Name: Tam yerelleştirilmiş ve tekrarlayan aralıklı görüntüleme sırasında beyin dilimler halinde kapalı bir sistemi uzun vadeli kültürü için değiştirilmiş Roller tüp yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Öğrenin, modifiye Roller tüp yöntemiyle kemirgen beyin dilimlerini uzun vadeli kültürlemeyi ve tekrarlayan yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi. Bu kapalı sistem, sinir hücresi gelişimi ve nörodejeneratif bozuklukları incelemek için güvenli viral kullanım sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal%2C+a+new+serum-free+medium+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: a review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li>
<li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+imaging+of+neuronal+circuits+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).</li>
<li>Roo, M. D., Ribic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+structural+plasticity+of+dendritic+spines+in+organotypic+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture.</a> Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).</li>
<li>Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -P., Béīque, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+synaptic+inputs+drive+dendritic+calcium+amplification+and+cooperative+plasticity+during+clustered+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development.</a> Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).</li>
<li>Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+cofilin-actin+rods+in+stressed+hippocampal+slices+and+the+role+of+cdc42+in+amyloid-beta-induced+rods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods.</a> J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).</li>
<li>Clark, R. E., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarity+in+form+and+function+of+the+hippocampus+in+rodents%2C+monkeys%2C+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, Suppl 2 10365-10370 (2013).</li>
<li>Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+stimuli+induce+persistent+ADF%2Fcofilin-actin+rods+that+disrupt+distal+neurite+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function.</a> Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).</li>
<li>Rahman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+rods+and+aggregates+concur+with+tau+pathology+and+the+development+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer's disease.</a> J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).</li>
<li>Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+and+cofilin-actin+rods+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease.</a> Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).</li>
<li>He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).</li>
<li>Minamide, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+use+of+replication-deficient+adenovirus+for+transgene+expression+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons.</a> Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).</li>
<li>Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+synapsin+1+gene+promoter+confers+highly+neuron-specific+long-term+transgene+expression+from+an+adenoviral+vector+in+the+adult+rat+brain+depending+on+the+transduced+area%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area.</a> Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).</li>
<li>Mi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+reporter+for+real-time+imaging+of+cofilin-actin+rods+in+living+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons.</a> PLOS ONE. 8 (12), 83609(2013).</li>
<li>Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+recombinant+adeno-associated+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Production and purification of recombinant adeno-associated vectors.</a> Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).</li>
<li>Matsushita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vectors+can+be+efficiently+produced+without+helper+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus.</a> Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).</li>
<li>Ward, P., Walsh, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+integration+of+rAAV+vector+into+the+AAVS1+region%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region.</a> Virology. 433 (2), 356-366 (2012).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PLOS ONE. 6 (4), 18556(2011).</li>
<li>Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26611582">Lentivirus production and purification.</a> Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).</li>
<li>Huang, L., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoprocessing+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+protease+miniprecursor+fusions+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells.</a> AIDS Res Ther. 7, 27(2010).</li>
<li>Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gibson+assembly%3A+an+easy+way+to+clone+polyviral+full-length+infectious+cDNA+clones+expressing+an+ectopic+VPg%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg.</a> Virol J. 12, 89(2015).</li>
<li>Er, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuO%3A+a+fluorescent+chemical+probe+for+live+neuron+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).</li>
<li>Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+actin-ADF%2Fcofilin+rods+transiently+retards+decline+of+mitochondrial+potential+and+ATP+in+stressed+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).</li>
<li>Cichon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+aggregation+blocks+intracellular+trafficking+and+induces+synaptic+loss+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons.</a> J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).</li>
<li>Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+conditions+for+amyloid-beta+peptide+oligomerization+and+fibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis.</a> J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).</li>
<li>Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-secretase-cleaved+amyloid+precursor+protein+accumulates+at+actin+inclusions+induced+in+neurons+by+stress+or+amyloid+beta%3A+a+feedforward+mechanisms+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).</li>
<li>Davis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+dimers%2Ftrimers+potently+induce+cofilin-actin+rods+that+are+inhibited+by+maintaining+cofilin+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation.</a> Mol Neurodegener. 6, 10(2011).</li>
<li>Walsh, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-%CE%B2+and+proinflammatory+cytokines+utilize+a+prion+protein-dependent+pathway+to+activate+NADPH+oxidase+and+induce+cofilin-actin+rods+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons.</a> PLOS ONE. 9 (4), 95995(2014).</li>
<li>Woo, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RanBP9+at+the+intersection+between+cofilin+and+A%CE%B2+pathologies%3A+rescue+of+neurodegenerative+changes+by+RanBP9+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Disease%22%5BJournal%5D)">RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction.</a> Cell Death Disease. , 6(2015).</li>
<li>Shaw, A. E., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+regulation+of+cofilin+activity+in+the+CNS%3A+a+novel+therapeutic+approach+for+treatment+of+multiple+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders.</a> Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).</li>
</ol>

Burada açıklanan roller tüp yöntemi uzun vadeli kültür ve dilimlenmiş beyin dokusunun yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme olanağı sağlar. Bir dilim tekniği gibi burada montaj ve bakım dilim olduğunu. Dilim yapışma, destek Coverslip kaplama teşvik neurites akıbet ve hücre dilim dışarı geçiş güçlendirerek dilim inceltme; Böylece, bu yüzeylerde kullanımı kaçınılmalıdır. 3-aminopropyltriethoxysilane ile tedavi kadehte üzerine amino grupları ekleme dilimleri bağlılık gelişmiş, ama çok az ya da çok fazla tavuk plazma coversl...

Birincil kemirgen beyin bölgelerinden Disosiye nöronların uyaranlara yanıt-e doğru hastalık derecesinde gözlemlemek için araştırmacılar tarafından kullanılan önemli bir araç karıştığı kültürdür. Ancak, bu tür çalışmalar nöronlar sadece 2D ve onların gliyal destek sistemi olmadan görüntülemenin dezavantajı var. Ayrıca, içinde hangi o çok yüksek yoğunluklu (640 nöronlar/mm2 veya yüzey alanı yaklaşık % 16) şartları altında yetiştirilen sürece bir dendrite veya axon rasgele akıbet için daha kısa bir mesafe--dan onun hücre gövdesinden Hipokampal takip etmek imkansız hale nöronal canlılık 4 haftadan1yaşa bağlı patolojiler genişletilmiş çalışmaları için Disosiye kültürler kullanımını sınırlama, önemli ölçüde azalır. Kemirgen beyin hazırlanan dilimleri kültür hafta veya ay için bir organize hücre mimarisi ve canlılığı tutarak bu sınırlamalar üstesinden cazip bir seçenektir. Dilim kültür kemirgen beynin birçok farklı bölgeleri korumak için koşullar açıklanan2olmuştur.
İki ana yöntem yaygın beyin dilimleri uzun vadeli kültürü için kullanılan: Hava-sıvı arayüzey3 membranlar üzerinde kültür veya coverslips kapalı tüpler üzerinde kültür izin havalandırma4sağlamak için silindir kuluçka makinesine döndürmek için. Membranlar kültürlü dilimleri bir dik mikroskop ve su daldırma hedefleri5kullanarak yüksek çözünürlüklü Floresans mikroskobu ile doğrudan yansıması. Alternatif olarak, membranlar kültürlü dilimleri dendritik dikenleri bir ters mikroskop6kullanarak iyi çözünürlük elde etmek için cam alt yemekleri transfer edildi. Ancak, her iki yöntem membranlar üzerinde yetiştirilen dilimleri görüntüleme orta herhangi bir değişiklik yapılması ve antifungal ve/veya antibiyotik kirlenme5,6azaltmak veya önlemek için kullandığınız açık sistemlerdir. Mükemmel morfoloji ve hayatta kalma bir membran hava-orta arayüzüne dilimleri korumak, ama deneme sadece küçük hücre grupları takip ediyor sürece yüksek büyütmede tekrarlayan görüntüleme sırasında kesin konumlara dönen son derece zordur Floresan bir işaretleyici ifade ediyorum. Membranlar üzerinde yetiştirilen dilimleri viral aracılı ile ifade transgenes5,6kullanılmıştır, ancak, Biyogüvenlik protokolleri bir kapalı kültür sistemi için kullanılan bazı viral vektörler için istihdam gerekebilir Fluorescently ifade proteinler ve hücre fizyolojisi gazetecilere etiketledi. Ayrıca, daldırma hedefleri dekontaminasyon kültür5' te takip edilecektir örnek arasında gerektirir. Bir büyük uygulama membran arabirimi kültürlerin Elektrofizyoloji seferinde Puan7ile yüksek çözünürlüklü görüntülemede birleştiriyor.
Silindir tüp yöntemi ile coverslips plastik tüp içinde herhangi bir Elektrofizyoloji veya yüksek çözünürlüklü görüntü coverslip kaldırmadan izin vermez. Böylece, bu yöntem en sık hangi8sonrası fiksasyon gözlemler yapılmış olan uzun vadeli çalışmalar için uygulanmıştır. Burada açıklanan roller tüp kültür tekniği kullanır ama hkr kültürleri kadar uzun süre yansıması coverslips dilimleri ile delinmiş-out tüplerin üzerinde tutulan bir yöntemdir. Kapalı sistem görüntüleme için orta hiçbir değişiklik gerektirir ve photoetched coverslips günler ya da haftalar, sonra yüksek büyütmede daha önce görüntüsü hassas alanları görüntüleme izin indirgeme işaretleri sağlamak için kullanır.
Kemirgen hipokampüs, hafıza ve öğrenme dahil bir büyük beyin bölgesi değişiklikleri incelemek için bu yöntemi uygulamak. Kemirgen Hipokampus kez kognitif bozukluk9, reklam ortaya gibi gelişimi sırasında gözlenen patolojik veya yaşa bağlı değişiklikler için bir model olarak incelenmiştir. Bizim yöntemi AD8karakteristik olan tek bir dilim içinde Aβ peptidler, artışlar gibi çevresel değişiklikler zamanla geliştirmek patolojik değişiklikleri incelemek için özellikle uygundur. İnsan ve kemirgen reklam beyin ile ilişkili bir patoloji cofilin-aktin toplamları varlığı ve çubuklar, içinde cofilin ve aktin filamentleri ikinci içeren demetleri bir 1:1 molar oranı10,11', 12. çubuklar gözlemlenmiştir sabit dilimleri Aβ tedavi aşağıdaki farenin Hipokampus yanı sıra cofilin-GFP hipoksi8' e tabi ifade bir canlı kemirgen beyin dilim içinde ve onlar için bir reklam gördüm sinaptik disfonksiyon katkıda bulunabilir ve inme. Burada zaman ders ve dağıtım içinde ifade edilen eksojen chimeric floresan proteinler farklı virüsler tarafından tanıtılan dilim gözlemlemek için bu yeni kodlamayla yöntemi kullanın. Biz o zaman cofilin çubuk ve çözünür Aβ reaksiyonlar (Aβo) ile tedaviye yanıt Hipokampal dilimleri toplama patolojisi gelişimini takip etmek bir cofilin muhabir yapı nöronal belirli ifade kullanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>15 cm kültür kaplarından alt kısımlar</td><td>VWR Scientific</td><td>25384-326</td><td></td></tr><tr><td>Yıldız Başlı Makine Vidaları (# 10-32)</td> <td>Ace Donanım</td><td></td><td>2.5 "uzunluğunda ve 3/16" çapında</td></tr><tr><td>Düz Pullar # 10</td><td>ACE Donanım</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Makinesi Vida Somunları (# 10-32)</td> <td>ACE Donanım</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kauçuk Rondelalar&nbsp;</td><td>ACE Donanım</td><td></td><td>5/16", kalın; 5/8", delik çapı; 1.125", OD</td></tr><tr><td>Polietilen boru (5/16"; OD, 3/16"; ID)</td> <td>ACE Donanımı</td><td></td><td>1.8 "uzunluğa kadar</td></tr><tr><td>kesilmiş Kilit Yıkayıcı # 10</td><td>ACE Donanım</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matkap Presi, 5 hız&nbsp;</td><td>Ace Hardware ProTech</td><td>Model 1201</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Düz Kenarlı Borular</td><td>VWR</td><td>62407-076</td><td></td></tr><tr><td>Matkap uçları, 3 mm, 6 mm ve 15 mm&nbsp;</td><td>Ace Donanım</td><td>Diablo freud marka</td><td>Plastik kesmek için matkap uçları.</td></tr><tr><td>Ahşap için matkap uçları, 1,5 cm ve 1 mm</td><td>Ace Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ahşap eğe, 1/4" yuvarlak</td><td>Ace Harware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yaylı klipsler, 16 mm çıtçıt tutucu</td><td>Ace Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Döner Kafa Çapak Alma Aleti, 5"</td> <td>Ace Hardware</td><td>26307</td><td></td></tr><tr><td>Yapışkanlı Silikon Levha (Güvenli Conta)</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>666581</td><td>0,5 mm Kalınlık</td></tr><tr><td>6 mm delgeç</td><td>Ofis Maksimum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 mm delgeç</td><td>thepunchbunch.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>%70 Etanol Fototeknik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamel, 12 mm çap</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>1916-91012</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen Brülör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mutlak Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanosaf Su</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropiltrietoksilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr> <tr><td># 5 Dumont Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Doku Doğrayıcı</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>Çift Kenarlı Tıraş Bıçağı</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Filtre Kağıdı</td><td>VWR</td><td>28450-182</td><td>5,8 cm çapında daireler halinde kesin</td></tr><tr><td>Poli-kloro-trifloro-etilen (Aclar)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>10501-10</td><td>5,8 cm çapında daireler halinde kesin</td></tr> <tr><td># 21 Cerrahi Bıçak</td><td>VWR Scientific</td><td>25860-144</td><td></td></tr> <tr><td># 5 Dumont Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Spatula, konik uçlu paslanmaz</td><td>VWR</td><td>82027-518</td><td></td></tr><tr><td>Gey'in Dengeli Tuz Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9779&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Glikoz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15023-021</td><td>%25 (a/h) Çözelti, 0,2 mm filtre sterilize</td></tr><tr><td>edilmiş Tavuk Plazma</td><td>Cocalico Biologicals</td><td>30-0300-5L</td><td>Steril suda rehidrat, 2500 x g'de santrifüjleyin 30 dakika 4 &° C'de; C, alikotları sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve şurada saklayın: -80 derece >C.</td></tr><tr><td>Trombin, Topikal (Sığır)</td> <td>Pfizer</td><td>Trombin-JMI</td><td>Sağlanan seyrelticide 1.000 uluslararası birim / mL'de sıvı nitrojen içinde hızlı dondurma alikotları ve -80 ° C'de saklayın. 250 birim / mL'de kullanın.</td></tr><tr><td>Hücre Silindir Sistemi</td><td>Bellco Biotech</td><td>SciERA</td><td></td></tr><tr><td>Silindirli İnkübatör</td><td>Forma</td><td>Model 3956</td><td></td></tr><tr><td>N21-MAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AR008</td><td></td></tr><tr><td>Kalem/Strep (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>200 mM Glutamin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Glukoz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15023-021</td><td>%25 (a/h) Çözelti, 0,2 mm filtre sterilize edilmiş</td></tr><tr><td>Neurobazal A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10888-022&nbsp;</td><td>Tam Ortam: 48 mL Nörobazal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamin, 0.180 mL %25 Glikoz, 0.250 mL 100x kalem/strep.</td></tr><tr><td>Üçüncü nesil lentivirüs ambalajı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>K4975-00</td><td></td></tr><tr><td>159 K kesme santrifüj filtreler (Centricon)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lentiviral klonlama sistemi (InFusion)</td><td>Clonetech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmids 30323, 50856, 51279</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nöronal hücre canlılık boyası (NeuO)</td><td>Kök hücre teknolojileri</td><td>1801</td><td>Bir kez çözün ve 4 & mikro'da hızlı dondurun; L alikotlar. -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop objektifleri</td><td>Olympus</td><td>air: 4X, 20; yağ: 40X, 60X,</td><td></td></tr> <tr><td>Eğirme diski konfokal sistem</td><td>Yokagawa</td><td>CSU22</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop EMCCD kamera</td><td>Fotometri</td><td>Cascade II</td><td></td></tr><tr><td>Doğrusal kodlu (x,y), piezo z düz üst kademe</td><td>ASI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop lazerleri ve entegrasyonu</td><td>Akıllı Görüntüleme Yenilikleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T hücreleri</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Plazmini</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1867</td><td>0.1 sığır serum albümininde 0.002 U/mL (0.2 mm filtre sterilize), sıvı nitrojende hızlı dondurma ve -80 ° C'de saklayın.</td></tr></tbody></table>

tam yerelleştirilmiş ve tekrarlayan aralıklı görüntüleme sırasında beyin dilimler halinde kapalı bir sistemi uzun vadeli kültürü için değiştirilmiş roller tüp yöntemi

Modified Roller Tube Method for Precisely Localized and Repetitive Intermittent Imaging During Long-term Culture of Brain Slices in an Enclosed System

Kültürlü kemirgen beyin dilimler neurons ve glia birçok normal vivo içinde etkileşimlerinin tutar bir ortamda hücresel ve moleküler davranışını eğitim için yararlı olur. Transgenik fare hatları çeşitli veya viral vektörler kullanımı fluorescently tagged proteinler veya vahşi türü beyin dilimleri gazetecilere ifade için elde edilen dilimleri Floresans mikroskobu ile yüksek çözünürlükte görüntüleme için izin verir. Beyin dilim dilim kültür gerçekleştirme olanağı ile birleştirerek, görüntüleme için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir, ancak uzun süreler boyunca canlı dilimleri belirli hücreleri tekrarlayan yüksek çözünürlüklü görüntüleme sorunlarını yarattığı. Bu en iyi kapalı bir sistem kullanıcıları korumak ve çapraz kontaminasyonu önlemek için yapılır beri viral vektörler için eksojen proteinlerin ifadesi kullanıldığında bu özellikle doğrudur. Kapalı bir sistemde birçok hafta boyunca dilimleri tekrarlayan yüksek çözünürlükte görüntüleme için izin basit silindir tüp beyin dilim kültür yöntemine yapılan değişiklikleri rapor edilir. Photoetched coverslips dilimleri kültürü çalışmalarının hızla ve kesin zaman önce ve sonra farklı tedaviler içinde aynı alan görüntü için sahne yeniden konumlandırmak için indirgeme işaretleri kullanımına izin verir. Örnekler, belirli nöronal boyama ve değişiklikleri Hipokampal dilim mimarisinde gözlemlemek için ifade, viral aracılı nöronal deyim floresan proteinlerin ve cofilin patoloji gelişimi ile birlikte bu yöntemin kullanılması için gösterilir, hangi daha önce yanıt olarak amiloid-β (Aβ) peptid reaksiyonlar ile dilim tedavisi Alzheimer hastalığı (Ah) oluşur içinde gözlendi.

İndirgeme işaretleri nasıl doğru belirlemek için kullanılması gereken zaman içinde aynı alanları aynı hücrelerde reimage için biz photoetched coverslips (şekil 6A) yetiştirilen dilimleri incelenir. Nöronlar görselleştirildiği hayati bir boya ile boyama (100 nM için 2 h; sigara nöronal hücre leke değil), hangi kaybolur neurons zamanla hücreler25zarar vermeden. Biz bir indirgeme tespit etiketleme sonra bir bölge hayati b...

Sunulan işte kültür için değiştirilmiş silindir tüp yöntemi ve hassas photoetched coverslips üzerinde yeniden konumlandırma ile birçok hafta boyunca zaman zaman yüksek çözünürlüklü görüntüleme kemirgen beynin dilimler. Nöronal canlılığı ve dilim Morfoloji korunur. Sağlanan virüsler hücre tipi için belirli ifade kullanarak bu tamamen kapalı sistem uygulamaları.

Tam yerelleştirilmiş ve tekrarlayan aralıklı görüntüleme sırasında beyin dilimler halinde kapalı bir sistemi uzun vadeli kültürü için değiştirilmiş Roller tüp yöntemi

Cultured rodent brain slices are useful for studying the cellular and molecular behavior of neurons and glia in an environment that maintains many of ...

Beyin dilimi kültürü için bu modifiye edilmiş silindir tüp yönteminin genel amacı, uzun süreli dilim sağkalımı için kapalı bir kültür sistemi sağlamaktır. tekrarlayan yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme yeteneği ile. Bu yöntem, sinaps oluşumu veya kaybında rol oynayan anahtar proteinlerin lokalizasyonu gibi, zaman içinde aynı nöronların gözlemlenmesini gerektiren nöronal gelişim ve nörodejeneratif bozukluklardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin ana avantajları, protein ekspresyonu için virüslerin güvenli kullanımına izin veren tamamen kapalı kültür sistemi ve görüntüleme için aynı hücreleri lokalize etmek için fotoğrafla oyulmuş lamellerin kullanılmasıdır. Bu yöntem için ilk olarak, silindir tüplerin içindeki lameller üzerindeki dilimleri kültürlediğimizde aklımıza geldi, ancak zaman içinde canlı dilimlerde meydana gelen değişiklikleri görselleştirmek için daha iyi bir yola ihtiyacımız vardı. Mikroskop görüntüleme için transgenleri ve spesifik hücre popülasyonlarını ifade etmek için viral vektörlerin yaygın kullanımı, kullanıcıları korumak ve mikroskop objektiflerinin kontaminasyonunu ortadan kaldırmak için kapalı bir sistem geliştirmemize neden oldu.Zaman içinde beyin dilimleri içindeki aynı hücre popülasyonunu takip etme yeteneği, insan nörolojik bozukluklarının kemirgen modellerinde patolojik değişikliklerin ve sinaps değişikliğinin gelişimi üzerine çalışmalara izin verir. Başlamak için, makaralı boru rafını hazırlayın ve ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi makaralı borulara bir delik açmaya yardımcı olacak bir aparat yapın. Jig'i kullanarak, düz kenarlı, bir santimetrelik plastik kültür tüpünü, düz tarafı yukarı bakacak şekilde yerinde tutun.Ardından, merkezi alttan bir santimetre uzakta ve tüpün kenarları arasında ortalanmış olarak altı milimetre çapında bir delik açın. Döner çapak alma aleti ile deliğin kenarlarını düzleştirin ve dönüş sırasında deliğin boşaltılmasını kolaylaştırmak için deliğin iç kenarında dört oluk açın. Ardından, tüpleri %70 etanol ile durulayın ve ardından biyolojik bir güvenlik kabininde havayla kurutun.Tüpleri UV lambası altında 40 dakika boyunca 12 milimetre delikli yapışkan silikon kauçuk disklerde sterilize edin. 20 dakika sonra, tüpleri ve diskleri, açıkta kalan tüm yüzeyler sterilize edilecek şekilde yeniden konumlandırın. Daha sonra yapışkan diskten beyaz desteği soyun, delikleri hizalayın ve silikon kauçuğu tüpün dışına yapıştırın.Dilimler elde edildikten sonra, hazırlanmış bir lamel ile fotoğrafla kazınmış tarafın ortasına iki mikrolitre tavuk plazması yerleştirin. Üç ila dört mililitre çapında bir nokta elde etmek için plazmayı hafifçe yayın. Daha sonra hazırlanmış bir beyin dilimini kaldırmak için steril, dar uçlu bir spatula kullanın.Dilimi kaldırırken dilimi spatula ucunda tutmak için kapalı forseps kullanın. Spatulayı lamel üzerindeki plazma noktasına dokundurun ve kapalı forseps ile dilimi lamel üzerine itin. Dilimi yerleştirmeden önce lamel üzerine ince bir civciv plazma tabakası ve dilimi kaplamak için minimum miktarda trombin ile muamele edilmiş plazma ekleyin.Dilim yüzerse, bulut kaldırıldığında yapışmamış halde kalmayacaktır. Daha sonra 2.5 mikrolitre plazma ve 2.5 mikrolitre trombini ayrı bir tüpte karıştırın. Bu karışımdan 2,5 mikrolitreyi dilimin üzerine ve çevresine hızlıca yerleştirin ve karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.Daha önce silindir borusuna yapıştırılmış olan silikon kauçuk yapıştırıcının açıkta kalan tarafındaki şeffaf, plastik kaplamayı çıkarın. Ardından, lameli beyin dilimi ile birlikte yapıştırıcının üzerine yerleştirin ve dilimi deliğin içinde hizalayın. Yapışmayı sağlamak için, lameli eşit şekilde aşağı bastırarak ve biyolojik güvenlik kabinine aktarırken yaklaşık bir dakika tutarak lamel üzerine başparmağınızla yumuşak ve eşit bir basınç uygulayın.Lamelin sızıntı yapmadan boruya yapışması için üzerindeki basınç, çıkıntıdaki hava kanallarını ortadan kaldıracak kadar doğru olmalı ve yeterince uzun süre muhafaza edilmelidir. Çok fazla basınç lameli çatlatacaktır. Biyolojik bir güvenlik kabininde, her tüpe 0.8 mililitre tam nörobazal bir kültür ortamı ekleyin.Ardından, bir kelepçe ile güvenli bir şekilde tutulan steril bir pamuk tıkalı Pasteur pipetinden %5 karbondioksit %95 hava karışımını akıtan. Silindir tüpünü gaz karışımıyla yıkamak ve pipetin etrafından çekilirken tüpü hızlı bir şekilde kapatmak için bunu kullanın. Ardından, tüpleri dilim numarası ve raf numarası ile etiketleyin.Tüpleri bir makaralı rafa yerleştirin; geometrik olarak dengeli olduklarından emin olmak. Tek sayıda tüp varsa, dengelemek için boş tüpler ekleyin. Rafları 35 santigrat derecelik bir silindir inkübatöre yerleştirin ve silindirler makaralı rafı saatte 10 ila 13 devirde döndürün.Önünü bir tahtaya kaldırarak inkübatörü yaklaşık 5 derece geriye doğru eğin. Dilim kültürüne sahip bir tüpü burada gösterildiği gibi özel yapım bir tüp tutucuya aktarın. Ardından, görüntüleme sırasında lamel hedefe dik tutmak için tüp tutucuyu sahne adaptörüne yerleştirin.Ardından, tüpü yerinde tutmak için sahne adaptöründeki kaydırıcıyı tüpe sıkıca itin. Parlak alan trans-aydınlatması altında dört kez objektif kullanarak, dilimin altındaki fotoğrafla oyulmuş ızgara dönemine odaklanın. İlk görüntüleme oturumu için, daha yüksek büyütmeli görüntülemenin istendiği çeşitli bölgelerin numarasını bulmak ve kaydetmek için dilimin etrafını hızlı bir şekilde tarayın.İlgi alanları belirlendikten sonra, sahneyi ilgi alanını içeren ilk ızgara karesine taşıyın. Ardından 20 güç hatası hedefine geçin ve bir referans işareti bulun. Ardından, daha yüksek bir güç hedefine geçin, aynı referans işaretini yerelleştirin ve sahnenin x ve y konumunu kaydedin.Yakındaki diğer ilgi alanlarını bulmak için sahneyi hareket ettirin ve referans işaretinden x ve y uzaklıklarını kaydedin. Ofset konumları, tüp veya kademe adaptörü çıkarılıp değiştirildiğinde referans işaretinin orijinal x, y ayarı değişse bile, dilim görüntülendiğinde aynı lamel konumunun tutarlı bir şekilde belirlenmesine izin verir. Mikroskop objektif kontrolünü veya varsa bir Piezo sahne kontrolünü kullanarak seçilen her alanda bir görüntü Z-stick yakalayın.Burada gösterilen konfokal görüntü yığını, nöronal hayati bir boya kullanarak, hem nöritlerin hem de hücre gövdesinin 3D mimarisini vurgular, ancak leke çekirdekten çıkarılır. Uzun süreli kültür sırasında büyüme dilimi morfolojisindeki zamana bağlı değişiklikleri ve dilimler içindeki canlılığı incelemek için, aynı dilim, görüntülemeden 24 saat önce haftada bir kez floresan nöronal hayati boya ile etiketlendi. Aynı hücrelerin zaman içinde görüntülenmesinin tekrarlanabilirliğini göstermek için, 13. günde nöronal hayati boya ile etiketlenmiş bir dilimin aynı alanı 14, 15, 16 ve 17. günlerde görüntülendi.Her gün üç hücrenin konumu, çekirdeğin üzerindeki bir sembolle gösterilir. Nöronal hayati boyaya ek olarak, hücreleri etiketlemek için bu sistemle viral aracılı floresan proteinler kullanılabilir. Burada hem kalsiyuma duyarlı bir raportör hem de Kofilin içeren çubuklar, enfeksiyondan 10 gün sonra net bir şekilde tanımlanabilir.Bu prosedürün başarılı bir şekilde uygulanması, tüm tüplerin, lamellerin ve solüsyonların önceden hazırlanmasını gerektirir. Ölüm sonrası kısa bir aralıkta dilimler elde edebilmek de başarı için çok önemlidir ve çok fazla pratik gerektirir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, diseksiyon ve kaplama süreleri de dahil olmak üzere, bir fare yavrusundan 12-18 hipokampal dilim elde etmek için yaklaşık 90 dakika içinde yapılabilir.Bu prosedürü takiben, beyin dilimleri, floresan etiketli proteinlerin hücre tipine özgü ekspresyonunu elde etmek için çeşitli zamanlarda virüslerle enfekte edilebilir veya gen fonksiyonunu araştırmak için küçük enterferans yapan RNA veya kısa firkete RNA ile gen ekspresyonu için sessizlik sağlanabilir. Rekombinant virüslerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu reaktiflerle çalışırken her zaman göz koruması takmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

modified-roller-tube-method-for-precisely-localized-repetitive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol, postnatal beyin ve rostral göçmen akışı neuroblast göç yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme için optimize edilmiş bir Organotipik dilim tahlil açıklamaktadır.

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Burada yarı kalın beyin dilimleri görüntü floresan işaretli hücrelerin hızlı ve basit bir yöntem açıklanmaktadır. Sabitleme, dilimleme, beyin dokusu ve optik temizleme standart epifluorescent veya konfokal görüntüleme, sağlam sinir dokusu içinde bireysel hücreleri ve nöral ağların görselleştirmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Yarı Kalın Beyin Slices Yüksek Çözünürlük Floresans Görüntüleme Hızlı Bir Yaklaşım

Bu protokol, biz görüntüleme Ca son gelişmeleri...

Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Bu video, bir kemirgen modelinden beyin dilimlerinin uzun süreli kültürlenmesi için modifiye edilmiş bir silindir tüp yöntemini göstermektedir. İlk olarak, beyin dilimleri lamellere tutturulur. Daha sonra, düz tarafında bir delik bulunan düz kenarlı makaralı borular alınır ve lameller yapışkan diskler kullanılarak deliğin üzerine yerleştirilir. Son olarak, tüpe bir besin ortamı ve bir karbondioksit ve hava karışımı eklenir ve tüpler bir yuvarlanma hareketi ile inkübe edilir.

Kemirgen beyin dilimlerinin uzun süreli kültürü için modifiye edilmiş bir silindir tüp yöntemi

Kaynak: Wiegreffe, C., et. al.,  {{}}In Utero Elektroporasyon. J. Vis. Uzm. {{TAG_ 44}} (2017) Bu video, transdüksiyonlu fare embriyonik beyin dilimlerinde radyal glial iskeleler yoluyla subventriküler bölgeden kortikal plakaya kortikal nöron radyal göçünü gözlemlemek için hızlandırılmış konfokal mikroskopiyi göstermektedir.

Transdüksiyonlu Fare Embriyonik Beyin Dilimlerinde Kortikal Nöron Radyal Migrasyonunun Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Ön beyin ve beyincik dilim kültür sistemini kullanarak NG2 hücrelerini ve oligodendrositleri incelemek için bir teknik açıklanmıştır.  Bu yöntem, doku sitomimarisini korurken hücre dışı ortamın kolayca manipüle edilebildiği oligodendrosit soyu içindeki hücrelerin çoğalma ve farklılaşma dinamiklerinin incelenmesine izin verir.

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

Farklı açılardan kullanarak fare yavru beyin kesmek için, biz büyük işitme orta beyin ve ön beyin yapılarının çoğu arasındaki bağlantıları yakalar önceden açıklanan akut beyin dilim üzerine geliştirmek.

Bir Colliculo-talamokortikal Fare Beyin Dilim modifikasyonu, 3-D Odası Bileşenleri baskı ve Multi-ölçekli Optik Görüntüleme birleştirilerek

Bu protokol, radyal olarak göç eden kortikal nöronların doğrudan gözlenmesi için talimatlar sağlar. N utero elektroporasyonda, organotipik dilim kültürü ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme, göç eden nöronlardaki ilgi genlerinin aşırı ekspresyonunun veya downregülasyonunun etkilerini doğrudan ve dinamik olarak incelemek ve gelişme sırasındaki farklılaşmalarını analiz etmek için birleştirilir.

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

Microglia, yerleşik bağışıklık hücreleri beynin, çabuk morfolojik değişiklikler ile çevrenin değişiklikler cevap. Bu protokol iki fotonlu mikroskobu serotonin veya ATP doğru mikroglial süreçlerinde fareler dilim akut beyin cazibe çalışmak için nasıl kullanılacağını açıklar.

Mikroglial süreçleri cazibe ATP veya Serotonin akut beyin dilimleri içinde doğru iki fotonlu görüntüleme

Fare ön beyninin organotipik dilim kültürlerinde genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı sensör ATeam1.03YEMK'ın hücre tipi spesifik ekspresyonu için bir protokol tanımladık. Ayrıca, nöronlar ve astrositlerde hücresel ATP düzeylerinin dinamik görüntülemeiçin bu sensörünasıl kullanılacağını gösteriyoruz.

FRET tabanlı Sensör ATeam1.03YEMK kullanılarak Fare Beyninin Organotipik Doku Dilimlerinde Hücre İçi ATP'nin Görüntülenmesi

Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreçte birçok gen yer alır. Bu protokol, göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntüleme tekniğini tanıtır.

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Öğrenin, modifiye Roller tüp yöntemiyle kemirgen beyin dilimlerini uzun vadeli kültürlemeyi ve tekrarlayan yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi. Bu kapalı sistem, sinir hücresi gelişimi ve nörodejeneratif bozuklukları incelemek için güvenli viral kullanım sağlar.

Tam yerelleştirilmiş ve tekrarlayan aralıklı görüntüleme sırasında beyin dilimler halinde kapalı bir sistemi uzun vadeli kültürü için değiştirilmiş Roller tüp yöntemi (Video) | JoVE Journal

Tam yerelleştirilmiş ve tekrarlayan aralıklı görüntüleme sırasında beyin dilimler halinde kapalı bir sistemi uzun vadeli kültürü için değiştirilmiş Roller tüp yöntemi

Daha fazla video keşfet