Viral kapsid yapısal bütünlük belirlenmesi için alternatif Vitro yöntemleri

Bu yöntemlerin genel amacı, bir tedavinin insan norovirüs kapsidinin enfektivitesi veya bütünlüğü üzerindeki etkileri hakkında daha fazla bilgi edinmektir. Bu yöntem, zarfsız viral inaktivasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Viral kapsidin belirli bir tedaviden sonra bir hücreyi enfekte etme yeteneğine ne olduğu gibi.

Bu yöntemlerin temel avantajı, herhangi bir tedavinin virüs üzerindeki etkisine dair ek mekanik bilgiler sağlayabilmeleridir. Bu yöntem, insan norovirüs inaktivasyon stratejileri hakkında bilgi sağlayabilse de, aynı zamanda rinovirüs veya hepatit gibi diğer zarfsız virüslere uygulanma potansiyeline de sahiptir A.To, saflaştırılmış insan norovirüs majör kapsid proteinini seyreltir, kapsidlerde mililitre başına 50 mikrograma kadar birleştirilir, 1X fosfat tamponlu salin içinde. Ayrı kapaklı PCR tüplerinde maksimum 15 mikrolitre hacim kullanın.

Tüpün en az 600 nanogram kapsid içerdiğinden ve tedavi ligandı kombinasyonu başına 600 nanogram kapsid olduğundan emin olun. Ardından, termodöngüleyiciyi istenen ısıl işleme kadar önceden ısıtın. Ardından, hemen soğutma için ek bir termodöngüleyiciyi dört santigrat dereceye kadar önceden ısıtın.

Kapsid çözeltisi içeren tüpleri istenen süre boyunca termosiklorere ekleyin. Isıttıktan sonra, tüpleri hemen beş dakika boyunca önceden soğutulmuş dört santigrat derece döngüleyiciye aktarın. Tüm damlacıkları tüpün dibine almak için santrifüjdeki tüpleri kısaca aşağı doğru döndürün.

Muamele edilen kapsid çözeltilerini ve PBS'yi mililitre başına üç mikrograma seyreltin. En az 200 mikrolitre seyreltilmiş işlenmiş kapsid olduğundan emin olun. Daha sonra, her kuyucuğa 100 mikrolitre kapsid çözeltisi uygulayın, tedavi başına en az iki kuyu olduğundan emin olun.

Ek olarak, her ligand için 100 mikrolitre PBS içeren iki kontrol kuyusu ekleyin. Bu, tahlilin arka plan emilimini sağlar. Plakayı bir kapakla örtün ve buharlaşmayı azaltmak için kenarları parafin film ile kapatın.

Plakayı gece boyunca dört santigrat derecede veya oda sıcaklığında iki saat boyunca çalkalanan bir inkübatörde bırakın. İnkübasyondan sonra, muamele edilmiş kapsid çözeltilerini plakadan çıkarın. Ardından, blokaj tamponu kuyusu başına 200 mikrolitre ekleyin.

Oda sıcaklığında iki saat inkübe edin veya gece boyunca dört santigrat derecede kapatın. Bu arada, biyotinile aptameri nükleaz içermeyen suda bir mikromolar ile seyreltin. Her tedavi için toplam 200 mikrolitre için yeterli çözelti olduğundan emin olun.

Ayrıca, seçilen biyotinile HPGA'yı bloke edici tamponda mililitre başına 30 mikrolitreye seyreltin. Yine, her tedavi için toplam 200 mikrolitre hacim için yeterli çözelti olduğundan emin olun. İnkübasyondan sonra, bloke edici tamponu çıkarın ve plakayı PBST oyuğu başına 200 mikrolitre ile üç kez yıkayın.

Kalan nemi kurutmak için plakayı steril kağıt havluların üzerine baş aşağı vurun. Daha sonra, ısıl işlem ligand kombinasyonu başına iki kuyucuk olmasını sağlayan ligand bağlama çözeltilerinin oyuğu başına 100 mikrolitrede, kapalı plakayı oda sıcaklığında bir saat boyunca yaklaşık 60 RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Kuyuları yıkadıktan sonra, metin protokolünde tarif edildiği gibi, kuyu başına 100 mikrolitre, mililitre başına 0.2 mikrogram, streptavidin, yaban turpu, peroksidaz ve PBS ekleyin.

Kuyucukları tekrar yıkamadan önce bir orbital çalkalayıcı üzerinde hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, başka bir yıkamadan sonra, TMB substratının oyuğu başına 100 mikrolitre ekleyin ve rengin beş ila 15 dakika boyunca gelişmesine izin verin. Kuyuları renk açısından gözlemleyin.

Replikasyon plakaları arasında aynı süre için tutarlı bir şekilde geliştirme yaptığınızdan emin olun ve kullanılan plaka okuyucunun emme aralığının farkında olun. Bir molar fosforik asidin kuyusu başına 100 mikrolitre ile reaksiyonun gelişimini durdurun. Plakayı hemen 450 nanometrede okuyun.

Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi DLS cihaz yazılımında yeni bir boyut standardı çalıştırma prosedürü oluşturun. Ardından, yazılımın içindeki yeşil çalıştırma okunu seçin ve örneği adlandırın. Isıl işlem görmüş virüs benzeri parçacıkları veya VLP'leri, mililitre başına beş mikrogramlık nihai konsantrasyon için 1X PBS'de bir ila 10 oranında seyreltin.

Ardından, toz parçacıklarını gidermek için numuneyi bir mikron gözenek boyutuyla filtreleyin. DLS toza karşı çok hassastır, çünkü büyük parçacıklar küçük parçacıklardan çok daha fazla ışık saçar. Seyreltilmiş VLP'lerin 50 mikrolitresini küçük hacimli tek kullanımlık bir küvete aktarın.

Küveti s'ye yerleştirinampcihazın haznesi. Çalıştırmayı başlatın ve veri kalitesini değerlendirmek için korelogram, kümülant uyum ve uzman tavsiyesi sekmelerini kullanın. Çalışma sırasında, indeks değerinin poli dağılımının bir kalite ölçümünü temsil eden 0,3'ten küçük olduğunu kontrol edin.

Çoklu görüntüleme sekmesinde, korelasyon katsayısının sabit olduğundan ve kısa bir süre içinde bire yakın ancak birden fazla olmadığından ve parçacık boyutunun özelliği olarak daha sonra sıfıra keskin bir şekilde düştüğünden emin olun. Ölçümler sırasında veri kalitesi hakkında geri bildirim almak için uzman tavsiyesi sekmesini kullanın. Ölçüm tamamlandıktan sonra, indeks değerinin poli dağılımının 0,3'ten küçük olduğunu tekrar kontrol edin.

Kümülatif sığdırma çizgisinin, kümülatif sığdırma sekmesindeki veri noktalarını yakından takip ettiğinden emin olun. Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi DLS cihaz yazılımında yeni bir boyut standardı çalıştırma prosedürü oluşturun. Yeni bir örnek açmak ve adlandırmak ve cihazın sıcaklık dengesine ulaşmasına izin vermek için yazılım içindeki çalıştırma okunu seçin.

VLP süspansiyonunu küçük hacimli bir kuvars küvete aktarın, kabarcıkları önleyin ve küvetin duvarına yavaşça pipetleyin. Cihaz sıcaklık dengesine ulaştıktan sonra, küveti numune haznesine yerleştirin. Numune sıcaklığının dengelenmesi için 10 saniye bekledikten sonra, çalıştırmayı başlatın ve aynı anda bir zamanlayıcı başlatın.

İlk ölçümün sonunda zamanlayıcıyı durdurun. Bu zamanı ilk zaman noktası olarak alın. Yazılım tarafından kaydedilen ölçüm sürelerinden sonraki zaman noktalarını elde edin.

10 milimolar yığınlar, pH 7.4 için PBS yerine daha önce olduğu gibi ısıl işlem yapın ve işlemden sonra kapsidleri daha fazla seyreltmeyin. Daha sonra, 15 mikrolitrelik işlenmiş kapsid çözeltisinin tamamını parafin film üzerine pipetleyin. Izgara kenarını cımbızla tutun, ızgarayı tutmak için kenarda kapanmalarına izin verin ve ızgara karbon tarafını aşağı bakacak şekilde işlenmiş çözelti damlasının üzerine yerleştirin.

Kapsidin ızgaraya yapışmasını sağlamak için ızgaranın 10 dakika inkübe edilmesine izin verin. Kapsid preparatının saflığına bağlı olarak, muamele edilen kapsid damlacıkından sonra sıraya yerleştirilmiş 10 ila 15 mikrolitrelik damlacıklar şeklinde yığın çözeltisinin yıkamalarını ekleyin. 10 dakika sonra, damlacık ile ızgarayı alın.

Damlacığı uzaklaştırmak için ızgarayı bir filtre kağıdına neredeyse dik olarak yerleştirin. Ardından, 10 ila 15 mikrolitrelik yığın tamponunun damlacığını almak için ızgarayı kullanın ve 30 saniye basılı tutun. 30 saniyelik yıkama süresinden sonra başka bir filtre kağıdı ile fitili temizleyin.

Daha sonra, boş bir alana parafin filminin üzerine 15 mikrolitrelik bir damla yüzde iki uranil asetat çözeltisi yerleştirin. Uranil asetat damlasını ızgara ile alın ve 45 saniye basılı tutun. Ardından, çözeltinin çoğunu çıkardığınızdan emin olarak uranil asetatı fitilleyin.

Izgarayı karbon tarafı yukarı bakacak şekilde bir filtre kağıdının üzerine yerleştirin ve ızgaranın cımbızdaki neme yapışmamasına dikkat edin. Ardından, filtre kağıdını ızgara ile birlikte açık bir cam petri kabına yerleştirin. Bu işlemi tüm tedaviler için tekrarladıktan sonra, TEM ile gözlemlemeden önce petri kabının yarımlarını ızgaralarla birlikte gece boyunca kuruması için bir desikatöre yerleştirin.

Aşağıdaki grafik, 68 santigrat derecede tedavi edildiğinde insan norovirüs kapsidlerinin bağlanma yeteneğinin zamanla azaldığını göstermektedir. Görüldüğü gibi, HPGA bağlanması tamamen ortadan kalkan ilk sinyaldir. Bu noktada, çözeltideki kapsidlerin büyük çoğunluğunun konak hücre HPGA'larına bağlanma yeteneğini kaybettiği ve bu nedenle hücre içine içselleştirilemediği varsayılmaktadır.

Aptamer bağlayıcı HBGA'nınkini yansıtır, ancak sinyali çıkarmak için biraz daha fazla ısıl işlem gerekir. Burada, iyi kalitede verileri temsil eden bir DLS korelasyon katsayısı eğrisi gösterilmektedir. Sıfıra yakın bir zamanda, korelogram bire yakın ancak birin altında bir değerde sabittir.

Daha sonra, parçacık boyutunun karakteristik bir zamanında keskin bir şekilde sıfıra düşer. Bu deneyden elde edilen boyut sonuçlarına büyük olasılıkla güvenilebilir. Tersine, bu korelasyon katsayısı eğrisi düşük kaliteli verileri temsil eder.

Korelogram birin üzerinde bir değerde başlar ve yavaş yavaş sıfıra düşer. Bu deneyden elde edilen sonuçlar kullanılmamalıdır. Burada, partikül boyutu verileri, yaklaşık 20 dakika sonra oluşan süper agregalarla 68 santigrat derecede muamele edilen kapsidler için net bir agregasyon profili göstermektedir.

Süper agregasyonun meydana geldiği zaman, VLP'lerin bu tedaviye duyarlılığının karakteristiğidir. Bu şekil, insan norovirüs kapsidlerinin ısıl işlemi için TEM sonuçlarını görselleştirir. Burada, kapsidler soldan sağa 60 ila 80 santigrat derecede tedavi ediliyordu.

Görülebileceği gibi, kapsid morfolojisi, kapsidler toplandıkça ve denatüre olarak tedavi ile açıkça değişir. Benzer bir fenomen, sıfır ila 25 dakika boyunca 68 santigrat derecede tedavi edilen kapsidler için de not edilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknikler uygun şekilde uygulanırsa bir ila 24 saat içinde yapılabilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, gıda virolojisi alanındaki araştırmacılara, inaktivasyonun insan norovirüslerinin kapsidi üzerindeki mekanizmalarını ve etkilerini araştırmaları için ek bir yol sağladı. Bu prosedürü takiben, belirli bir tedaviden sonra viral azalmanın daha eksiksiz bir genel görünümünü elde etmek için RNaz ön tedavisi olan ve olmayan gerçek zamanlı RT-PCR, viral kapsidlerin STS sayfası ve ekilebilir vekil virüslerle plak tahlilleri gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, inaktivasyon tedavisinin insan norovirüs kapsidi üzerindeki etkileri hakkında daha fazla mekanik bilgi edinmek için ligand bağlama, dinamik ışık saçılımı ve transmisyon elektron mikroskobunun nasıl kullanılacağını iyi anlamalısınız.

Kullanılan bazı reaktiflerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken kişisel koruyucu ekipman giymek ve en iyi laboratuvar güvenliği uygulamalarını takip etmek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.