ısıtılmış PBS'yi 100 milimetrelik bir plakaya, 100 milimetrelik bir plaka için beş mililitre çözeltiye, altı oyuklu bir plakanın kuyusu için iki mililitre ve 12 oyuklu bir plakanın kuyusu için bir mililitreye pipetleyin. PBS'yi nazikçe aspire edin.Daha sonra fenol-guanidin izotiyosiyanat çözeltisini doğrudan doku kültürü plakasına ekleyin. Homojen bir karışım elde etmek için fenol-guanidin izotiyosiyanat çözeltisi hücre karışımını birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha önce açıklanan yöntemi kullanarak uygun süre geçtikten sonra her zaman noktasını toplayın.RNA protein komplekslerinin tamamen çözünmesini sağlamak için numuneleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Ardından, kullanılan metodoloji ile tespit edilebilen spike-in kontrollü transkriptleri tanıtın. Bu kontrolleri her numuneye bilinen bir miktar ve konsantrasyonda ekleyin.Bir pipet kullanarak, fenilguanidin izotiyosiyanat çözeltisi karışımını 2.0 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, kullanılan her bir mililitre fenilguanidin izotiyosiyanat çözeltisi için fenilguanidin izotiyosiyanat çözeltisi karışımına 0.2 mililitre kloroform ekleyin. Mikrosantrifüj tüpünü 15 saniye kuvvetlice çalkalayın ve ardından kloroform fenilguanidin izotiyosiyanatı inkübe edin.İnkübasyondan sonra, numuneleri dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 12.000 kez g'de döndürün. Numune üç katmana ayrılmalıdır. Sulu tabakayı bir mikropipet kullanarak yeni bir 2.0 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve bu işlem sırasında interfazı bozmamaya dikkat edin.İnterfaz ve organik fraksiyonları atın. Daha sonra sulu fraksiyona eşit hacimde 2-Propanol ekleyin ve tüpü 10 kez ters çevirin. Özellikle verimin düşük olması bekleniyorsa, 20 mikrolitre numune başına mililitre sulu glikojen başına bir mikrolitre 20 miligram ekleyin.Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra numuneleri döndürün. Dönüşün sonunda, RNA'nın tüpün dibinde bir süre pelet oluşturacak şekilde çökeldiğinden emin olun.Bir pipetle, beyaz RNA peletini rahatsız etmemeye özellikle dikkat ederek süpernatanı çıkarın ve atın. Peleti yıkamak için bir mililitre fenilguanidin izotiyosiyanat çözeltisi reaktifi başına bir mililitre% 75 etanol ekleyin. Numuneleri 10 dakika boyunca 12.000 kez g'de döndürün.Süpernatantın çoğunu çıkardıktan sonra, mümkün olduğu kadar fazla etanolü çıkarmak için bir pipet kullanın, ancak peleti rahatsız etmeyin. Tüm fazla etanolü peletlemek için numuneleri döndürür. RNA peleti bu adımda daha az kompakttır ve hareket etme eğilimindedir.Sıkma işleminden sonra, peleti bozmadan tüpteki tüm fazla etanolü çıkarın. RNA peletinin beş dakika boyunca kurumasına izin verin. RNA peletine 50 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve peleti nükleaz içermeyen suda yeniden süspanse edin.DNA'yı çıkarmak için bir mikrolitre Deanaz örneklerini tedavi edin ve ardından Deanaz ve katyonları inaktive edin. RNA örneklerini eksi 80 santigrat derecede 2.0 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde saklayın. RNA'yı ölçün ve bir spektrofotometre kullanarak RNA'nın saflığını kontrol edin.Saflığı kontrol ettikten sonra, bozunma derecesini görselleştirmek için RNA'yı %1'lik bir agaroz jeli ile analiz edin. 18S ve 28S rRNA'yı temsil eden iki şeffaf bant açıkça görülebilir olmalıdır. Bu bantlar görünmüyorsa, RNA bozulabilir.Ardından, Gerçek Zamanlı qPCR kullanarak çivili dahili standartla karşılaştırıldığında RNA'nın toplanan alikotlarındaki transkript bolluğunu izleyin. Mikrodiziler, RNA dizilimi veya kuzey lekeleri de kullanılabilir. Zaman içindeki floresan yoğunlukları gen ekspresyonuna karşılık gelir.Fibroblastlar temas inhibe olurken, yara iyileşmesi sırasında biriken hücre dışı matrisi oluşturmak için çok önemli bir gen olan transkript kodlayan Kollajen 3A1 daha kararlı hale gelir ve eskisi kadar hızlı bozulmaz. Fenol ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve cildinize temas etmesine izin vermemenin önemli olduğunu unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, çoğalan ve hareketsiz fibroblastlarda transkript bozunma oranlarının nasıl izleneceğini iyi anlamış olmalısınız.Transkript bozunma hızındaki değişiklikler, gen üçgenlemesinin önemli bir mekanizması olabilir.

determining-genome-wide-transcript-decay-rates-proliferating

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Biz Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak) ve embriyonik kök hücreleri (ES) kromatin protein dinamiklerini izlemek için (FLIP) Photobleaching Floresan kaybı da dahil olmak üzere photobleaching yöntemleri açıklanmaktadır. Kromatin plastisite çalışma araçlarının biri olarak kabul edilir Kromatin protein dinamiği, pluripotent hücreler geliştirilmiş.

Embriyonik Kök Hücreler Yaşayan Kromatin Protein Dynamics Tedbir Tahliller (sıkı bağlamak ve FLIP) Photobleaching

RNA polimeraz II transkripsiyonel kinetiği canlı hücrelerin belirli genlerin ölçülür. ilgi gen transkripsiyonu mRNA'ların floresan etiketli ve (sıkı bağlamak) in vivo kinetiği transkripsiyonel uzama elde edilir Photobleaching sonra Floresan Recovery programını kullanarak.

Tek Yaşayan Hücreler mRNA Transkripsiyon Kinetik Ölçüm

Toplam hücresel RNA, kısa vadeli RNA sentezi ve çürüme değişikliklerin yanı sıra, RNA işleme kinetiğini incelemek için kötü bir şablon sağlar. Burada, 4-thiouridine ile yeni kopyalanan RNA metabolik etiketlenmesi tarif, bu sınırlılıkların üstesinden gelmek için izin veren yeni transkripsiyonu RNA tiyol-spesifik bir biotinilasyon ve saflaştırma takip etti.

Hücre Kültürü RNA sentezi, İşleme ve Çürüme Yüksek Çözünürlük Gen İfadesi Profil için Yeni Transkripsiyonu RNA Metabolik Etiketleme

Belirli mRNA'ların sabit durum seviyesi mRNA sentezi ve çürüme oranı ile tespit edilir. Genom mRNA azalma oranları ve özel mRNA bozunma oranları mRNA'nın yarı ömürleri saptanmasıyla ölçülebilir. Bu protokol Saccharomyces cerevisiae mRNA bozunma oranlarının ölçümü üzerinde duruluyor.

MRNA Çürüme Oranlarının Ölçümü<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</emKullanma&gt;<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Suşlar

Bu iletişim kuralı protein yarı-tek yaşam yapisan hücrelerde, hayatını darbe etiketleme ve floresan hızlandırılmış görüntüleme ek-etiket füzyon proteinlerin kullanarak belirlemek için bir yöntem açıklanır.

Tek hücreli miktar Protein yıkımı oranları hızlandırılmış Floresans mikroskobu yapisan hücre kültüründe tarafından

Nükleer silahların yayılmasına karşı geçiş ve neurite çıkıntı kez nöropsikiyatrik hastalık tedirgin gibi nörogelişimsel işler. Böylece, biz hızla ve tekrarlanarak insan IPSC kaynaklı NPCs bu nörogelişimsel işlemlerde değerlendirmek için protokolleri mevcut. Bu iletişim kuralları da ilgili büyüme faktörleri ve tedavi etkileri NPC gelişimi üzerine bir değerlendirme sağlar.

Hızlı algılama nörogelişimsel fenotipleri insan sinir habercisi hücrelerdeki (NPCs)

Bu iletişim kuralı ChIP-seq, 4sU seq, toplam RNA-seq ve hücre satırları ve Primer hücre için profil oluşturma ribozom Kombinatorik kullanımını açıklar. Transkripsiyon faktörü de novo transkripsiyon, RNA işlenmesi, ciro ve çeviri zamanla, bağlama ve olayların genel gidişatı harekete geçirmek ve/veya hızla değişen hücrelerde görüntüleme izleme değişiklikleri sağlar.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Burada, bir pipet elektroporasyon tekniğiile birleştiğinde indüklenebilir bir ifade sistemi kullanılarak primer alveoler epitel hücrelerinde bir transkript posttranskripsiyonel modülasyonu incelemek için kullanılabilecek bir araç salıyoruz.

Primer Alveolar Epitel Hücrelerde MRNA Transkriptlerinin Kararlılığının Araştırılması için Etkili Transkripsiyonel Kontrollü Plazmid Ekspresyon Sistemi

Bu protokol, yaşlanan ve bölünmeyen hücrelerin darbeli SILAC, hedefsiz kütle spektrometrisi analizi ve protein yarı ömürlerinin kolaylaştırılmış bir hesaplaması ile metabolik etiketlenmesi için iş akışını açıklar.

Metabolik Etiketleme ve Kütle Spektrometrisi ile Yaşlanan ve Bölünmeyen Kültürlü Hücrelerde Protein Devir Hızlarının Ölçülmesi

Bu protokol, fare embriyonik kök hücrelerinde intergenik ve intragenik güçlendirici RNA'ların kararlılığını ve yarı ömrünü Aktinomisin D tedavisi, RT-qPCR ve doğrusal olmayan regresyon analiziyle nicel olarak ölçer. Konuma özgü normalleştirme stratejileri, eRNA bozunma dinamiklerini bağlama bağlı olarak doğru şekilde modellemek için dahil edilir.

Fare embriyonik kök hücrelerinde Enhancer RNA Stabilitesinin Optimize Edilebilir Nicel Değerlendirmesi

Bu makale, IMR-90 insan fibroblastlarında yaşlanma sırasında lizozomal yeniden modelleşmeyi ölçmek için canlı hücreli bir LysoTracker protokolünü sunmaktadır.

İnsan Fibroblastlarında Hücresel Yaşlanmanın Nicel Değerlendirmesi İçin LysoTracker ile Lizozomal Profilleme

Öğrenin, insan dermal fibroblastlarda transkript çürüme oranlarını izlemeyi. Proliferasyon ve durgunluk durumlarında gen ifadesi dinamiklerini anlamak için bu yöntemi kullanın.

Genom çapında transkript çürüme oranları Proliferasyona ve durgun insan fibroblast belirleme

Daha fazla video keşfet