Tam yerelleştirilmiş ve tekrarlayan aralıklı görüntüleme sırasında beyin dilimler halinde kapalı bir sistemi uzun vadeli kültürü için değiştirilmiş Roller tüp yöntemi

Beyin dilimi kültürü için bu modifiye edilmiş silindir tüp yönteminin genel amacı, uzun süreli dilim sağkalımı için kapalı bir kültür sistemi sağlamaktır. tekrarlayan yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme yeteneği ile. Bu yöntem, sinaps oluşumu veya kaybında rol oynayan anahtar proteinlerin lokalizasyonu gibi, zaman içinde aynı nöronların gözlemlenmesini gerektiren nöronal gelişim ve nörodejeneratif bozukluklardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin ana avantajları, protein ekspresyonu için virüslerin güvenli kullanımına izin veren tamamen kapalı kültür sistemi ve görüntüleme için aynı hücreleri lokalize etmek için fotoğrafla oyulmuş lamellerin kullanılmasıdır. Bu yöntem için ilk olarak, silindir tüplerin içindeki lameller üzerindeki dilimleri kültürlediğimizde aklımıza geldi, ancak zaman içinde canlı dilimlerde meydana gelen değişiklikleri görselleştirmek için daha iyi bir yola ihtiyacımız vardı. Mikroskop görüntüleme için transgenleri ve spesifik hücre popülasyonlarını ifade etmek için viral vektörlerin yaygın kullanımı, kullanıcıları korumak ve mikroskop objektiflerinin kontaminasyonunu ortadan kaldırmak için kapalı bir sistem geliştirmemize neden oldu.

Zaman içinde beyin dilimleri içindeki aynı hücre popülasyonunu takip etme yeteneği, insan nörolojik bozukluklarının kemirgen modellerinde patolojik değişikliklerin ve sinaps değişikliğinin gelişimi üzerine çalışmalara izin verir. Başlamak için, makaralı boru rafını hazırlayın ve ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi makaralı borulara bir delik açmaya yardımcı olacak bir aparat yapın. Jig'i kullanarak, düz kenarlı, bir santimetrelik plastik kültür tüpünü, düz tarafı yukarı bakacak şekilde yerinde tutun.

Ardından, merkezi alttan bir santimetre uzakta ve tüpün kenarları arasında ortalanmış olarak altı milimetre çapında bir delik açın. Döner çapak alma aleti ile deliğin kenarlarını düzleştirin ve dönüş sırasında deliğin boşaltılmasını kolaylaştırmak için deliğin iç kenarında dört oluk açın. Ardından, tüpleri %70 etanol ile durulayın ve ardından biyolojik bir güvenlik kabininde havayla kurutun.

Tüpleri UV lambası altında 40 dakika boyunca 12 milimetre delikli yapışkan silikon kauçuk disklerde sterilize edin. 20 dakika sonra, tüpleri ve diskleri, açıkta kalan tüm yüzeyler sterilize edilecek şekilde yeniden konumlandırın. Daha sonra yapışkan diskten beyaz desteği soyun, delikleri hizalayın ve silikon kauçuğu tüpün dışına yapıştırın.

Dilimler elde edildikten sonra, hazırlanmış bir lamel ile fotoğrafla kazınmış tarafın ortasına iki mikrolitre tavuk plazması yerleştirin. Üç ila dört mililitre çapında bir nokta elde etmek için plazmayı hafifçe yayın. Daha sonra hazırlanmış bir beyin dilimini kaldırmak için steril, dar uçlu bir spatula kullanın.

Dilimi kaldırırken dilimi spatula ucunda tutmak için kapalı forseps kullanın. Spatulayı lamel üzerindeki plazma noktasına dokundurun ve kapalı forseps ile dilimi lamel üzerine itin. Dilimi yerleştirmeden önce lamel üzerine ince bir civciv plazma tabakası ve dilimi kaplamak için minimum miktarda trombin ile muamele edilmiş plazma ekleyin.

Dilim yüzerse, bulut kaldırıldığında yapışmamış halde kalmayacaktır. Daha sonra 2.5 mikrolitre plazma ve 2.5 mikrolitre trombini ayrı bir tüpte karıştırın. Bu karışımdan 2,5 mikrolitreyi dilimin üzerine ve çevresine hızlıca yerleştirin ve karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.

Daha önce silindir borusuna yapıştırılmış olan silikon kauçuk yapıştırıcının açıkta kalan tarafındaki şeffaf, plastik kaplamayı çıkarın. Ardından, lameli beyin dilimi ile birlikte yapıştırıcının üzerine yerleştirin ve dilimi deliğin içinde hizalayın. Yapışmayı sağlamak için, lameli eşit şekilde aşağı bastırarak ve biyolojik güvenlik kabinine aktarırken yaklaşık bir dakika tutarak lamel üzerine başparmağınızla yumuşak ve eşit bir basınç uygulayın.

Lamelin sızıntı yapmadan boruya yapışması için üzerindeki basınç, çıkıntıdaki hava kanallarını ortadan kaldıracak kadar doğru olmalı ve yeterince uzun süre muhafaza edilmelidir. Çok fazla basınç lameli çatlatacaktır. Biyolojik bir güvenlik kabininde, her tüpe 0.8 mililitre tam nörobazal bir kültür ortamı ekleyin.

Ardından, bir kelepçe ile güvenli bir şekilde tutulan steril bir pamuk tıkalı Pasteur pipetinden %5 karbondioksit %95 hava karışımını akıtan. Silindir tüpünü gaz karışımıyla yıkamak ve pipetin etrafından çekilirken tüpü hızlı bir şekilde kapatmak için bunu kullanın. Ardından, tüpleri dilim numarası ve raf numarası ile etiketleyin.

Tüpleri bir makaralı rafa yerleştirin; geometrik olarak dengeli olduklarından emin olmak. Tek sayıda tüp varsa, dengelemek için boş tüpler ekleyin. Rafları 35 santigrat derecelik bir silindir inkübatöre yerleştirin ve silindirler makaralı rafı saatte 10 ila 13 devirde döndürün.

Önünü bir tahtaya kaldırarak inkübatörü yaklaşık 5 derece geriye doğru eğin. Dilim kültürüne sahip bir tüpü burada gösterildiği gibi özel yapım bir tüp tutucuya aktarın. Ardından, görüntüleme sırasında lamel hedefe dik tutmak için tüp tutucuyu sahne adaptörüne yerleştirin.

Ardından, tüpü yerinde tutmak için sahne adaptöründeki kaydırıcıyı tüpe sıkıca itin. Parlak alan trans-aydınlatması altında dört kez objektif kullanarak, dilimin altındaki fotoğrafla oyulmuş ızgara dönemine odaklanın. İlk görüntüleme oturumu için, daha yüksek büyütmeli görüntülemenin istendiği çeşitli bölgelerin numarasını bulmak ve kaydetmek için dilimin etrafını hızlı bir şekilde tarayın.

İlgi alanları belirlendikten sonra, sahneyi ilgi alanını içeren ilk ızgara karesine taşıyın. Ardından 20 güç hatası hedefine geçin ve bir referans işareti bulun. Ardından, daha yüksek bir güç hedefine geçin, aynı referans işaretini yerelleştirin ve sahnenin x ve y konumunu kaydedin.

Yakındaki diğer ilgi alanlarını bulmak için sahneyi hareket ettirin ve referans işaretinden x ve y uzaklıklarını kaydedin. Ofset konumları, tüp veya kademe adaptörü çıkarılıp değiştirildiğinde referans işaretinin orijinal x, y ayarı değişse bile, dilim görüntülendiğinde aynı lamel konumunun tutarlı bir şekilde belirlenmesine izin verir. Mikroskop objektif kontrolünü veya varsa bir Piezo sahne kontrolünü kullanarak seçilen her alanda bir görüntü Z-stick yakalayın.

Burada gösterilen konfokal görüntü yığını, nöronal hayati bir boya kullanarak, hem nöritlerin hem de hücre gövdesinin 3D mimarisini vurgular, ancak leke çekirdekten çıkarılır. Uzun süreli kültür sırasında büyüme dilimi morfolojisindeki zamana bağlı değişiklikleri ve dilimler içindeki canlılığı incelemek için, aynı dilim, görüntülemeden 24 saat önce haftada bir kez floresan nöronal hayati boya ile etiketlendi. Aynı hücrelerin zaman içinde görüntülenmesinin tekrarlanabilirliğini göstermek için, 13. günde nöronal hayati boya ile etiketlenmiş bir dilimin aynı alanı 14, 15, 16 ve 17. günlerde görüntülendi.

Her gün üç hücrenin konumu, çekirdeğin üzerindeki bir sembolle gösterilir. Nöronal hayati boyaya ek olarak, hücreleri etiketlemek için bu sistemle viral aracılı floresan proteinler kullanılabilir. Burada hem kalsiyuma duyarlı bir raportör hem de Kofilin içeren çubuklar, enfeksiyondan 10 gün sonra net bir şekilde tanımlanabilir.

Bu prosedürün başarılı bir şekilde uygulanması, tüm tüplerin, lamellerin ve solüsyonların önceden hazırlanmasını gerektirir. Ölüm sonrası kısa bir aralıkta dilimler elde edebilmek de başarı için çok önemlidir ve çok fazla pratik gerektirir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, diseksiyon ve kaplama süreleri de dahil olmak üzere, bir fare yavrusundan 12-18 hipokampal dilim elde etmek için yaklaşık 90 dakika içinde yapılabilir.

Bu prosedürü takiben, beyin dilimleri, floresan etiketli proteinlerin hücre tipine özgü ekspresyonunu elde etmek için çeşitli zamanlarda virüslerle enfekte edilebilir veya gen fonksiyonunu araştırmak için küçük enterferans yapan RNA veya kısa firkete RNA ile gen ekspresyonu için sessizlik sağlanabilir. Rekombinant virüslerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu reaktiflerle çalışırken her zaman göz koruması takmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.