Transwell Migrasyon Testi
Kimyasal ipuçlarına yanıt olarak hücre göçü, gelişim, bağışıklık ve kanser gibi hastalık durumları için çok önemlidir. Hücre göçünü ölçmek için, 1961'…
Transwell göç testi, bilim adamlarının hücre hareketini ölçmesine izin veren klasik bir tekniktir. Göç, bir hücrenin tek tek veya kümeler halinde hareket etme yeteneğini ifade eder. Hücre hareketleri, hücre iskeletlerinin hassas bir şekilde yeniden yapılandırılmasıyla mümkün olur ve göç genellikle ipucu görevi gören uyaranlara yanıt olarak gerçekleşir.
Bugün, ipuçlarını çekmeye yanıt olarak göçü değerlendirmek için basit bir oda kurulumu kullanan transwell göç testini tartışacağız.
Transwell odası hakkında bazı arka plan bilgileri sağlayarak başlayacağız.
Cihaz ilk olarak 1961'de Dr. Stephen Boyden tarafından tasarlandı ve lökosit göçünü incelemek için kullanıldı. Bu nedenle, bu yöntem aynı zamanda Boyden odası testi olarak da bilinir.
Basit bir Boyden odasında, dış duvar, 96 oyuklu bir plakanınki gibi kuyucuklara aittir. Her kuyucuğun içine, silindirik bir ek olan bir transwell yerleştirilir. Ek parça, tanımlanmış bir gözenek boyutuna sahip bir polikarbonat membrana sahiptir. Kuyuya yerleştirildiğinde, odayı iki bölmeye ayırır. Üst bölme, göç davranışı incelenecek hücrelerin tohumlanacağı yerdir ve alt rezervuar, kemoatraktan çözeltisinin yerleştirildiği yerdir. Tanım olarak, bir kemoatraktan, "hücreleri çekerek" hücre hareketliliğini artırma yeteneğine sahip bir moleküldür.
Bu çekici kuvvetler nedeniyle, üst bölmedeki hücreler gözeneklerden alt rezervuara göç eder. Hücreler, bazı melanom hücreleri gibi yapışık özelliklere sahipse, hareketi takiben zarın alt tarafına "yapışırlar". Bu durumda, zar sabitlenebilir, boyanabilir ve mikroskop altında hücreler sayılabilir. Öte yandan, sperm gibi yapışık olmayan hücreler alt rezervuara göç edecektir. Bu durumda, rezervuar çözeltisindeki hücreler bir hemositometre yardımıyla sayılabilir.
Bu testin kurulumu basit olsa da, deneyden önce göz önünde bulundurmanız gereken birkaç şey vardır. Bazılarını gözden geçirelim.
Tohumlama çözeltisinden başlayarak, hücre göçünü gözlemlemek için yoğunluğun optimize edildiğinden emin olmalısınız. Çok az hücre, tespit edilemeyen göçe neden olabilir ve daha büyük yoğunluklar zarı aşırı doldurarak göçü numaralandırmayı zorlaştırır. İkinci husus, ekin gözenek boyutudur. Hücre tipine bağlı olarak dikkatlice seçilmelidir. Gözenek boyutu çok küçükse, hücreler geçemez.
Alternatif olarak, gözenek boyutu çok büyükse, hücreler sadece düşecektir, bu da göç değildir. Son olarak, kemoatraktan konsantrasyonuna ve göç için izin verilen kuluçka süresine dikkat edilmelidir, çünkü bunlar birbirine bağlıdır. Bölmeler arasında konsantrasyon gradyanının korunduğu uygun inkübasyon süresi ile optimal konsantrasyon, kemo-çekim nedeniyle hücre göçünü indükler. Tersine, uzun süreli inkübasyonlara, oda boyunca kemoatraktan dengesi eşlik edebilir ve bu da elde edilen sonuçların analizini karıştırabilecek kimyasal gradyan kaybına yol açabilir.
Bu hususları göz önünde bulundurarak, yapışık hücrelerin göçünü ölçmek için kullanılan bir protokolü tartışalım.
Test edilecek hücreler proteaz içermeyen bir ortamda hazırlanır, çünkü proteazlar önemli zar reseptörlerini denatüre edebilir ve sonuçta göçü etkileyebilir. Hücreler hazırlandıktan sonra, süspansiyon optimal bir tohumlama yoğunluğuna seyreltilmelidir. Odayı hazırlamak için, transwell'ler çok kuyulu bir plaka üzerindeki kuyucuklara yerleştirilir. Hücre süspansiyonu, zara dokunmadan veya hava kabarcıkları oluşturmadan transwell içine pipetlenmelidir.
Kemoatraktan çözeltisi alt hazneye pipetlenir ve çözeltinin ekin zarına temas ettiğinden emin olunur. Göç için kuluçka süresi, deneysel hususlara bağlı olacaktır. İnkübasyondan sonra, zarlar, ek parçanın% 70 etanole daldırılmasıyla sabitlenir. Ek parçanın kurumasına izin verdikten sonra, hücre boyama çözeltisi eklenir.
Daha sonra, hücreler oda sıcaklığında yaklaşık 30 dakika inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, ekler yıkama tamponu yardımı ile yıkanır. Son olarak, zar eksize edilebilir ve bir mikroskop lamı üzerine yerleştirilebilir. Zarın alt tarafındaki hücreler, kemoatraktanların varlığında ve yokluğunda göç eden hücrelerin sayısını temsil eder.
Artık protokol hakkında bir fikriniz olduğuna göre, araştırmacıların bu yöntemi keşiflerinde nasıl kullandıklarına kısaca bir göz atalım.
Bu testin en yaygın uygulamalarından biri, bilinmeyen bileşiklerin kemoatraktan özelliklerini değerlendirmektir. Burada bilim adamları, amfibi yumurtaları tarafından salgılanan bir madde olan allurin varlığında kurbağa spermlerinin yüzme yollarını incelemekle ilgilendiler. Bunu yapmak için, önce aktif kurbağa spermlerini transwell eklerinin üstüne pipetlediler. Altına allurin eklediler. Hücrelerin göç etmesine izin verdikten sonra, mikroskop altında rezervuar çözeltisindeki spermleri saydılar. Bu tekniği kullanarak, allurin konsantrasyonunun sperm göçü üzerindeki etkisini gösteren bir konsantrasyon-tepki eğrisi oluşturabildiler.
Bir hücre patojenler tarafından saldırıya uğradığında, göç eden, bağlanan ve ardından enfeksiyonu çözen bağışıklık hücrelerini işe almak için kemoatraktanlar gönderir. Bu fenomeni test etmek için, bu bilim adamları eklerin alt tarafındaki epitel hücrelerini kültürlediler. Daha sonra, bu hücreleri farklı bakteri türleri ile enfekte ettiler. Son olarak, bağışıklık hücrelerini üst odaya soktular. Enfekte hücrelerin, bağışıklık hücresi göçünü indükleyen birkaç kemoatraktan ürettiği bilinmektedir. Bu deneyin sonuçları, farklı bakteriyel enfeksiyon türlerine yanıt olarak farklı derecelerde nötrofil göçü gösterdi.
Son olarak, hücre dışı matris yoluyla kanser hücresi istilası ve metastazı her zaman hücre biyologlarının ilgisini çekmiştir. Burada bilim adamları, belirli kemoatraktanların bir 3D matris aracılığıyla bu tür bir göçe nasıl katkıda bulunabileceğini belirlemek istediler. Genetik olarak iki ayrı hücre havuzunu tasarladılar: biri yeşil floresan ve diğeri kırmızı floresan proteini ifade ediyor. Daha sonra transwell'lerin tepesine hücre dışı bir matris taklidi pipetlediler.
Katılaştıktan sonra, transwell'i ters çevirdiler ve zarın alt tarafına iki hücre havuzu ektiler. Daha sonra, eki çok kuyulu plakaya yerleştirdiler ve kemoatraktan çözeltiyi üst hazneye pipetlediler. Bu, alttaki hücrelerin yukarı ve 3B matris boyunca hareket etmesine neden oldu. Konfokal görüntülemenin yardımıyla, bu araştırmacılar hücre göçünü 3D olarak yeniden yapılandırdılar ve iki hücre grubunun göç modellerini ayırt ettiler.
Az önce JoVE'nin transwell göç tahlili hakkındaki videosunu izlediniz. Bu yöntemin bileşenlerini ve protokolünü anladığınızda, artık hücre biyologları tarafından neden bu kadar yaygın olarak kullanıldığını biliyorsunuz. Bu kurulumun basitliğine rağmen, bu yöntemin uyarlayabileceği konfigürasyon yelpazesi, onu hücre motilite çalışmaları için vazgeçilmez kılmaktadır. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Transwell göç testi, bilim adamlarının hücre hareketini ölçmesine izin veren klasik bir tekniktir. Göç, bir hücrenin tek tek veya kümeler halinde hareket etme yeteneğini ifade eder. Hücre hareketleri, hücre iskeletlerinin hassas bir şekilde yeniden yapılandırılmasıyla mümkün olur ve göç genellikle ipucu görevi gören uyaranlara yanıt olarak gerçekleşir.
Bugün, ipuçlarını çekmeye yanıt olarak göçü değerlendirmek için basit bir oda kurulumu kullanan transwell göç testini tartışacağız.
Transwell odası hakkında bazı arka plan bilgileri sağlayarak başlayacağız.
Cihaz ilk olarak 1961'de Dr. Stephen Boyden tarafından tasarlandı ve lökosit göçünü incelemek için kullanıldı. Bu nedenle, bu yöntem aynı zamanda Boyden odası testi olarak da bilinir.
Basit bir Boyden odasında, dış duvar, 96 oyuklu bir plakanınki gibi kuyucuklara aittir. Her kuyucuğun içine, silindirik bir ek olan bir transwell yerleştirilir. Ek parça, tanımlanmış bir gözenek boyutuna sahip bir polikarbonat membrana sahiptir. Kuyuya yerleştirildiğinde, odayı iki bölmeye ayırır. Üst bölme, göç davranışı incelenecek hücrelerin tohumlanacağı yerdir ve alt rezervuar, kemoatraktan çözeltisinin yerleştirildiği yerdir. Tanım olarak, bir kemoatraktan, "hücreleri çekerek" hücre hareketliliğini artırma yeteneğine sahip bir moleküldür.
Bu çekici kuvvetler nedeniyle, üst bölmedeki hücreler gözeneklerden alt rezervuara göç eder. Hücreler, bazı melanom hücreleri gibi yapışık özelliklere sahipse, hareketi takiben zarın alt tarafına "yapışırlar". Bu durumda, zar sabitlenebilir, boyanabilir ve mikroskop altında hücreler sayılabilir. Öte yandan, sperm gibi yapışık olmayan hücreler alt rezervuara göç edecektir. Bu durumda, rezervuar çözeltisindeki hücreler bir hemositometre yardımıyla sayılabilir.
Bu testin kurulumu basit olsa da, deneyden önce göz önünde bulundurmanız gereken birkaç şey vardır. Bazılarını gözden geçirelim.
Tohumlama çözeltisinden başlayarak, hücre göçünü gözlemlemek için yoğunluğun optimize edildiğinden emin olmalısınız. Çok az hücre, tespit edilemeyen göçe neden olabilir ve daha büyük yoğunluklar zarı aşırı doldurarak göçü numaralandırmayı zorlaştırır. İkinci husus, ekin gözenek boyutudur. Hücre tipine bağlı olarak dikkatlice seçilmelidir. Gözenek boyutu çok küçükse, hücreler geçemez.
Alternatif olarak, gözenek boyutu çok büyükse, hücreler sadece düşecektir, bu da göç değildir. Son olarak, kemoatraktan konsantrasyonuna ve göç için izin verilen kuluçka süresine dikkat edilmelidir, çünkü bunlar birbirine bağlıdır. Bölmeler arasında konsantrasyon gradyanının korunduğu uygun inkübasyon süresi ile optimal konsantrasyon, kemo-çekim nedeniyle hücre göçünü indükler. Tersine, uzun süreli inkübasyonlara, oda boyunca kemoatraktan dengesi eşlik edebilir ve bu da elde edilen sonuçların analizini karıştırabilecek kimyasal gradyan kaybına yol açabilir.
Bu hususları göz önünde bulundurarak, yapışık hücrelerin göçünü ölçmek için kullanılan bir protokolü tartışalım.
Test edilecek hücreler proteaz içermeyen bir ortamda hazırlanır, çünkü proteazlar önemli zar reseptörlerini denatüre edebilir ve sonuçta göçü etkileyebilir. Hücreler hazırlandıktan sonra, süspansiyon optimal bir tohumlama yoğunluğuna seyreltilmelidir. Odayı hazırlamak için, transwell'ler çok kuyulu bir plaka üzerindeki kuyucuklara yerleştirilir. Hücre süspansiyonu, zara dokunmadan veya hava kabarcıkları oluşturmadan transwell içine pipetlenmelidir.
Kemoatraktan çözeltisi alt hazneye pipetlenir ve çözeltinin ekin zarına temas ettiğinden emin olunur. Göç için kuluçka süresi, deneysel hususlara bağlı olacaktır. İnkübasyondan sonra, zarlar, ek parçanın% 70 etanole daldırılmasıyla sabitlenir. Ek parçanın kurumasına izin verdikten sonra, hücre boyama çözeltisi eklenir.
Daha sonra, hücreler oda sıcaklığında yaklaşık 30 dakika inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, ekler yıkama tamponu yardımı ile yıkanır. Son olarak, zar eksize edilebilir ve bir mikroskop lamı üzerine yerleştirilebilir. Zarın alt tarafındaki hücreler, kemoatraktanların varlığında ve yokluğunda göç eden hücrelerin sayısını temsil eder.
Artık protokol hakkında bir fikriniz olduğuna göre, araştırmacıların bu yöntemi keşiflerinde nasıl kullandıklarına kısaca bir göz atalım.
Bu testin en yaygın uygulamalarından biri, bilinmeyen bileşiklerin kemoatraktan özelliklerini değerlendirmektir. Burada bilim adamları, amfibi yumurtaları tarafından salgılanan bir madde olan allurin varlığında kurbağa spermlerinin yüzme yollarını incelemekle ilgilendiler. Bunu yapmak için, önce aktif kurbağa spermlerini transwell eklerinin üstüne pipetlediler. Altına allurin eklediler. Hücrelerin göç etmesine izin verdikten sonra, mikroskop altında rezervuar çözeltisindeki spermleri saydılar. Bu tekniği kullanarak, allurin konsantrasyonunun sperm göçü üzerindeki etkisini gösteren bir konsantrasyon-tepki eğrisi oluşturabildiler.
Bir hücre patojenler tarafından saldırıya uğradığında, göç eden, bağlanan ve ardından enfeksiyonu çözen bağışıklık hücrelerini işe almak için kemoatraktanlar gönderir. Bu fenomeni test etmek için, bu bilim adamları eklerin alt tarafındaki epitel hücrelerini kültürlediler. Daha sonra, bu hücreleri farklı bakteri türleri ile enfekte ettiler. Son olarak, bağışıklık hücrelerini üst odaya soktular. Enfekte hücrelerin, bağışıklık hücresi göçünü indükleyen birkaç kemoatraktan ürettiği bilinmektedir. Bu deneyin sonuçları, farklı bakteriyel enfeksiyon türlerine yanıt olarak farklı derecelerde nötrofil göçü gösterdi.
Son olarak, hücre dışı matris yoluyla kanser hücresi istilası ve metastazı her zaman hücre biyologlarının ilgisini çekmiştir. Burada bilim adamları, belirli kemoatraktanların bir 3D matris aracılığıyla bu tür bir göçe nasıl katkıda bulunabileceğini belirlemek istediler. Genetik olarak iki ayrı hücre havuzunu tasarladılar: biri yeşil floresan ve diğeri kırmızı floresan proteini ifade ediyor. Daha sonra transwell'lerin tepesine hücre dışı bir matris taklidi pipetlediler.
Katılaştıktan sonra, transwell'i ters çevirdiler ve zarın alt tarafına iki hücre havuzu ektiler. Daha sonra, eki çok kuyulu plakaya yerleştirdiler ve kemoatraktan çözeltiyi üst hazneye pipetlediler. Bu, alttaki hücrelerin yukarı ve 3B matris boyunca hareket etmesine neden oldu. Konfokal görüntülemenin yardımıyla, bu araştırmacılar hücre göçünü 3D olarak yeniden yapılandırdılar ve iki hücre grubunun göç modellerini ayırt ettiler.
Az önce JoVE'nin transwell göç tahlili hakkındaki videosunu izlediniz. Bu yöntemin bileşenlerini ve protokolünü anladığınızda, artık hücre biyologları tarafından neden bu kadar yaygın olarak kullanıldığını biliyorsunuz. Bu kurulumun basitliğine rağmen, bu yöntemin uyarlayabileceği konfigürasyon yelpazesi, onu hücre motilite çalışmaları için vazgeçilmez kılmaktadır. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the transwell migration assay and why is it used in cell biology?
The transwell migration assay, also called the Boyden chamber assay, is a classical technique designed in 1961 to quantify cell movement in response to chemical cues. It uses a simple chamber setup with a polycarbonate membrane separating two compartments. Scientists seed cells in the top chamber and place chemoattractant solution below, then count migrated cells to measure cell motility and cell invasion and chemo attraction responses.
Q2: How does the transwell chamber separate cells and chemoattractants?
The transwell chamber consists of a cylindrical insert with a polycarbonate membrane of defined pore size placed inside a multiwell plate well. This membrane divides the chamber into two compartments: the top compartment holds cells to be studied, and the bottom reservoir contains chemoattractant solution. Cells migrate through the membrane pores toward the attracting chemical gradient in the lower compartment.
Q3: What factors must be optimized before running a transwell migration assay?
Three critical factors require optimization: cell seeding density must be balanced to detect migration without overpopulation; pore size must match the cell type so cells can pass through without falling through; and chemoattractant concentration with appropriate incubation time must maintain a chemical gradient. Prolonged incubation can equilibrate the chemoattractant throughout the chamber, eliminating the gradient and confounding results.
Q4: How are adherent cells counted after migration in a transwell assay?
After incubation, the transwell membrane is fixed by dipping the insert into 70% ethanol and allowed to dry. Cell staining solution is then applied for approximately 30 minutes at room temperature. Following washing with buffer, the membrane is excised and placed on a microscope slide. Cells on the membrane's underside represent those that migrated and can be counted microscopically.
Q5: Why is protease-free medium used when preparing cells for the transwell assay?
Protease-free medium is essential because proteases can denature important membrane receptors that are critical for cell migration. Damaged receptors would impair the cell's ability to respond to chemoattractant signals, compromising the accuracy of migration measurements and potentially underestimating or misrepresenting the cell's true migratory capacity.
Q6: What are common research applications of the transwell migration assay?
Researchers use the transwell assay to evaluate chemoattractant properties of unknown compounds, test immune cell recruitment in response to infection, and study cancer cell invasion through extracellular matrices. The assay's adaptability allows scientists to examine migration in various contexts, from simple 2D membrane assays to complex 3D matrix invasion studies using fluorescent cell tracking.
Q7: How do adherent and non-adherent cells differ in transwell migration assays?
Adherent cells, like melanoma cells, stick to the membrane's underside after migration and are counted by fixing, staining, and microscopic observation of the membrane. Non-adherent cells, like sperm, migrate into the bottom reservoir solution and are counted using a hemocytometer. The counting method depends on the cell type's inherent adhesive properties.