Viral kapsid yapısal bütünlük belirlenmesi için alternatif Vitro yöntemleri

Bu yöntemlerin genel amacı, tedavinin insan norovirüs kapsidinin enfektifliği veya bütünlüğü üzerindeki etkileri hakkında daha fazla bilgi edinmektir. Bu yöntem, zarfsız viral inaktivasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, belirli bir tedavinin ardından viral kapsidin bir hücreyi enfekte etme yeteneğine ne olduğu gibi.

Bu yöntemlerin temel avantajı, herhangi bir tedavinin virüs üzerindeki etkisine dair ek mekanistik içgörüler sağlayabilmeleridir. Bu yöntem, insan norovirüsü inaktivasyon stratejilerine dair içgörüler sağlayabildiği gibi, rinovirüs veya hepatit A gibi diğer zarfsız virüslere de uygulanma potansiyeline sahiptir.

Başlamak için, kapsidlere monte edilmiş saflaştırılmış insan norovirüs majör kapsid proteinini 1X fosfat tamponlu salin içerisinde 50 micrograms per milliliter olacak şekilde seyreltin. Kapaklı bireysel PCR tüplerinde maksimum 15 microliters hacim kullanın.

Tüpte en az 600 nanogram kapsid olduğundan ve her bir işlem ligand kombinasyonu için 600 nanogram kapsid bulunduğundan emin olun. Ardından, termosikletörü istenen ısıtma işlemine göre önceden ısıtın. Daha sonra, hızlı soğutma için başka bir termosikletörü dört santigrat dereceye önceden ısıtın.

Kapsid çözeltisi içeren tüpleri istenen süre boyunca termosikletöre yerleştirin. Isıtma işleminin ardından tüpleri derhal beş dakika boyunca önceden soğutulmuş dört santigrat derece (°C) sikletöre aktarın. Tüm damlacıkların tüpün tabanına çökmesini sağlamak için tüpleri santrifüjde kısaca döndürün.

İşlemli kapsid çözeltilerini ve PBS'yi mililitre başına üç mikrogram olacak şekilde seyreltin. Seyreltilmiş işlemli kapsidden en az 200 mikrolitre olduğundan emin olun. Ardından, her bir kuyuya 100 mikrolitre kapsid çözeltisi ekleyin ve işlem başına en az iki kuyu olduğundan emin olun. Ek olarak, her ligand için 100 mikrolitre PBS içeren iki kontrol kuyusu ekleyin. Bu, analizin arka plan absorbansını sağlar. Buharlanmayı azaltmak için plakayı kapakla kapatın ve kenarlarını parafin filmle sızdırmaz hale getirin. Plakayı gece boyunca dört °C'de çalkalayıcı bir inkübatörde veya iki saat boyunca oda sıcaklığında bekletin.

İnkübasyonun ardından, işlem görmüş kapsid çözeltilerini plakadan çıkarın. Daha sonra, her kuyuya 200 microliters bloklama tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında iki saat boyunca veya sızdırmaz şekilde kapatılarak dört degrees Celsius'de gece boyunca inkübe edin.

Bu sırada, biyotinlenmiş aptameri nükleazsız suda bir mikromolar olacak şekilde seyreltin. Her bir işlem için toplamda 200 mikrolitre yeterli çözelti olduğundan emin olun.

Ayrıca, seçilen biotinylated HPGA'yı bloklama tamponu ile mililitrede 30 microliter olacak şekilde seyreltin. Tekrar, her işlem için toplam 200 microliter hacme yetecek kadar çözelti olduğundan emin olun.

İnkübasyonun ardından, bloklama tamponunu uzaklaştırın ve plakayı her kuyucuğa 200 µL PBST ekleyerek üç kez yıkayın. Kalan nemi kurulamak için plakayı steril kağıt havlular üzerine ters şekilde hafifçe bastırın. Daha sonra, her ısı işlemi ligand kombinasyonu için iki kuyucuk olduğundan emin olarak, kuyucuk başına 100 µL ligand bağlanma çözeltisi ekleyin ve kapalı plakayı oda sıcaklığında, orbital sarsıcının üzerinde yaklaşık 60 RPM hızda bir saat boyunca inkübe edin.

Metin protokolünde açıklandığı şekilde kuyucukları yıkadıktan sonra, her bir kuyucuğa PBS içinde 0,2 µg/mL streptavidin horseradish peroksidazdan 100 µL ekleyin.

Kuyucukları tekrar yıkamadan önce, orbital sarsıcıda hafif çalkalayarak oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Ardından, bir yıkama işleminin daha ardından, kuyucuk başına 100 microliters TMB substratı ekleyin ve rengin gelişmesi için beş ila 15 dakika bekleyin. Kuyucuklardaki renk değişimini gözlemleyin.

Tekrarlanan plakalar arasında geliştirme süresinin tutarlı olduğundan emin olun ve kullanılan plaka okuyucunun absorbans aralığını göz önünde bulundurun. Reaksiyon gelişimini, kuyucuk başına 100 µL bir molar fosforik asit ekleyerek durdurun. Plakayı derhal 450 nm'de okuyun.

Metin protokolünde detaylandırıldığı üzere, DLS cihaz yazılımında yeni bir boyut standart çalışma prosedürü oluşturun. Ardından, yazılım içindeki yeşil çalıştırma okuna tıklayın ve numuneye isim verin.

Isıl işlem görmüş virüs benzeri partikülleri veya VLP'leri, nihai konsantrasyon mililitre başına beş mikrogram olacak şekilde 1X PBS ile 1:10 oranında seyreltin. Ardından, toz partiküllerini uzaklaştırmak için örneği bir mikron gözenek boyutuna sahip filtreden geçirin. Büyük partiküller küçük partiküllere göre çok daha fazla ışık saçtığı için DLS toza karşı çok hassastır. Seyreltilmiş VLP'lerin 50 microliters miktarını küçük hacimli tek kullanımlık bir küvete aktarın. Küveti cihazın örnek haznesine yerleştirin. Ölçümü başlatın ve veri kalitesini değerlendirmek için korelogram kümülan uyumu (correlogram cumulant fit) ve uzman tavsiyesi (expert advice) sekmelerini kullanın. Ölçüm sırasında, kaliteli bir ölçümü temsil eden polydispersity indeks değerinin 0,3'ten küçük olduğunu kontrol edin.

Multiview sekmesinde, korelasyon katsayısının kısa sürede sabit ve bire yakın ancak birden fazla olmadığına ve daha sonraki bir sürede hızla sıfıra düştüğüne emin olun; bu durum partikül boyutunun karakteristik özelliğidir. Ölçümler sırasında veri kalitesi hakkında geri bildirim almak için uzman tavsiyeleri sekmesini kullanın. Ölçüm tamamlandıktan sonra, polydispersity indeks değerinin 0,3'ten düşük olduğunu tekrar kontrol edin.

Kümülant uyum sekmesinde, kümülant uyum çizgisinin veri noktalarını yakından takip ettiğinden emin olun. Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı şekilde, DLS cihaz yazılımında yeni bir boyut standart operasyon prosedürü oluşturun. Yazılım içindeki çalıştırma okuna tıklayarak yeni bir örnek açıp adlandırın ve cihazın sıcaklık dengesine ulaşmasını bekleyin.

VLP süspansiyonunu, kabarcık oluşumunu önlemek için küvetin duvarına yaslayarak ve yavaşça pipetleyerek küçük hacimli bir kuvars küvete aktarın. Cihaz sıcaklık dengesine ulaştıktan sonra küveti örnek haznesine yerleştirin. Örnek sıcaklığının dengelenmesi için 10 saniye bekledikten sonra ölçümü başlatın ve aynı anda bir zamanlayıcıyı çalıştırın.

İlk ölçümün sonunda zamanlayıcıyı durdurun. Bu süreyi ilk zaman noktası olarak belirleyin. Sonraki zaman noktalarını, yazılım tarafından kaydedilen ölçüm sürelerinden elde edin.

10 millimolar HEPES, pH 7.4 yerine PBS kullanarak ve işlem sonrası kapsidleri daha fazla seyreltmeyerek, daha önce olduğu gibi ısı işlemi gerçekleştirin. Ardından, işlem görmüş kapsid solüsyonunun 15 microliter'lık damlasının tamamını parafin filme pipetleyin. Izgarayı tutmak için cımbızla kenarından kavrayın ve ızgarayı, karbon yüzeyi aşağı gelecek şekilde işlem görmüş solüsyon damlasının üzerine yerleştirin.

Kapsidin grid'e tutunması için grid'i 10 dakika boyunca inkübe edin. Kapsid hazırlığının saflığına bağlı olarak, işlem görmüş kapsid damlasının ardına sıralı şekilde yerleştirilen 10 ila 15 µL'lik damlalar halinde HEPES solüsyonu ile yıkamalar ekleyin. 10 dakika sonra grid'i damla ile birlikte geri alın.

Damlacığı çekmek için ızgarayı bir parça filtre kağıdına neredeyse dik olacak şekilde yerleştirin. Ardından, 10 ila 15 µL HEPES tamponuyla oluşturulan damlacığı almak için ızgarayı kullanın ve 30 saniye boyunca bekletin. 30 saniyelik yıkama süresinin ardından, başka bir parça filtre kağıdıyla sıvıyı çekin.

Ardından, boş bir alandaki parafin filme yüzde iki'lik uranyl acetate çözeltisinden 15 µL'lik bir damla yerleştirin. Uranyl acetate damlasını ızgara ile alın ve 45 saniye boyunca tutun. Daha sonra, çözeltinin büyük bir kısmını uzaklaştırdığınızdan emin olarak uranyl acetate'i emdirerek temizleyin.

Izgarayı, cımbızdaki neme yapışmadığından emin olarak, karbon tarafı yukarı gelecek şekilde bir parça filtre kağıdı üzerine yerleştirin. Ardından, üzerinde ızgara bulunan filtre kağıdını açık bir cam petri kabına koyun. Bu işlemi tüm örneklemeler için tekrarladıktan sonra, ızgaraların bulunduğu petri kabı yarılarını, TEM ile gözlemlemeden önce kurutulmaları için gece boyunca bir desikatörde bekletin.

Aşağıdaki grafik, 68 °C'de işleme tabi tutulan insan norovirüs kapsidlerinin bağlanma yeteneğinin zamanla azalmasını göstermektedir. Görüldüğü üzere, HPGA bağlanması tamamen kaybolan ilk sinyaldir. Bu noktada, çözeltideki kapsidlerin büyük çoğunluğunun konak hücre HPGA'larına bağlanma yeteneğini kaybettiği ve dolayısıyla hücre içine giremeyeceği varsayılır.

Aptamer bağlanması HBGA'nınkini yansıtsa da, sinyali gidermek için biraz daha fazla ısı işlemi gereklidir. Burada, kaliteli verileri temsil eden bir DLS korelasyon katsayısı eğrisi gösterilmiştir. Sıfıra yakın zamanlarda, korelogram bire yakın ancak birin altında bir değerde sabittir.

Ardından, parçacık boyutuna özgü bir zamanda hızla sıfıra iner. Bu deneyden elde edilen boyut sonuçlarına muhtemelen güvenilebilir. Aksine, bu korelasyon katsayısı eğrisi düşük kaliteli verileri temsil etmektedir.

Korrelogram bir değerin üzerinden başlayıp kademeli olarak sıfıra düşmektedir. Bu deneyden elde edilen sonuçlar kullanılmamalıdır. Burada, partikül boyutu verileri, 68 °C'de işlem gören kapsidler için net bir agregasyon profili göstermekte ve yaklaşık 20 dakika sonra süper agregatlar oluşmaktadır.

Süper agregasyonun gerçekleştiği zaman, VLP'lerin söz konusu işleme karşı duyarlılığının karakteristik bir göstergesidir. Bu şekil, insan norovirüs kapsidlerinin ısıtma işlemiyle ilgili TEM sonuçlarını görselleştirmektedir. Burada kapsidler, soldan sağa doğru 60 ila 80 °C arasında işleme tabi tutulmuştur.

Görüldüğü üzere, kapsidlerin kümelenmesi ve denatüre olmasıyla birlikte kapsid morfolojisi işlemle birlikte belirgin şekilde değişmektedir. Benzer bir fenomen, 68 °C'de 0 ila 25 dakika boyunca işlem gören kapsidler için de kaydedilmiştir.

Bu tekniklerde uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandıkları takdirde işlemler 1 ila 24 saat içinde tamamlanabilir.

Geliştirilmesinin ardından bu teknik, gıda virolojisi alanındaki araştırmacıların insan norovirüslerinin kapsidleri üzerindeki inaktivasyon mekanizmalarını ve etkilerini incelemeleri için ek bir yol sağlamıştır. Bu prosedürü takiben, belirli bir işlem sonrası viral azalmaya dair daha kapsamlı bir genel görünüm elde etmek için RNaz ön işlemi olan ve olmayan gerçek zamanlı RT-PCR, viral kapsidlerin SDS-PAGE analizi ve kültüre edilebilir sürgat virüslerle plak sayım yöntemleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra; inaktivasyon işleminin insan norovirüs kapsidi üzerindeki etkilerine dair daha fazla mekanistik bilgi edinmek için ligand bağlanması, dinamik ışık saçılması ve transmisyon elektron mikroskopisinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

Kullanılan bazı reaktiflerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken kişisel koruyucu ekipman kullanımı ve laboratuvar güvenlik standartlarına uyum gibi önlemler her zaman alınmalıdır.