Yapısal Mannan hücre duvarı polisakkaritler hızı kullanarak tesislerinde karakterizasyonu

Bu deneyin genel amacı, bitki hücre duvarı polisakkaritlerini karakterize etmektir. Bu yöntem, glukomannan yapısı ve miktarı dahil olmak üzere bitki hücre duvarı biyolojisi alanındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, özel eğitim veya pahalı ekipman gerektirmemesidir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler jellerin yorumlanması ile mücadele edeceklerdir, bu nedenle açıklanan tüm kontrollerin dahil edilmesi ve anlaşılması kritik öneme sahiptir. Alkol ve çözünür kalıntı veya AIR, metin protokolünde açıklandığı gibi daha önce hasat edilmiş bitki materyalinden hazırlanır. Altı miligram AIR'i 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne tartın ve mililitre başına iki miligramlık bir nihai konsantrasyona kadar su ekleyin.

Eşit bir süspansiyon elde etmek için girdap. 500 mikrogramı mikrofüj tüplerine ekleyin. Alikotları gece boyunca 30 santigrat derecede bir vakum santrifüjü kullanarak kurutun.

Enzim içermeyen bir AIR kontrolü için bir alikot içeren AIR'yi oda sıcaklığında bir saat boyunca bir molar sodyum hidroksit ile ön işlemden geçirin. Bir saat sonra, sodyum hidroksiti nötralize etmek için her tüpe 200 mikrolitre su ve 20 mikrolitre bir molar hidroklorik asit ekleyin. Bir mikrolitreyi çıkararak ve kağıt pH indikatör şeritlerine lekeleyerek pH'ın yaklaşık altı ila yedi olduğunu test edin.

50 mikrolitre bir molar amonyum asetat tamponu pH 6.0 ekleyin ve her tüpe toplam 500 mikrolitre hacme kadar su ekleyin. Bu prosedüre başlamak için, AIR alikotlarına ve tamponuna önceden belirlenmiş miktarda mannana ekleyin. Pozitif kontrolün yanı sıra uygun negatif kontrolleri de dahil edin.

Girdap yapın ve ardından tüpün dibindeki reaksiyon karışımını toplamak için kısa bir süre döndürün. Gece boyunca hafif çalkalama ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, 95 santigrat derecede 20 dakika inkübe ederek reaksiyonu durdurun.

10 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin. Süpernatanı koruyun ve her peleti 250 mikrolitre suda tekrar süspanse edin. Tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı koruyun.

Her iki süpernatanı birleştirin ve yaklaşık üç saat boyunca 30 santigrat derecede bir vakum santrifüjünde kurutun. Türevlendirme prosedüründen önce, metin protokolünde açıklandığı gibi gerekli reaktifleri hazırlayın. Katıyı tamamen çözmek için 0.2 molar ANTS stok çözeltisini 60 santigrat dereceye ısıtın.

Her numuneye beş mikrolitre ANTS, beş mikrolitre iki pikolin-boran ve 10 mikrolitre türevlendirme tamponu ekleyin. Tüpün dibinde toplamak için kısa bir süre döndürün, iyice girdap yapın ve ardından tekrar kısa bir süre döndürün. Numuneleri gece boyunca 37 santigrat derecede ışıktan koruyarak inkübe edin.

Ertesi gün, numuneleri yaklaşık iki saat boyunca 30 santigrat derecede bir vakum santrifüjünde kurutun. Her numuneyi oligosakkarit standardında ve 100 mikrolitre üç molar üre içinde yeniden süspanse edin. Eksi 20 santigrat derecede, gerektiği kadar ışıktan koruyarak saklayın.

Jel döküm ekipmanının montajı markaya bağlı olacaktır. Bu gösteride kullanılan ekipman için, bir jel 50 mililitreye eşittir. 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde 20.2 mililitre su, beş mililitre 10x PACE tamponu, 24.6 mililitre %40 akrilamid/Bis-akrilamid, 200 mikrolitre APS ve 20 mikrolitre TEMED'i karıştırın.

Karıştırmak için hafifçe ters çevirin, hava kabarcıkları sokmamaya dikkat edin. Çözünen jeli cam plakaların üst kısmının yaklaşık dört santimetre altına dökmek için serolojik veya başka bir büyük hacimli pipet kullanın. Jeli dikkatlice izopropil alkol ile kaplayın.

Jelin 20 ila 30 dakika polimerize olmasına izin verin. Üst tabakayı dökün. Kurutma kağıdı kullanarak fazla sıvıyı kurutun.

Sonra, istifleme jeli yapın. 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde 6,8 mililitre su, bir mililitre 10x PACE tamponu, 2,8 mililitre akrilamid / Bis-akrilamid, 80 mikrolitre APS ve sekiz mikrolitre TEMED'i karıştırın. Karıştırmak için ters çevirin ve polimerize çözme jelinin üzerine yerleştirin.

Tarak dişlerinin altına hava kabarcıkları sıkıştırmamak için tarağı nazikçe yerleştirin. Jel polimerize olduktan sonra nemli dokuya ve ardından plastik sargıya sarın ve gerekene kadar dört santigrat derecede saklayın. Yükleme sırasını takip etmeye ve tarak çıkarıldıktan sonra kuyuların nerede olduğunu belirlemeye yardımcı olmak için, cam üzerindeki kuyu konumlarını etiketlemek için kalıcı bir işaretleyici kullanın.

Tarağı çıkarın. Kuyuları one-X PACE tamponu ile doldurun. Kuyucuklara iki mikrolitre standart ve numune yüklemek için 10 mikrolitrelik bir mikroşırınga kullanın.

Numuneleri kötü çalıştırma eğiliminde olan en dıştaki şeritleri kullanmaktan kaçının ve numuneler arasında boş bir şerit bırakın. Jel çalıştırma aparatının üst haznesini monte edin ve jeli bir X PACE tamponu içeren soğutulmuş bir çalışma tankına yerleştirin. Üst hazneyi one-X PACE tamponu ile doldurun.

Gücü açın ve jeli 30 dakika boyunca 200 voltta çalıştırın. 30 dakika sonra, voltajı bir saat 40 dakika boyunca 1.000 volta yükseltin. Jeli ışıktan koruyun.

Tozsuz olduğundan emin olmak için jel görüntüleme sistemini nemli, tüy bırakmayan mendille silerek başlayın. Jeli PACE tankından çıkarın ve boya ön kısmının hala jel üzerinde olup olmadığını belirlemek için jel hala cam plakalarındayken kısaca görüntüleyin. Jeli açmak için bir kama aleti kullanın ve jel hala bir cam plaka üzerindeyken, boya önü hala jelin üzerindeyse, hem istifleme jelini hem de jelin altını çıkarmak için bir pizza kesici kullanın.

Transilluminatörün yüzeyine yaklaşık beş mililitre su dağıtın ve ardından jeli doğrudan transilluminatörün üzerine aktarın. Yazılımı kullanarak filtreyi UV 605'e ayarlayın ve uzun dalga UV transillüsyoncusunu açın. Floresanın bozulmasını önlemek için görüntüler arasında UV ışığını kapattığınızdan emin olarak çeşitli pozlama sürelerinde birkaç görüntü çekin.

Görüntülerden en az ikisinde doygun bant olmadığından emin olun. Dosyaları yüksek çözünürlüklü TIFF görüntüleri olarak kaydedin. Hücre duvarı mannan içeriğinin standart bir PACE testinin temsili bir jeli gösterilmiştir.

Bir, iki ve üç şeritleri, sırasıyla beş, 10 ve 50 pikomol konsantrasyonunda ticari olarak satın alınan oligosakkaritlerin bir merdivenini gösterir. Dördüncü şerit, enzim ve tampon tuzlarının varlığında hem enzimatik sindirim hem de türevlendirme reaksiyonu için pozitif bir kontrol görevi gören konjac glukomannanın bir mannanaz sindirimini gösterir. Beşinci şerit, vahşi tip bir Arabidopsis gövdesinin PACE parmak izini göstermektedir.

Altıncı şerit, ana kök mannan sentazdan yoksun bir Arabidopsis bitkisinden elde edilen gövdenin PACE parmak izini göstermektedir. Yabani tip ile karşılaştırıldığında, tüm mannanaz türevi oligosakkaritler için azaltılmış bant yoğunlukları ile kanıtlandığı gibi, sadece küçük bir miktar mannan mevcuttur. Şerit 10, galaktoglukomannan içeren ve Arabidopsis'inkinden açıkça farklı bir salınan oligosakkarit modeline sahip olan çam ağacının PACE parmak izini göstermektedir.

Şerit yedi, sekiz, dokuz ve 11, analizden çıkarılması gereken yıldızlarla işaretlenmiş spesifik olmayan bantları ortaya çıkaran çeşitli negatif kontrollerdir. Bu videoyu izledikten sonra, PACE kullanarak mannan yapısını nasıl analiz edeceğinizi gerçekten iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, farklı glikosil hidrolazlar kullanılarak ilgilenilen diğer polisakkaritlere uygulanabilir.

Bu tekniği Arabidopsis'e ek olarak diğer birçok bitki türüne ve maya mannan gibi diğer bitki olmayan türlere uygulayarak başarılı olduk.