Bütün Dağı takas ve Arabidopsis çiçek organ ve Siliques boyama

Bu protokol, çiçek tomurcuklarının, çiçeklerin ve genç siliklerin nasıl düzgün bir şekilde inceleneceğini açıklar. Ve çeşitli boyama ve gözlem teknikleri için müteakip tam montaj temizliği. Bu yöntem, cinsel bitki üretimi alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Sürekli mutant bir analiz veya çiçek gelişimi ve işlevinde çevresel ve deneysel olarak indüklenen herhangi bir başarısızlık gibi. Bu tekniğin temel avantajı, birçok gelişim aşamasının aynı anda kolay ve hızlı bir şekilde taranmasına izin vermesidir. Çiçek anatomisi ve diseksiyon becerileri hakkında önceden bilgi sahibi olmayı gerektirdiğinden, çiçek organı diseksiyon adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir.

Başlamak için, senkronize bitkilerden çiçekleri çıkarmak için küçük makas kullanın. Ve bunları hemen uygun bir fiksatif içeren ayrı mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin. Ardından, sabitleyiciyi çıkarın ve numuneleri tamamen kaplayacak kadar %70 etanol ekleyin.

Numuneleri en az 24 saat boyunca dört santigrat dereceye geri koyun. Daha sonra bir saatçinin camını taze yapılmış %70 etanol ile doldurun ve destek için küçük bir Petri kabına koyun. Ardından çiçek salkımını saatçinin camına yerleştirin ve tamamen etanol ile kaplandığından emin olun.

Forseps ve iğne ile donatılmış bir şırınga kullanarak, çanak yaprakları, yaprakları ve ercikleri parçalayarak çiçeği stereo mikroskop altında inceleyin. Ardından saatçinin camını bir kenara koyun ve son diseksiyon için bir cam slayt kullanın. Numuneyi kaydırmak için hareket ettirin ve 10 mikrolitre taze yapılmış %70 etanol ekleyin.

Karpalın her iki tarafında kesikler yapın ve gerektiği gibi döndürün. Ardından yumurtaları ortaya çıkarmak için valfleri yavaşça çıkarın. Verici dokunun yarısını yuvadan ayırmak için keskin küçük bir kesik yapın ve iki yarıyı ayırmak için forseps ve bir iğne kullanın.

Stigma stilini ve sapı keskin kesimlerle çıkarın. Forseps ve iğneyi kullanarak, iki paralel sıra elde etmek için hala bağlı olan ovülleri nazikçe çevirin ve düzenleyin. Cam slayt üzerindeki numuneden etanolü çıkarmak için küçük bir parça kurutma kağıdı kullanın.

Ardından slayta 20 mikrolitre temizleme solüsyonu ekleyin. Hipodermik iğneli bir çift şırınga kullanarak numuneleri yerleştirin ve kalan hava kabarcıklarını çıkarın. Ardından, sürgünün üzerine nazikçe bir kapak fişi yerleştirin ve temizleme solüsyonu kapak fişi ile numune arasındaki boşluğu doldurana kadar bekleyin.

Sürgüyü bir sürgü tutucusuna yerleştirin ve çeker ocakın altında bırakın. Öyleyse, ayrışmayan anterlerle açılmak üzere olan taze hasat edilmiş çiçek tomurcuklarına gelelim. Daha sonra çiçek tomurcuklarını tamamen batırmak için yeterli İskender çözeltisi içeren 96 oyuklu bir plaka hazırlayın.

Anterleri ortaya çıkarmak için çanak yaprakları ve yaprakları çıkarın ve bunları Alexander çözeltisine batırın. Plakanın çeker ocak altında bir ila üç saat oturmasına izin verin. Daha sonra Alexander solüsyonunu Herr'in dört buçuk solüsyonu ile değiştirin ve plakayı gece boyunca davlumbazın altında inkübe edin.

Ertesi gün, temizlenmiş tomurcukları dikkatlice yeni bir slayta taşımak için forseps kullanın. Daha sonra, organlarını inceleyin ve diğer tüm dokuları numunelerden çıkarın. Daha sonra, Herr'in dört buçuk çözeltisini kullanarak kloral hidrat bazlı temizleme ve kombine temizleme boyama ile devam edin.

Önce çiçeği saatçinin camından slayta taşıyın ve fazla etanolü çıkarmak için bir kurutma kağıdı kullanın. Beş ila 10 mikrolitre DAPI çözeltisi ekleyin. Hipodermik iğneli iki şırınga kullanarak, organlarını inceleyin ve diğer tüm çiçek organlarını çıkarın.

Daha sonra polen tanelerini DAPI çözeltisine bırakın. Slaytta sadece polen tanelerinin kaldığından emin olarak ercikteki tüm kalıntıları slayttan çıkarın. Slayttan tüm ercik kalıntılarının çıkarılması, ekzin çıkarılması için en kritik adımdır.

Sürgü ile örtü kızağı arasında sadece polen taneleri bırakılmalıdır. Daha sonra, numune yatak kızağına bir lam yerleştirin ve lam ile lam arasındaki boşluğu doldurmak için gereken minimum miktarda DAPI solüsyonu ekleyin. İşaret parmağınızı nazikçe kapak kızağının üzerine yerleştirin ve hızlı bir kısa kayma hareketi yapın.

Slaytı karanlıkta dört santigrat derecede en az 15 dakika boyunca bir insan kutusuna yerleştirin. Daha sonra slaydı 24 saat içinde geniş alan floresansı veya konfokal mikroskopi altında gözlemleyin. İncelenen numuneyi saatçinin camından %1 SDS ve 0.2 sodyum hidroksit çözeltisi ile doldurulmuş boşlukları olan bir cam plakaya taşıyın.

Gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. SDS sodyum hidroksit çözeltisi, numuneleri hızlı bir şekilde temizleyerek birkaç dakika içinde şeffaf görünmelerini sağlar. Numuneyi suyla dikkatlice durulayın ve temiz bir slayta yerleştirin.

Ardından slayta 20 ila 40 mikrolitre boyama solüsyonu ekleyin. Analiz edilecek çiçek organına ve araştırmacının becerilerine bağlı olarak, bu DS tedavisi deneyimli araştırmacılar için önce, deneyimli araştırmacılar için veya daha az deneyimli araştırmacılar için diseksiyon adımından sonra gerçekleştirilebilir. Ardından, hazırlığı ezmemeye dikkat ederek sürgünün üzerine bir kapak fişi yerleştirin.

Daha sonra hazırlanan tüm slaytları alüminyum folyo ile kaplı bir insan kutusuna yerleştirin ve bir saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Son olarak, numuneyi geniş alan floresansı veya konfokal mikroskopi altında gözlemleyin. Protokolde anlatılan diseksiyon işlemini takiben, gözleme engel olabilecek gereksiz dokular çıkarılır ve daha detaylı görüntüler elde edilir.

Amaca bağlı olarak, kloral hidrat boyama, tüm çiçek tomurcuğu seviyesinde erken çiçek gelişimini, anterde mayoz bölünme ve mikro-gomedal oluşumunu, erken ovül gelişimini ve megaspor ana hücresinin spesifikasyonunu, dişi go-med-ified gelişimi ve hatta merkez ızgaranın polen tüpü istilasını karakterize etmek için kullanılabilir. Kombine Alexander boyaması ve Herr'in dört buçuk temizlemesi, polen düşüklerinin belirli bir lokül veya bir anter bütünü içinde değerlendirilmesini sağlar. Canlı polen taneleri kırmızı bir sitoplazma gösterirken, iptal edilenler boş bir sitoplazma gösterir ve sonunda düzensiz bir şekilde şekillendirilir ve tamamen ezilirler.

Eksinin çıkarılması, çekirdeklerin lekelenme yoğunluğunun artmasına ve kromatin organizasyonunun daha yüksek ayrıntılarına neden olur. Boyamadan önce SDS sodyum hidroksit temizliğinin kullanılması çiçeklenmeyi şeffaf hale getirdi. Ve çiçek dokularında daha yüksek kalloz lekelenmesine neden oldu.

Genellikle görülmesi zor olan kalloz birikimleri ortaya çıktı. Üretken hücreyi vejetatif hücreden ayıran Callose tabakası gibi. Polen taneleri hala anterin içinde bulunduğunda bile.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknikler uygun şekilde yapılırsa 48 saatten daha kısa sürede yapılabilir. Bu prosedürü denerken, sonuçların büyük ölçüde uygun fiksatifin kullanılması, diseksiyonun düzgün bir şekilde yapılması ve slayt üzerinde ilgilenilen dokunun izole edilmesi gibi iyi bir numune hazırlığına bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir.