Büyüme ve üreme Caenorhabditis elegans kimyasallar etkisi ölçme

Bu prosedürün genel amacı, topoizomeraz inhibitörü etoposid gibi kimyasalların model hayvan Caenorhabditis elegans'ın büyümesi ve üremesi üzerindeki etkisini ölçmektir. Bu yöntem, ilaçların geliştirilmesi için toksikolojik değerlendirme ve çevresel toksik maddelerin risk değerlendirmesi gibi toksikoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, memeli olmayan sistemlerde çeşitli kimyasalların toksisitesinin kontrol edilebilmesidir, bu nedenle bu teknik uygun ve uygun maliyetlidir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan So Young Lee olacak. Başlamak için, bir şişeye 0,6 gram sodyum klorür, 0,5 gram pepton, 3,4 gram agar, 195 mililitre damıtılmış su ve manyetik bir karıştırıcı ekleyerek iki temiz, 200 mililitrelik cam şişe hazırlayın. Ardından diğer boş şişeye manyetik bir karıştırıcı ekleyin.

Şişeleri 121 santigrat derecede 15 dakika otoklavlayın ve ardından şişeleri 55 santigrat derecede 30 dakika su banyosunda soğutun. Daha sonra, doldurulmuş şişeye 0.2 mililitre bir molar kalsiyum klorür, mililitre kolesterol başına 0.2 mililitre beş miligram, 0.2 mililitre bir molar magnezyum sülfat ve beş mililitre bir molar potasyum fosfat ekleyin. Daha sonra çözeltiyi 55 santigrat derecede sıcak bir plaka üzerinde manyetik karıştırarak karıştırın.

Karışık NGM ortamının yarısını boş 200 mililitrelik şişeye dökün. Daha sonra bir şişeye bir mililitre DMSO ekleyin ve tekrar karıştırmak için manyetik karıştırma kullanın. Diğer şişeyi 55 santigrat derecede bir su banyosunda saklayın.

Daha sonra DMSO içeren ortamdan üç mililitre 35 x 10 milimetre Petri kaplarına alın. Diğer şişeyi su banyosundan çıkarın ve karıştırmak için manyetik karıştırma kullanın. Sonra bir mililitre 75 milimolar etoposid ekleyin.

Ve tekrar karıştırdıktan sonra, alikotasyon prosedürünü tekrarlayın. Kimyasal içeren NGM plakalarını oda sıcaklığında yaklaşık üç saat beklettikten sonra soğutun ve kullanana kadar dört santigrat derecede saklayın. Kimyasal test için, her bir NGM plakasına 100 mikrolitre ısıyla etkisiz hale getirilmiş E.coli OP50 yayın.

Plakaların gece boyunca 20 santigrat derecede bir C.elegans inkübatörde kurumasına izin verin. Yaşla senkronize C.elegans yumurtalarını% 1 DMSO veya 750 mikromolar etoposid ile desteklenmiş bir NGM plakasına aktarın. C.elegans'ı dört gün boyunca 20 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin.

Her gün stereo mikroskop altında C.elegans'ın mikroskobik görüntülerini gözlemleyin ve çekin. Ayrıca, solucan boyutu kalibrasyonu için mikroskop aşaması mikrometresinin mikroskobik bir görüntüsünü alın. Her zaman noktasında DMSO veya etoposid ile muamele edilen C.elegans'ın vücut uzunluğunu ölçmek için, ImageJ'de mikroskop aşaması mikrometre görüntüsünü açın.

Ardından Düz Çizgi aracını kullanarak görüntü üzerinde 1.000 mikrometrelik bir çizgi sürükleyin. Analiz Et'e ve ardından Ölçeği Ayarla'ya tıklayın ve sırasıyla Bilinen Mesafe kutusuna ve Uzunluk Birimi kutusuna 1.000 ve mikrometre girin. Ardından Global'i işaretleyin ve Tamam'a tıklayın. Dosya'yı ve ardından Aç'ı kullanarak solucan görüntülerini açın.

Ardından, Freehand Line aracını kullanarak, her solucanın özelliği boyunca bir çizgi çizin. Analiz Et'e ve ardından Ölç'e tıklayarak vücut uzunluğu verilerini alın. Bu adımları 50 solucan için tekrarlayın.

Yaşa senkronize yumurtaları, genç erişkin aşamasına kadar 64 saat boyunca 20 santigrat derecede DMSO veya etoposit içeren NGM plakası üzerinde kuluçkaya yatırın. Beş yetişkin solucanı kimyasallar olmadan yeni NGM plakalarına veya aynı kimyasal ön işlemi içeren yeni NGM plakalarına aktarın ve 24 saat boyunca inkübe edin. Yetişkinleri az önce gösterildiği gibi yeni NGM plakalarına aktarın ve her gün yumurta sayısını sayın.

Ek olarak, sürünen, ölen veya içten yumurtadan çıkan solucanları sayın. Metin protokolüne göre hesaplamalar yapın. Burada gösterildiği gibi, etoposidin 24 ila 96 saat arasında tedavi edilmesi, C.elegans'ın büyümesini önemli ölçüde geciktirdi.

96 saatlik kuluçka süresinden sonra, etoposid ile tedavi edilen solucanlar vücut uzunluğunda 0.86 milimetreye kadar büyürken, araçla tedavi edilen solucanlar 1.04 milimetreye kadar büyüdü. Etoposid ile tedavi edilen solucanların bu görüntülerinde görüldüğü gibi, kontrol ile tedavi edilen solucanlara kıyasla stereo mikroskop gözlemi altında büyüme geriliği de gözlendi. 72 saatlik kuluçka süresinden sonra, araçla tedavi edilen solucanlardan elde edilen yumurtalar gözlendi.

Buna karşılık, 96 saatlik etoposid tedavisinden sonra yumurtalar gözlendi ve etoposid tedavisinin C. Elegans'ın ilk doğum zamanını geciktirme olasılığını artırdı. Bu grafiklerde gösterildiği gibi, genç yetişkin solucanlar sürekli etoposid tedavisinin varlığında veya yokluğunda kültürlendiğinde, etoposid tedavisi ile toplam yumurta sayısında bir azalma gözlenmiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa bir hafta içinde yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, bir model nematod olan C.elegans'ta kimyasal toksisitenin nasıl değerlendirileceğini iyi anlamış olmalısınız.