Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

Bu yöntemin genel amacı, kalp organogenezi sırasında kardiyak progenitör hücre lokalizasyonunu ve dağılımını kantitatif olarak değerlendirmektir. Bu yöntem, normal embriyonik gelişim sırasında kardiyak progenitör popülasyonların lokalizasyonunu gözlemlememize izin vererek kalp gelişimi alanındaki anahtar cevapları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, hacimsel görüntülerin doku seviyesi dinamikleri hakkında nicel bilgi verebilmesi ve analiz hattının daha iyi tekrarlanabilirlik için otomatikleştirilebilmesidir.

Bu yöntem erken kardiyak organogenez hakkında bilgi sağlasa da, erken embriyogenezin genel çalışmasına veya ilgilenilen diğer organların morfogenezine de uygulanabilir. Embriyonik sekizinci günün sabahında, hamile fare karnını% 70 etanol ile dezenfekte edin ve hem cilt hem de vücut duvarından abdominal bir kesi yapın. Bir yumurta kanalının üstünden başlayarak, uterusun yan tarafındaki yağı rahim ağzına kadar dikkatlice inceleyin.

Rahim ağzından bir kesi yapın ve tüm uterusu serbest bırakmak için diğer yumurta kanalı kesiminin üst ucuna devam edin. Rahimdeki fazla kanı taze PBS içeren 10 santimetrelik bir tabakta yıkayın ve mezometriyumu her desiduom arasında kesin. Embriyoları diseksiyon mikroskobu altında taze PBS içeren altı santimetrelik bir tabağa aktarın ve uterus dokusunu yaprak döken dokudan çıkarmak için beş numaralı ince forseps kullanın.

Daha sonra, embriyoları ortaya çıkarmak için desiduomun embriyonik yarısının ucunu dikkatlice dilimleyin, ilk embriyoyu dikkatlice itmek ve çıkarmak için desiduomu sıkıştırın. Hayvanın morfolojisine zarar vermeden mümkün olduğunca fazla embriyonik dokuyu inceleyin ve embriyoyu buz üzerinde taze PBS içeren 1.5 mililitrelik bir tüpe yerleştirmek için bir transfer pipeti kullanın. Tüm embriyolar toplandıktan sonra, PBS'yi her tüpten aspire edin ve embriyoları taze PBS ile durulayın.

PBS'yi her tüpten iyice aspire ettikten sonra, embriyoları oda sıcaklığında bir saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin, ardından taze PBS ile üç yıkama yapın, ardından embriyoları dört santigrat derecede saklayın. Oda sıcaklığında dört saatlik bir inkübasyon için PBS'yi bir mililitre engelleme tamponu ile değiştirerek başlayın. İnkübasyonun sonunda, dört santigrat derecede bir gece inkübasyon için bloke edici tamponu uygun birincil antikor karışımı ve seyreltilmiş bloke edici tampon ile değiştirin.

Ertesi sabah, fazla antikoru aspire edin ve embriyoları PBS'de% 0.1 Triton'da yıkama başına bir saat boyunca üç kez yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, oda sıcaklığında üç saatlik bir inkübasyon için embriyolara uygun ikincil antikor karışımını ekleyin, ardından gösterildiği gibi üç yıkama yapın. Daha sonra, embriyoları PBS'de DAPI ile 10 dakika boyunca lekeleyin, ardından iki beş dakikalık yıkama yapın, daha sonra embriyoları solmaya karşı montaj ortamında yavaşça askıya alın ve embriyoların en az bir saat boyunca periyodik olarak hafifçe vurarak dengelenmesine izin verin

Embriyoları monte etmeden önce, embriyo başına bir mikroskop lamı üzerinde 15 ila 20 milimetre aralıklarla beş ila altı kat çift çubuklu banttan oluşan iki paralel yığın yapın ve bant yığınları arasındaki her slaydın üzerine 15 mikrolitrelik bir solma önleyici ortam damlası yerleştirin. Her damlaya dikkatlice bir embriyo aktarın ve embriyoları ön tarafları slayttan uzağa bakacak şekilde ve vücut eksenleri slaytların uzun ekseni ile aynı hizada olacak şekilde konumlandırmak için bir diseksiyon mikroskobu ve ince forseps kullanın. Lamelleri yerleştirmek için, önce camın bir tarafını bir çift yapışkanlı bant yığınının üzerine koyun ve lameli diğer bant yığınına temas edene kadar nazikçe indirmek için forseps kullanın.

Embriyoları dikkatli bir şekilde konumlandırmak ve monte etmek özellikle önemlidir. Doğru konumlandırılmamış embriyoların görüntülenmesi çok daha zor olacaktır ve iyi ölçülebilir veriler elde etmek için ek işlemler gerektirebilir. Görüntüleme sırasında numunenin kurumasını önlemek için lamel ile lamel arasına ek solma önleyici ortam eklemek için bir pipet kullanın ve tüm kardiyak hilal bölgesinin tek bir görüş alanında yakalanmasını sağlayan mevcut en yüksek büyütme hedefini seçin.

Daha sonra standart en iyi görüntüleme uygulamalarını kullanarak görüntüleme parametrelerini ayarlayın ve her embriyonun XYZ voksel boyutlarını belirlemek için Nyquist örnekleme oranlarını kullanın. Embriyo görüntülerini analiz etmek için, ham görüntü veri setlerini uygun görüntü analiz yazılımına yükleyin ve ilk dosyayı üst üste görünümünde açın. Veriler, maksimum yoğunluk projeksiyon modunda bir 3D görünümde yüklenecektir.

Ekran ayarlama penceresini açın ve yalnızca referans kanalını seçin. Görüntünün eşiğini gerektiği gibi ayarlayın. Sinyal-gürültü oranı segmentasyon için çok düşükse, gamayı ayarlayın.

Görüntü alımı sırasında en iyi uygulamaları takip etmek, uygun verileri elde etmek için kritik öneme sahiptir ve kullanılan özel mikroskopi kurulumuna bağlı olacaktır. Gama'da ayarlamalar yapılması gerekiyorsa, bu görüntüler floresan yoğunluklarını karşılaştırmak için kullanılmamalıdır. Referans kanalı için yeni bir yüzey oluşturmak üzere yüzey algoritması iletişim kutusunu kullanın ve yalnızca ilgilenilen parçanın kaynağı kutusunu işaretleyin.

Sınırlayıcı kutu bölgesini, referans boyası tarafından çizilen ilgi bölgesini içerecek şekilde ayarlayın ve kaynak kanal açılır menüsünden referans kanalını seçin. Yumuşatmayı Z voksel boyutunun yarısına ayarlayın ve yüzeyin kanal sinyalinin ötesine taşmamasını sağlamak için alt sınırı mutlak yoğunluğuna ayarlamak için eşik kaydırıcılarını kullanın. Nesneleri voksel sayısına veya hacme göre filtreleyin, algoritmanın oluşturmuş olabileceği arka plan nesnelerini reddedin ve algoritmayı tamamlayın.

Ardından, yeni oluşturulan yüzeyi seçin ve düzenleme penceresinden maske seti işlevini seçin. Maskeyi uygulamadan önce yinelenen kanal onay kutusunun seçili olduğundan emin olarak ilgilenilen deneysel kanalı seçin ve maske kanalını yalnızca ekran ayarlama penceresinde seçin. Ardından, az önce gösterildiği gibi yeni bir yüzey oluşturun.

Her yüzey seçiliyken hacimsel verileri elde etmek için, istatistikler sekmesindeki ayrıntı alt sekmesini açın ve açılır menüden ortalama değerleri seçin. Yüzeyin toplam hacmi, oluşturulan tablonun toplam sütununda bulunacaktır. Burada, az önce gösterildiği gibi bir anti-kardiyak hilal antikoru ile işaretlenmiş GFP pozitif ventriküler kardiyovasküler progenitör hücrelere sahip bir embriyonik gün 8.25 fare embriyosu gösterilmektedir.

Lekeli doku için referans kanalı seçildikten sonra, yüzey oluşturma algoritmasına başlamadan önce yoğunluk ve gama ayarlanır. İlgilenilen bölge seçilir ve yüzey detay seviyesi seçilir. İlk yüzey, yüzeydeki tüm gerçek sinyalleri içerecek şekilde eşiklenmiştir.

Daha sonra, nihai bir referans yüzeyi elde etmek için küçük arka plan parçalarını çıkarmak için filtreleme gerçekleştirilir. Referans yüzeyi seçilerek, karşılaştırma kanalı çoğaltılabilir ve maskelenebilir. Bu kanalın yoğunluğu ve gama, aynı adım dizisi boyunca ikinci bir yüzey oluşturulmadan önce ayarlanır.

Her yüzey için toplam hacim daha sonra otomatik olarak hesaplanır ve hem nicel hem de görsel olarak karşılaştırılabilir. Bu prosedürü denerken, diseke edilen embriyoların kalitesinin, antikor verimliliğinin, montaj oryantasyonunun ve görüntüleme kurulumunun hepsinin nihai verilerin kalitesini etkilediğini hatırlamak önemlidir. Bu nicel analiz hattına ek olarak, ek nitel veriler elde etmek için dekonvolüsyon gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknoloji, kardiyak gelişimdeki araştırmacıların erken embriyogenez sırasında yeni kardiyak progenitör popülasyonlarının dinamiklerini keşfetmelerinin yolunu açtı.