Multiplex sitokin Immunoassay sitometrik boncuk tabanlı platformu kullanarak uyarılmış fare Splenocytes profil oluşturma

Bu protokolün genel amacı, bir multipleks boncuk bazlı immünolojik test ve bir akış sitometresi kullanılarak uyarılmış fare splenositlerinden toplanan doku kültürü süpernatantlarında aynı anda birden fazla sitokin hedefini ölçmektir. Bu yöntem, immünoloji alanındaki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir, örneğin, belirli hastalık durumları bağlamında bağışıklık tepkisini düzenleyen benzersiz sitokin profilleri nelerdir? Bu tekniğin ana avantajı, birden fazla annelidin aynı anda miktar tayininin, geleneksel ELISA formatlarından çok daha az numune hacmi kullanılarak gerçekleştirilebilmesi ve aynı zamanda spesifik olmayan bağlanmayı azaltmasıdır.

Prosedürü gösteren, ürün geliştirme ekibimizden bir araştırma görevlisi olan Nicholas Johnsen olacaktır. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi biyolojik numune hazırlama ile başlayın. Önceden karıştırılmış antikorla hareketsiz hale getirilmiş boncukları hazırlamak için, önceden karıştırılmış boncuk şişesini oda sıcaklığında bir sonikatör banyosunda bir dakika boyunca sonikleştirin.

Daha sonra kullanmadan önce 30 saniye girdap yapın. Sonikatör banyosu yoksa, girdap süresini bir dakikaya çıkarın. Standart hazırlık için, liyofilize Mouse Th Cytokine Standard kokteylini sulandırmak için 250 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin.

Kısa bir süre girdap yaparak karıştırın ve şişenin oda sıcaklığında 10 dakika bekletilmesine izin verin. Standart kokteyli C7 etiketli bir polipropilen mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bu, en üst standart olarak kullanılacaktır. Altı polipropilen mikrosantrifüj tüpünü C1 ila C6 olarak etiketleyin. Bu tüplerin her birine 75 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin.

Ardından, en üst standart olan C7'nin 25 mikrolitresini C6 tüpüne aktarın ve girdaplama ile iyice karıştırın. Bu C6 standardı olacaktır. Bir sonraki en düşük standart tüpteki 75 mikrolitre tahlil tamponuna önceki standarttan 25 mikrolitre eklemek için her tüp için yeni bir pipet ucu kullanarak seri bir ila dört seyreltme yapmaya devam edin.

Her ilaveyi girdap yaparak takip edin. Mililitre standardı başına sıfır pikogram olarak tahlil tamponu kullanın. Testi gerçekleştirmek için, kullanmadan önce tüm reaktiflerin oda sıcaklığına ısınmasına izin verin.

Bu gösterimde polipropilen filtre plakaları kullanılmıştır. Boncukların kaybolmasını önlemek için, yıkama adımları da dahil olmak üzere tüm tahlil prosedürü boyunca plakanın dik tutulması kesinlikle önemlidir. Her bir kuyucuğa 100 mikrolitre 1X yıkama tamponu ekleyerek filtre kağıdını önceden ıslatın ve plakaları oda sıcaklığında bir dakika

Vakum manifoldunu kullanarak tampon hacmini çıkarın. Plakayı bir yığın temiz kağıt havluya bastırarak plakanın altındaki fazla yıkama tamponunu kurulayın. Ardından, plakayı ters çevrilmiş plaka kapağının üzerine yerleştirin.

Hücre kültürü süpernatan numuneleri için, tüm kuyucuklara 25 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin. Standart kuyucuklara her standarttan 25 mikrolitre ekleyin. Son olarak, numune kuyucuklarına her numuneden 25 mikrolitre ekleyin.

Karışık boncukları 30 saniye boyunca girdaplayın. Ardından, her bir oyuğa 25 mikrolitre karışık boncuk ekleyin ve boncuk çökelmesini önlemek için boncuk şişesini aralıklı olarak sallayın. Plakayı bir plaka kapatıcı ile kapatın.

Mühürlendikten sonra, ters çevrilmiş plaka kapağı da dahil olmak üzere tüm plakayı alüminyum folyo ile sarın. Plakayı bir tabak çalkalayıcıya yerleştirin, sabitleyin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca yaklaşık 500 RPM'de çalkalayın. Ters çevirmeden, plakayı vakum manifoldunun üzerine yerleştirin ve vakumu daha önce olduğu gibi uygulayın.

Ardından, her kuyucuğa 200 mikrolitre 1X yıkama tamponu ekleyin. Tahlil plakası kuyucuklarının içeriğini vakumlu filtrasyon ile çıkarın. Bu adımı bir kez daha tekrarlamadan önce plakanın altındaki fazla yıkama tamponunu emici bir ped veya kağıt havluyla kurulayın.

Daha sonra, her oyuğa 25 mikrolitre tespit antikoru ekleyin. Plakayı yeni bir plaka kapatıcı ile kapattıktan sonra, ters çevrilmiş plaka kapağı da dahil olmak üzere tüm plakayı alüminyum folyo ile sarın. Plakayı bir tabak çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca yaklaşık 500 RPM'de çalkalayın.

Vakumlamadan, her bir oyuğa doğrudan 25 mikrolitre streptavidin fikoeritrin reaktifi ekleyin. Plakayı daha önce olduğu gibi kapatın ve sarın. Ardından plakayı bir tabak çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yaklaşık 500 RPM'de çalkalayın.

Vakum filtrasyon adımını iki kez tekrarladıktan sonra, her kuyucuğa 200 mikrolitre 1X yıkama tamponu ekleyin. Boncukları bir plaka çalkalayıcı üzerinde bir dakika boyunca tekrar askıya alın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, numuneleri bir akış sitometresinde okumak için numuneleri filtre plakasından FACS tüplerine aktarın.

Akış sitometresini ve edinme yazılımını, cihazla birlikte verilen üreticinin talimatlarına göre başlatın. X ekseninde ileri dağılım ve Y ekseni için yan dağılım ile bir nokta grafiği oluşturun. İleri saçılmayı ve yan saçılmayı doğrusal moda ayarlayın.

Boncukları yeniden askıya almak için kitte bulunan ham boncuk şişesini 30 saniye boyunca vorteksleyin. 400 mikrolitre ham boncukları yeni bir FACS tüpüne aktarın. Akış sitometresi akış hızını düşük olarak ayarlayın.

Ham boncukları çalıştırın, ileri saçılma ve yan saçılma için kazanç ve voltajı dikkatlice ayarlayın, böylece bu boncukların her iki boyut popülasyonu da gözle görülür şekilde ayrılır ve kapısı kolay olur. İstenmeyen olayları dışlamak için ileri dağılım eşiğini ayarlayın. İleri dağılım ve yan dağılım grafiğinde, tüm boncuk popülasyonlarını içeren bir kapı çizin.

X ekseninde PE ve Y ekseni için APC ile ikinci nokta grafiğinde ileri saçılma ve yan saçılma grafiğinden geçitli boncuk popülasyonlarını görüntüleyin. APC floresan kanalı için PMT voltajını, tüm boncuk popülasyonları için APC sinyalinin 10 ile 5.000 arasında bir medyan floresan yoğunluğuna veya MFI'ye sahip olacak şekilde ayarlayın. Daha sonra, boncukları yeniden askıya almak için PE kurulum boncuklarının şişesini 30 saniye boyunca vorteksleyin.

Yeniden süspanse edilmiş PE boncukların 400 mikrolitresini yeni bir FACS tüpüne aktarın. Akış sitometresindeki ham boncuk tüpünü PE boncuk tüpü ile değiştirin. PE floresan kanal ayarı için fotoçoğaltıcı tüp voltajını, PE boncukların MFI'si PE boncuk şişesinde listelenen partiye özgü aralık arasında kalacak şekilde ayarlayın.

Veri toplamayı gerçekleştirmek için, alınacak boncuk olaylarının sayısını anolit başına yaklaşık 300 olarak ayarlayın. Analizden önce her numuneyi beş saniye boyunca vorteksleyin. Ardından örnekleri okuyun.

Numuneleri okurken, önce akış sitometresini kurulum moduna ayarlayın ve alım moduna geçmeden önce boncuk popülasyonunun stabilize olmasını bekleyin. Metin protokolünde açıklandığı gibi veri analizi gerçekleştirmeden önce toplam olaylar yerine yalnızca geçitli olayları dışa aktarın. Hedef anolitler için temsili standart eğriler, fare T yardımcı sitokin paneli kullanılarak oluşturuldu.

Düzgün çalıştırılan tahliller, burada gösterildiği gibi geniş dinamik aralıklara sahip eğrileri gösterecektir. Test her gerçekleştirildiğinde standart eğriler çalıştırılmalıdır. Fare splenositleri 48 saat boyunca çeşitli koşullar altında kültüre edildi.

Kültür süpernatanları toplandı ve daha sonra fare T yardımcı sitokin paneli kullanılarak 13 hedefin konsantrasyonları ölçüldü. Stimülasyon koşullarına yanıt olarak diferansiyel sitokin ekspresyon profilleri açıkça görülebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu tekniğin laboratuvar tezgahı, uygun şekilde yapılırsa beş buçuk saatten daha kısa sürede tamamlanabilir.

Veri toplama ve aşağı akış analiz süreleri, numune sayısına bağlı olarak değişecektir. Bu videoyu izledikten sonra, bu protokolün nasıl kullanılacağını, sitometrik, boncuk bazlı bir immünolojik test kullanarak biyolojik numunelerdeki anolit konsantrasyonlarının nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu, reaktif hazırlama, inkübasyon adımları ve veri toplama için akış sitometresi kurulumunu içerir.