Name: Seminifer tübül Squash tekniği fare modeli kullanarak sperma saytolojik analizi için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Öğrenin fare modelinde seminifer tübül squash tekniği ile spermatositlerin sitolojik analizini. Bu yöntem, erkek üreme biyolojisinde hücre bütünlüğünü koruyarak mayoz bölünme ve spermatogenez süreçlerini incelemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser NIGMS (R01GM11755) için P.W.J. ve S.R.W. ve J.H. eğitim grant bursu üzerinden Ulusal Kanser Enstitüsü (NIH) (CA009110) tarafından desteklenmiştir

Fare kullanımı kurumsal hayvan bakım ve kullanmak Komitesi, Johns Hopkins Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Deneyler gerçekleştirilen çocuk (20-26 gün post-partum, dpp) C57BL/6J fareler, sperma yarı zaman uyumlu ilk nesil yararlanarak. Ancak, bu teknik aynı zamanda yetişkin fare kullanılarak gerçekleştirilebilir.
1. diseksiyon ve fare seminifer tübüllerin yalıtım
<ol><li>Tablo 1 ve Tablo 2' de anlatıldığı düzeltme/lizis çözüm ve antikor seyreltme arabellek (ADB) hazırlayın.</li>
	<li>Bir 35-mm Petri kabına 1 fosfat tamponlu tuz (1 x PBS, pH 7,4) x 3 mL ile ve 2 mL fare başına düzeltme/lizis çözeltisi ile başka bir 35 mm yemek hazırlamak.</li>
	<li>Fareyi servikal yerinden çıkması veya CO2 Havasızlıktan Boğulma yoluyla kurban ve ventral karın % 70 etanol ile sprey. V şeklinde bir açılış yapmak steril makas kullanarak abdominopelvic boşluğu açın. Sonra testis forseps kullanarak epididimal yağ yastığı çekerek çıkarın ve tunica albuginearahatsız edici kaçının. Testis bir 35 mm 1 x PBS içeren kabında yerleştirin. Not: Sperma ilk dalga faiz14zenginleştirilmiş hücre nüfusu gözlemlemek amacıyla kullanmaktadır. Sperma belirli aşamalarında farklı fare yaş (Tablo 3) zenginleştirilmiş.</li>
	<li>Testis tunica albuginea keskin uçlu Forseps ile doku delinme tarafından kaldırmak ve gevşek seminifer tübüllerin toplamak. Tübüllerin 2 mL düzeltme/lizis çözeltisi içeren yeni 35-mm Petri kabına için transfer.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5 min için düzeltme/lizis çözümde tübüllerin kuluçkaya.</li>
</ol>2. seminifer tübüllerin hazırlanması
<ol><li>Poli-L-lizin kaplamalı cam slayt slayt kenarlarını sıvı engelleyici kalemle özetleyen tarafından hazırlayın.</li>
	<li>Düzeltme/lizis çözeltinin 100 µL cam slayt merkezi için geçerlidir.</li>
	<li>Steril forseps kullanarak ve makas yavaşça alay ayrı seminifer tübüllerin. Uzun bireysel tübül kesmek yaklaşık 20 mm boylarda kesim. Not: Centrosomes gibi uzun süre sabitleştirici maruz duyarlıdır yapıları görselleştirmek, tübüllerin ilk 1 x PBS ayrı sonra doğrudan yüzeyinde tübüllerin bin dereden su getirmek için düzeltme-lysis çözüm 100 µL içinde Poli-lizin slaytlar kaplı.</li>
	<li>Beş 20 mm uzun seminifer tübül segmentleri düzeltme/lizis solüsyon içeren hazır Poli-L-lizin kaplamalı cam slayt aktarın.</li>
	<li>Steril makas kıyma seminifer tübüllerin 1,5-3,0 mm kesimleri içine kullanarak.</li>
	<li>Kullanarak steril forseps böylece hiçbir doku ile çakışıyor, cam slayt tübül kesimlerinde düzenlemek ve tübüllerin eşit olarak dağıtılır. Not: Bir cam slayt tübül kesimlerinde en uygun sayısı 20 ve 40 arasında olduğunu.</li>
</ol>3. ezici, seminifer tübüllerin
<ol><li>Dağınık seminifer tübül kesimleri üzerine bir benchtop içeren cam slayt aktarın. Aşırı sıvı doku squash adımı sırasında kaybetmemek için laboratuvar mendil kullanarak kaldırın.</li>
	<li>Cam slayt üzerine bir coverslip (22 x 60-1.5 mm) uygulamak ve 10-20 saniye için palmiye topuk ile basınç uygulayın. Spermatocytes seminifer tübüllerin dağıtmak için yeterli kuvvet uygulamak önemlidir. Not: Böylece tüm tübül kesimleri kesintiye squashing adım optimize etmek için bir diseksiyon mikroskop kullanarak tübüllerin gözlemlemek.</li>
	<li>Slayt forseps kullanarak, hemen flaş dondurma cam slayt sıvı N2 küçük bir dewar içinde 15 saniye veya sıvı kabarcık kesildiğinde kadar. Düz kenarlı jilet ile coverslip immunolabeling hemen, kaldırırsanız, ipucu forseps veya 21'lik iğne iyi. Not: En iyi sonuçlar, immunolabel için hemen slaytlar (bkz. Adım 4). Ancak, bu noktada slaytlar-80 ° C'de iki haftaya kadar korunabilir. Proteinler ve hücresel yapılar ömrünü en üst düzeye çıkarmak için hemen kuru buz veya-80 ° C dondurucu transfer slaytları depolamanızı ve coverslip slayt üzerinde tutun. İmmunolabeling slaytlar saklandığında, coverslip 15 saniye boyunca sıvı N2 slaytları çeker tarafından 3.3 adımda anlatıldığı gibi kaldırın.</li>
</ol>4. Immunolabeling bağlı seminifer tübüllerin
<ol><li>Slayt 1 x PBS ve yıkama üç kez 50 mL Coplin kavanoza 1 x PBS içeren 5 min için bırakın. Not: Slaytlara asla izin immunolabeling sırasında tamamen kuru.</li>
	<li>Antikor seyreltme arabelleği için 1-2 h oksijen odasında engellemek için cam slayt üzerine 1 mL uygulanır.</li>
	<li>Antikor seyreltme arabellek kaldırmak ve birincil antikor antikor seyreltme arabellekte bir oksijen odası içinde seyreltilmiş 100 µL uygulayın. Not: En iyi sonuçlar için birincil antikorlar gecede 4 ° C'de kuluçkaya Antikor (örneğin 50 µL) daha küçük hacimli bir coverslip veya parafilm içeren slaydı kapsayan tarafından kullanın. Doğrulamak ve birincil antikorlar15en iyi duruma getirme.</li>
	<li>Üç kez 5 min için slaytlar 1 x PBS içeren bir 50 mL Coplin kavanoza durulayın. Not: Yıkar geliştirmek için bir küçük manyetik heyecan çubuğunu kullanarak Coplin kavanoz kışkırtmak ve düşük hızda bir manyetik heyecan tabakta yerleştirin veya düşük hızda masa üstü bir mikser Coplin kavanoz yerleştirin.</li>
	<li>İkincil antikor antikor seyreltme arabelleği için 1-1.5 saat oda sıcaklığında bir oksijen odasında seyreltilmiş 100 µL uygulanır. Fotoğraf Birleşik fluorophore antikorlar ağartma önlemek için koyu bir kutu içindeki slaytları kuluçkaya. Not: Antikor (örneğin 50 µL) daha küçük hacimli bir coverslip veya parafilm içeren slaydı kapsayan tarafından kullanın.</li>
	<li>İki kez 5 min için slaytlar 1 x PBS içeren bir 50 mL Coplin kavanoza durulayın.</li>
	<li>Montaj orta (DAPI, 1,5 µg/mL) 4', 6-diamidino-2-phenylindole içeren slayt monte ve coverslips (22 x 60-1.5 mm) uygulayın.</li>
	<li>Coverslips açık oje slaytları korumak ve coverslips taşınmasını engelleme içeren slaytlara kapatın.</li>
</ol>5. analiz ve görüntüleme tübül squash hazırlıkları
<ol><li>Kesin z ekseni hareketi ve görüntü yakalamak için yüksek çözünürlüklü bir kamera sağlar otomatik sahne ile bir epifluorescence mikroskobu kullanın. Alternatif olarak, lazer confocal mikroskop kullanın. Not: Herhangi bir kullanılabilir donanım ve yazılım için bu adımı kullanın. Örneğin, şekil 1 ve Şekil 2 görüntülenen görüntüleri kullanarak bir hücre gözlemci bir ORCA-Flash 4.0 CMOS kamera bağlı ve Zeiss ZEN 2012 mavi edition görüntü yazılım ile analiz Zeiss Z1 ele geçirildi.</li>
	<li>Squash hazırlık kalitesini belirlemek için bir 20 X hedefi kullanarak slaytları değerlendirmek. Kaliteli slaytların eşit şekilde dağıtılır çekirdeği monolayer olacaktır. Not: Bazı bölümler slaydın diğerlerinden daha iyi olabilir, daha yüksek büyütme kullanarak daha ayrıntılı bir çözümleme için slayt en iyi bölgelerinde bulunabileceği koordinatları Not yararlıdır.</li>
	<li>Yüksek büyütme objektif (örneğin 63 X veya 100 X), çekirdek tutarlı bir monolayer var yakalama bölgeleri slayt kullanarak. Bir bölge seçtikten sonra üst ayarla ve tüm odak ışık yakalanır emin olmak için Z-yığınları daha düşük. Not: Z-yığınlar alt ve üst sınırı arasında yakalanan en uygun sayısı genellikle görüntü alma yazılımı tarafından atanır ve her amaç için farklı değil.</li>
	<li>Genişletilmiş derinlik odak resim derlemek için görüntü işleme yazılımı kullanın. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı her Z-yığın, odakta ışıktan birleştirir ve tübül squash hazırlıklar en iyi görüntüleme için esastır.</li>
</ol>

<ol><li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aneuploidy%3A+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li>
<li>Morelli, M. A., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+all+germ+cells+are+created+equal%3A+Aspects+of+sexual+dimorphism+in+mammalian+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Not all germ cells are created equal: Aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis.</a> Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).</li>
<li>Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+meiotic+prophase+I+to+metaphase+I+transition+in+mouse+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Regulation of the meiotic prophase I to metaphase I transition in mouse spermatocytes.</a> Chromosoma. 117 (5), 471-485 (2008).</li>
<li>Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slide+preparation+method+to+preserve+three-dimensional+chromatin+architecture+of+testicular+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells.</a> J Vis Exp. (83), e50819(2014).</li>
<li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li>
<li>Galdon, G., Atala, A., Sadri-Ardekani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+spermatogenesis%3A+how+far+from+clinical+application%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Urol+Rep%22%5BJournal%5D)">In vitro spermatogenesis: how far from clinical application?</a> Curr Urol Rep. 17 (7), (2016).</li>
<li>Staub, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+research+on+mammalian+male+germ+cell+meiotic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro.</a> J Androl. 22 (6), 911-926 (2001).</li>
<li>Page, J., Suja, J. A., Santos, J. L., Rufas, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Squash+procedure+for+protein+immunolocalization+in+meiotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells.</a> Chromosome Res. 6 (8), 639-642 (1998).</li>
<li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li>
<li>Xu, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+cryosection+method+for+mouse+testis+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">A modified cryosection method for mouse testis tissue.</a> Tissue Cell. 33 (2), 208-210 (2001).</li>
<li>Hess, R., Moore, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+methods+for+evaluation+of+the+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Histological methods for evaluation of the testis.</a> Methods Toxicol. 3 (Pt A), 52-85 (1993).</li>
<li>Bellvé, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+culture%2C+and+fractionation+of+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li>
<li>Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+organelle+traffic+through+cytoplasmic+bridges+in+early+spermatids+of+the+rat%3A+mechanisms+of+haploid+gene+product+sharing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing.</a> Mol Biol Cell. 14 (July), 2768-2780 (2003).</li>
<li>Bellvé, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+the+mouse+testis+and+characterization+of+isolated+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Dissociation of the mouse testis and characterization of isolated spermatogenic cells.</a> J Histochem Cytochem. 25 (7), 480-494 (1977).</li>
<li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+for+immunocytochemistry%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).</li>
<li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination%2C+pairing%2C+and+synapsis+of+homologs+during+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Recombination, pairing, and synapsis of homologs during meiosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), 1-26 (2015).</li>
<li>Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+recombination%3A+the+essence+of+heredity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Meiotic recombination: the essence of heredity.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (12), 1-36 (2015).</li>
<li>Scherthan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere+and+telomere+movements+during+early+meiotic+prophase+of+mouse+and+man+are+associated+with+the+onset+of+pairing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of pairing.</a> J Cell Biol. 134 (5), 1109-1125 (1996).</li>
<li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+leptotene-zygotene+transition+of+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The leptotene-zygotene transition of meiosis.</a> Annu Rev Genet. 32, 619-697 (1998).</li>
<li>Scherthan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bouquet+makes+ends+meet%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A bouquet makes ends meet.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (8), 621-627 (2001).</li>
<li>Turner, J. <a target="_blank" href="http://dev.biologists.org/content/134/10/1823">Meiotic sex chromosome inactivation.</a> Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).</li>
<li>Royo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATR+acts+stage+specifically+to+regulate+multiple+aspects+of+mammalian+meiotic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">ATR acts stage specifically to regulate multiple aspects of mammalian meiotic silencing.</a> Genes Dev. 27 (13), 1484-1494 (2013).</li>
<li>Turner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+unsynapsed+meiotic+chromosomes+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse.</a> Nat Genet. 37 (1), 41-47 (2005).</li>
<li>Marjanović, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEP63+deficiency+promotes+p53-dependent+microcephaly+and+reveals+a+role+for+the+centrosome+in+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">CEP63 deficiency promotes p53-dependent microcephaly and reveals a role for the centrosome in meiotic recombination.</a> Nat Commun. 6, 7676(2016).</li>
<li>Inanç, B., Dodson, H., Morrison, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Centrosome-autonomous+signal+that+involves+centriole+disengagement+permits+centrosome+duplication+in+G2+phase+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A Centrosome-autonomous signal that involves centriole disengagement permits centrosome duplication in G2 phase after DNA damage.</a> Mol Biol Cell. 21, 3866-3877 (2010).</li>
<li>Firat-Karalar, E. N., Sante, J., Elliott, S., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+mammalian+sperm+cells+identifies+new+components+of+the+centrosome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of mammalian sperm cells identifies new components of the centrosome.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4128-4133 (2014).</li>
<li>Fukuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transacting+factor+CBF-A%2FHnrnpab+binds+to+the+A2RE%2FRTS+element+of+protamine+2+mRNA+and+contributes+to+its+translational+regulation+during+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis.</a> PLoS Genet. 9 (10), e1003858(2013).</li>
<li>Lahn, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Previously+uncharacterized+histone+acetyltransferases+implicated+in+mammalian+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (13), 8707-8712 (2002).</li>
<li>Mermoud, J. E., Tassin, A. M., Pehrson, J. R., Brockdorff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosomal+association+of+histone+macroH2A1.2+in+embryonic+stem+cells+and+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Centrosomal association of histone macroH2A1.2 in embryonic stem cells and somatic cells.</a> Exp Cell Res. 268 (2), 245-251 (2001).</li>
<li>Shanmugam, M., Hernandez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+functions+for+SNAP45%2C+a+subunit+of+the+small+nuclear+RNA-activating+protein+complex+SNAPc%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitotic functions for SNAP45, a subunit of the small nuclear RNA-activating protein complex SNAPc.</a> J Biol Chem. 283 (21), 14845-14856 (2008).</li>
<li>Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+linking+extra+centrosomes+to+chromosomal+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability.</a> Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).</li>
<li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li>
<li>Amory, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+spermatogenesis+by+bisdichloroacetyldiamines+is+mediated+by+inhibition+of+testicular+retinoic+acid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">Suppression of spermatogenesis by bisdichloroacetyldiamines is mediated by inhibition of testicular retinoic acid biosynthesis.</a> J Androl. 32 (1), 111-119 (2011).</li>
<li>Hogarth, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+a+spermatogenic+wave+into+a+tsunami%3A+synchronizing+murine+spermatogenesis+using+WIN+18%2C446%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446.</a> Biol Reprod. 88 (2), 40(2013).</li>
<li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).</li>
<li>Kluin, P. M., Kramer, M. F., Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis+in+the+immature+mouse+proceeds+faster+than+in+the+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult.</a> Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).</li>
<li>Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+early+and+massive+wave+of+germinal+cell+apoptosis+is+required+for+the+development+of+functional+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis.</a> EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).</li>
<li>Kangasniemi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+basal+and+FSH+dependent+cyclic+AMP+production+in+rat+seminiferous+tubules+staged+by+an+improved+transillumination+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique.</a> Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).</li>
<li>Martianov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+arrest+of+spermiogenesis+and+germ+cell+apoptosis+in+mice+lacking+the+TBP-like+TLF%2FTRF2+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene.</a> Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).</li>
<li>Henriksén, K., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+apoptosis+of+male+germ+cells+in+the+rat%3A+Mechanisms+of+cell+death+studied+by+supravital+squash+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations.</a> Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Fareler spermatogenez sırasında segregasyonun ilerleme yöneten hücresel olaylar çalışmak için faydalı model organizma olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca, ben segregasyonun profaz gibi birçok olay, çıkmak çünkü spermatogenez çalışma için yiyecek ve içecek araçları geliştirmek için gerekli, cinsel dimorfik vardır. Bu iletişim kuralı görselleştirme ve fare spermatogenez farklı aşamalarında incelenmesi için seminifer tübül squash yöntemi açıklar. Bu yöntem hücresel bütünlüğü korur ve böylece nükleer ve sitoplazmik yapıların detay...

Mayoz, DNA ikileşmesi bir turu hücre bölünmesi iki ardışık tur tarafından takip edilir karmaşık bir hücresel olaydır. Birkaç mayoz özel olay mayoz doğru kromozom segregasyon sağlamak için ilk aşamalarında koordine edilmelidir. Homolog Rekombinasyon, kardeş ortak yönünü tamamlanması bu olaylar dahil ilk segregasyonun bölünme ve homologs arasında chiasmata gidermek için cohesin kompleksleri kademeli kaybı sırasında kinetochores. Hassas düzenleme bu işlemler, doğurganlık korumak için ve gelişimsel bozukluklar genetik ve spontan düşük1yol açabilir kromozom missegregation olayları önlemek için gereklidir.
Mayoz önemli olaylar ve erkeklerde gerçekleşecek olsa da, önemli zamansal ve mekanik sperma ve oogenesis2farklar. Örneğin, kadın mayoz sırasında embriyonik gelişim sırasında oluşur ve dictyate aşamada ergenlik kadar tutuklamalar profaz. Buna ek olarak, ergenlik ve dalgalar tutuklama olmadan yetişkin hayatı boyunca ilerledikçe, sperma başlar. Erkek ve dişi mayoz arasındaki farklar özellikle spermatocytes ve yumurta bu işlemlerde değerlendirmek doğru yiyecek ve içecek yöntemleri geliştirmek gerek vurgular. Şu anda, büyük ölçüde segregasyonun ilerleme değerlendirirken Kromatin yayılır3,4,5kullanımına dayanıyor. Kromatin yayılır segregasyonun kromozomlar eğitim için yararlı olsa da, onlar Milli mikrotübüller, centrosomes, nükleer zarf ve telomer ekleri gibi hücresel yapıların değerlendirilmesi önleme hücresel bütünlüğünün korunması için başarısız. Canlı görüntüleme ve uzun vadeli kodlamayla teknikleri kadın mayoz anlayışımızı büyük ölçüde gelişti; Tüm sağlam hücre görselleştirmek için benzer yaklaşımlar ancak, daha az sıklıkla spermatogenez6,7çalışma için geçerli olur. Erkek mayoz boyunca dinamik olaylar görselleştirmek için fare spermatocytes8,9geliştirme saytolojik özellikleri hızlı bir şekilde değerlendirmek için kurulan tübül squash teknikleri adapte olması. Burada açıklanan yöntemi birden çok hücresel yapılarının incelenmesi spermatogenez farklı aşamalarında etkinleştirme hücre bütünlüğünü korur.
Bu tübül squash teknik ayirt mikroskobu ile hücresel yapıların değerlendirilmesi için izin verir tüm cep telefonu yaklaşımdır. Haematoxylin ve Eozin gömülü parafin testis ve cryosections immünfloresan etiketleme boyama gibi erkek farelerde segregasyonun ilerleme görselleştirmek için ortak histolojik yaklaşımlar segregasyonun ilerleme geniş bir bakış için izin. Ancak, bu teknikler, mayoz10,11gerçekleşen olayların ayrıntılı analiz için gerekli ölçüde tek hücreler gidermek başarısız. Alternatif teknikleri segregasyonun süreçlerini görselleştirin önemli chemiosmotic kesinti belirleyip nükleer madde3,4,5çözmek için spermatocyte güveniyor. Bu kimyasal tedaviler gözlem hücre tiplerinin dışında birincil spermatocytes engel. Namekawa son zamanlarda açıklanan yöntemle izole spermatocytes nükleer mimarisini korumak araştırma topluluğu sağladı, ama bir cytospin ve bazı laboratuar4' e hazır olmayabilir aksesuar kullanımını gerektirir. Buna ek olarak, tübül squash tekniği sadece çoğu hücre biyoloji laboratuvarlarında genellikle standart ekipman gerektirir.
Burada açıklanan tübül squash yöntem sertoli hücreleri, spermatogonia, birincil ve ikincil spermatocytes ve spermatids de dahil olmak üzere seminifer tübül içinde bulunan farklı hücre tipleri görselleştirmek için kullanılabilir. Bu teknik spermatogenez Juvenil farelerde-zaman uyumlu ilk dalga ile tarafından kaplin, mayoz12ilerledikçe zenginleştirilmiş nüfus spermatogenic hücre elde etmek mümkündür. Bu işlem süreçleri boyunca sperma, erken profaz olayları gibi ayrıntılı analizini, G2/MI ve metafaz anafaz geçişler ve spermiogenesis için izin verir. Ayrıca, tübül squash hazırlıklar kromozomlar (interchromatid etki alanları (ICDs) ve kinetochores gibi) ve centrosomes (centrioles ve pericentriolar malzeme/matrisler) saytolojik özelliklerini görselleştirmek için kullanılabilir. Squash yöntemi Kromatin yayılır ve protein ayıklama gibi diğer deneysel yaklaşımlar ile paralel olarak kolayca gerçekleştirilebilir. Buna ek olarak, bu tekniği yaşam spermatogenic hücreleri doğrudan görselleştirme13slaytlarda yatırmak için başarıyla değiştirildi.
Burada açıklanan yöntemi G2/MI geçiş vahşi tipli C57BL/6J farelerde analiz etmek için tüm cep telefonu seminifer tübül squash tekniği içerir. Birincil spermatocytes ilk segregasyonun bölümü girerek saytolojik özelliklerini segregasyonun iğ gözlemlemek için ayirt mikroskobu ile görüntülenir. Bu çok yönlü teknik diğer segregasyonun aşamaları ve farklı hücre tipleri görselleştirmek için kolayca değiştirilebilir. Ayrıca DNA ve RNA balık yaklaşımlar gibi alternatif görselleştirme stratejileri için mükellef bir tekniktir.

<table><tbody><tr><td>% 16 Paraformaldehit Sulu</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri (EMS)</td> <td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Kalite Biyolojik</td><td>119-069-161</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>At Serumu</td><td>Sigma</td><td>H-1270</td><td></td></tr><tr><td>35mm x 10mm Petri Kabı, Steril, işlenmemiş</td><td>CellTreat</td><td>P886-229638</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizin kaplı cam slaytlar</td><td>Sigma</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı Engelleyici Kalem</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri (EMS)</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>Nemli Kutu</td><td>Evergreen</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Coplin 5 veya 10 Slayt İçin Cam Boyama</td><td>Kabı Fisher</td><td>08-813E</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Montajı DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Kapak Slaytları ile Orta (22mmx60mm)</td> <td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf Oje</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microsopes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası </td><td>Comments</td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gözlemci Z1</td><td>Zeiss 4109431007994000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss ZEN 2012 mavi baskı görüntü yazılımı</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 CMOS kamera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Birincil Antikorlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Mouse anti-SYCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-74569</td><td>1'ü 50 arada</td></tr><tr><td>Tavşan anti-SYCP3</td><td>Fisher (Novus)</td><td>NB300-231</td><td>1'ü 1000 arada</td></tr><tr><td>Keçi anti-SCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20845</td><td>1'ü 50 arada</td></tr><tr><td>İnsan anti-Sentromer Protein Antikorları</td><td>Dahil</td><td>15-235</td><td>100'ü</td></tr> <tr>1 arada<td>Fare anti-alfa tübülin</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1000'de 1</td></tr><tr><td>Fare anti-AIM1</td><td>BD Biosciences</td><td>611082</td><td>200'de 1</td></tr><tr><td>Fare anti-&gama; H2AX</td><td>Thermo Fisher</td><td>MA1-2022</td><td>500'de 1</td></tr><tr><td>Fare anti-CENT3</td><td>Abnova</td><td>H00001070-M01</td><td>1'de 200</td></tr><tr><td>Tavşan anti-pericentrin</td><td>Abcam</td><td>ab4448</td><td>1'ü 200 arada</td></tr><tr><td>Tavşan anti-REC8</td><td>Nezaketiyle&nbsp; Dr. Karen Schindler</td><td>Yok</td><td>1'de 1000</td></tr></tbody></table>

seminifer tübül squash tekniği fare modeli kullanarak sperma saytolojik analizi için

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Erkeklerde segregasyonun ilerleme, son derece düzenlenmiş hücresel olaylar birkaç uyumlu eylem gerektiren bir süreçtir. Mayoz sırasında oluşan hatalar infertilite, gebelik kaybı veya genetik kusurların yol açabilir. Başlangıcı ergenlik ve yetişkinlik devam, başlayan, spermatocytes sürekli yarı zaman uyumlu dalgalar spermatogenez geçmesi ve sonuçta haploit sperm oluştururlar. Fare spermatocytes segregasyonun başlatma geçiren ilk dalga gün 10 post-partum (10 dpp) görünür ve seminifer tübüllerin Lümen 35 dpp, olgun sperm olarak serbest bırakılır. Bu nedenle, faiz zenginleştirilmiş olasılığını elde etmek için bu gelişimsel zaman penceresi içinde fare kullanmak avantajlıdır. Nadir hücre aşamaları analizini tübüllerin içinde hücresel nüfus çeşitliliği artırmak art arda spermatogenic dalgalar katkı nedeniyle büyük farelerde daha zordur. Burada açıklanan yöntemi spermatogonia, spermatocytes ve spermatids de dahil olmak üzere fare, seminifer tübüllerin içinde bulunan hücreler saytolojik değerlendirilmesi için kolayca uygulanan bir tekniktir. Tübül squash teknik izole erkek germ hücreleri bütünlüğünü korur ve diğer teknikleri ile kolayca görselleştirildiği değil hücresel yapılarının incelenmesi sağlar. Bu tübül squash teknik olası uygulamaları göstermek için iğ derleme için ben geçiş metafaz profaz yoluyla ilerliyor spermatocytes (G2/MI geçiş) takip. Buna ek olarak, centrosome çoğaltılması, segregasyonun kromozomal inactivation (MSCI) ve kromozom buket oluşumu bu tübül squash yöntemi kullanarak gözlenen saytolojik yapıları örnek olarak değerlendirildi. Bu teknik spermatogenez sırasında mutasyon veya eksojen pertürbasyon, neden belirli kusurları kesin olarak belirlemek için kullanılabilir ve böylece, sperma moleküler anlayışımızı katkıda bulunur.

Burada, metafaz profaz geçiren geçici hücre popülasyonlarının görselleştirmek için tübül squash yöntemi kullandık ben (G2/MI) testis sperma (24 ilk dalga geçiyor Juvenil vahşi tipi fareler gelen hasat tarafından zenginleştirilmiş geçiş DPP). Şekil 1 tübül squash yöntemi kullanılarak görüntülenir çeşitli hücre aşamalarında temsilcisi görüntülerini gösteriyor. Zenginleştirilmiş metafaz nüfus ben spermatocytes Alfa-tübülin (şekil 1A...

Bu tübül squash teknik hızla hücresel bütünlüğünü koruyarak fare spermatocytes geliştirme saytolojik özellikleri değerlendirmek için hedeftir. Bu yöntem tüm aşamalarında spermatogenez çalışma için izin verir ve diğer biyokimyasal ve moleküler biyolojik yaklaşımlar için fare mayoz çalışmanın yanında kolayca uygulanabilir.

Seminifer tübül Squash tekniği fare modeli kullanarak sperma saytolojik analizi için

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Bu seminifer tübül kabak tekniğinin genel amacı, hücresel bütünlüklerini korurken fare spermatogonyasının, spermatositlerinin ve spermatidlerinin sitolojik özelliklerini görselleştirmektir. Bu gösteri için, mayoz bölünme geçiren spermatositlerin analizine odaklanıyoruz. Bu yöntem, spermatogonial kök hücre farklılaşması, mayotik kromozom ayrışması ve yuvarlak spermatidlerin mayotik sonrası farklılaşması gibi erkek üreme biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin temel avantajı, erkek germ hücrelerinin hücresel bütünlüğünün korunmasıdır, bu da diğer tekniklerle kolayca görüntülenemeyen hücresel yapıların incelenmesine olanak tanır. Bu yöntem, herhangi bir platide kısırlığın baba tarafından nedenleri hakkındaki anlayışımızı geliştirmek için kullanılabilir. Ve fare veya organ donörü türevli testisler gibi memeli sistemlerine uygulanabilir.Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler iyi bir kabak yapmakta zorlanacaktır. Yeterli kuvvet uygulamak ve tübülleri uygun şekilde düzenlemek, eşit bir tek tabaka hücre üretmek için önemli faktörlerdir. Diseke edilecek her fare için, biri üç mililitre PBS ve diğeri iki mililitre taze yapılmış Fiksatif Lizis çözeltisi ile iki adet 35 milimetre Petri kabı yükleyin.Zenginleştirilmiş bir ilgi popülasyonunu gözlemlemek için ilk spermatogenez dalgasından geçen fareleri seçin. Fareyi kurban ettikten sonra karnı %70 alkolle temizleyin ve ardından ameliyata devam edin. Abdominal pelvik boşluğa V şeklinde bir delik açın ve forseps kullanarak epididimal yağ yastığını çekerek, ancak tunika albuginea'yı rahatsız etmeden testisleri çıkarın.Testisleri PBS içeren tabağa aktarın. Orada, dokuyu keskin forsepslerle delerek testiküler tunika albuginea'yı çıkarın ve gevşek seminifer tübülleri toplayın. Daha sonra tübülleri Fiksatif Lizis çözeltisi ile tabağa aktarın ve reaksiyonun oda sıcaklığında beş dakika ilerlemesine izin verin.İnkübasyon sırasında, slaytın kenarlarını bir sıvı engelleyici kalemle çizerek ve ardından slaytı sınırlar içinde 100 mikrolitre Fiksatif Lizis solüsyonu ile doldurarak poli-L-lizin kaplı bir cam slayt hazırlayın. Beş dakikalık inkübasyondan sonra, steril forseps ve makas kullanarak seminifer tübülleri nazikçe ayırın ve kesin, böylece 20 milimetre ayrı segment elde edilir. Daha sonra, beş adet 20 milimetrelik tübül segmentini hazırlanan slayta aktarın.Ardından makas kullanarak segmentleri 1,5 ila üç milimetre uzunluklara ayırmaya devam edin. Şimdi forseps ile segmentleri üst üste gelmeyecek şekilde düzenleyin. Bunları slayt boyunca eşit olarak dağıtın.İdeal olarak, 20 ila 40 kısa uzunluk bir slaytı kaplar. Emici bir doku kullanarak slayt hazırlığındaki fazla sıvıyı çıkararak başlayın. Şimdi, bir kapak kayma uygulayın ve avuç içi topuğundan 10 ila 20 saniye boyunca baskı uygulayarak tübülleri ezin.Amaç, spermatositleri seminifer tübüllerden dağıtmak için yeterli kuvvet uygulamaktır. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, segmentlerin kabak tarafından bozulup bozulmadığını kontrol edin. Ardından, küçük bir Dewar'a biraz sıvı nitrojen dökün ve slaytı 15 saniye boyunca veya sıvının köpürmesi durana kadar hızlı dondurun.Amino lekelemeye devam etmek için, keskin bir nokta veya kenar kullanarak kapak fişini hemen çıkarın. İdeal olmasa da, donmuş slaytlar eksi 80 santigrat derecede hemen korunabilir ve iki haftaya kadar saklanabilir. Kapak sürgüsünü daha sonra çıkarmak için, kızakları 15 saniye boyunca sıvı nitrojene batırın ve kapak kızağını kaldırın.Amino etiketlemeye devam etmek için, slaytları 50 mililitrelik bir Coplin kavanozu kullanarak yıkama başına beş dakika boyunca PBS'de üç kez yıkayın. Yıkamalardan sonra, bir blok görevi görmesi için her slayta bir mililitre antikor seyreltme tamponu uygulayın. Blok reaksiyonunun nemlendirilmiş bir odada bir ila iki saat çalışmasına izin verin.Bu işlem sırasında slaytların kurumasına asla izin vermeyin. Ardından, tamponu nazikçe çıkarmak ve nemlendirilmiş odaya geri koymak için slaytları bir kağıt havluya hafifçe vurun. Daha sonra, her slayta 100 mikrolitre seyreltilmiş primer antikor uygulayın ve bunları, bağlanma reaksiyonunun gece boyunca çalışabileceği 40 santigrat dereceye aktarın.Antikor çözeltisi birinci sınıfsa, bir kapak fişi veya Parafilm ile kaplıysa hacmin yarısı kullanılabilir. Ertesi gün, birincil antikoru çıkarmak için PBS'de üç yıkama kullanın. Daha sonra, 100 mikrolitre seyreltilmiş ikincil antikor uygulayın ve bu reaksiyonun oda sıcaklığında bir ila bir buçuk saat sürmesine izin verin.Foto ağartmayı önlemek için, bu inkübasyon sırasında slaytları karanlık ve nemli bir odada tutun. Ardından, slaytları PBS ile iki kez yıkayın. Şimdi, DAPI içeren bir montaj ortamı kullanarak slaytları noktalayın.Daha sonra oje kullanarak kapak fişlerini kapatın ve görüntülemeye devam edin. Görüntü almak için, hassas z ekseni hareketi sağlayan otomatik aşamalı bir epifloresan mikroskobu kullanın. Ayrıca görüntü yakalamak için yüksek çözünürlüklü bir kamera kullanın.Şimdi, 20x'lik bir hedef kullanarak slaytları değerlendirin. Kabak hazırlığının kalitesini belirleyin. Kaliteli bir kabak, eşit olarak dağılmış tek katmanlı bir çekirdek tabakasına sahip olacaktır.Kabağın bazı bölgeleri diğerlerinden daha iyi olabilir. Daha yüksek büyütme altında kolayca bulmak için en iyi bölgelerin koordinatlarını not edin. Şimdi büyütmeyi 100x'e kadar artırın.Ardından, tutarlı bir tek çekirdek katmanına sahip olan belirtilen bölgelerden görüntüler yakalayın. Odaktaki ışığın tamamının yakalandığından emin olmak için üst ve alt z yığınlarını ayarlayın. En uygun z-yığını sayısı genellikle görüntü alma yazılımı tarafından belirlenir ve her hedef için farklıdır.Görüntülerden, işleme yazılımını kullanarak genişletilmiş derinlikli bir görüntü derleyin. Yazılım, tübül kabağı preparatlarının en iyi şekilde görüntülenmesi için gerekli olan her bir z-yığınından gelen odak içi ışığı birleştirecektir. Tarif edilen tübül kabağı yöntemi kullanılarak, profazdan metafaza bir geçişe uğrayan geçici hücre popülasyonları görselleştirildi.Metafaz bir spermatositlerin zenginleştirilmiş popülasyonları, alfa tübüline karşı antikorlar kullanılarak görüntülendi. Hücreleri faz birde görselleştirmek için, tübül kabak preparatları, Sinaptonemal Kompleks Protein 3'e karşı bir antikor ile immün olarak etiketlendi. Leptoten, zigoten ve pakiten diploten aşamalı spermatositlerin her ikisi de tanımlandı.Hücre döngüsü kinaz Aurora B'ye karşı antikorlar, mayoz bölünmenin sonraki olaylarını görselleştirmek için kullanıldı. Bu kinaz, metafaz sırasında iç sentromerde lokalize olur, daha sonra anafaz sırasında iğ orta bölgesine ve son olarak sitokinez sırasında bölünme oluğuna yeniden lokalize olur. Hücresel bütünlüğü koruyarak, tübül kabak tekniği, faz bir ile ilişkili yapılarda hücre altı organizasyonun görselleştirilmesine izin verir.Kromozom buketi dinamikleri birinci faz ile takip edilebilir. Sentrozom ayrışmasında sentriol duplikasyonu da görselleştirilebilir. Erken diploten evresinde, sentriol duplikasyonunu takiben sentrozom ayrışmasına uğrayan spermatosit, perisentriyollerin bir protein bileşeni olan perisentriyona karşı antikorlar ve sentriolleri işaretlemek için Centrin-3'e karşı antikorlarla görüntülendi.Bu videoyu izledikten sonra, hücresel bütünlüğü korurken gelişmekte olan fare spermatositlerinin sitolojik özelliklerini nasıl hızlı bir şekilde değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, ezme yoluyla diseksiyon fare başına bir saatten kısa sürede gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, spermatositleri seminifer tübüllerden dağıtmak için yeterli kuvvet uygulamayı unutmamak önemlidir.Ek olarak, Fiksatif konsantrasyon ve inkübasyon süresi, çalışılacak hücresel yapıya bağlı olarak optimize edilebilir. DNA ve RNA balığı yaklaşımları gibi alternatif görselleştirme stratejileri bu teknikle kolayca uygulanabilir. Tübül kabaklarını aşağı akış biyokimyasal tahlillerle tamamlayarak, başarılı mayotik ilerlemenin mekanik belirleyicilerini değerlendirmek mümkündür.

a-seminiferous-tubule-squash-technique-for-cytological-analysis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Germ hücre nakli ve testis dokusu xenografting için Protokoller açıklanmıştır. Germ hücre nakli alıcı testiste donör kaynaklı spermatogenez ve spermatogonial kök hücreler (DGM) belirlenmesi için fonksiyonel bir sulandırma tahlil sonuçları temsil eder. Xenografting Testis dokusu alıcı farelerde testis gelişimini ve spermatogenezi çeşitli donör türleri üretir.

Germ Hücre Nakli ve Testis Dokusu Farelerde Xenografting

Bu video, testislerin bir bileşeni olan fare seminifer tübüllerinden Sertoli hücrelerinin izolasyon prosedürünü göstermektedir. Enzimatik sindirim ve tekrarlanan yıkamalar, Sertoli hücrelerinin çözeltiye salınmasını teşvik eder, bu da çoğalma ve büyüme için daha fazla kültürlenebilir.

Fare Seminifer Tübüllerinden İmmün Düzenleyici Sertoli Hücrelerinin İzolasyonu

Izole edilmesi ve faz kontrast ve floresan mikroskobu ile görüntüleme için Drosophila testis örnekleri (canlı ve sabit) hazırlanması için yöntemler burada tarif edilmiştir.

Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar<em&gt; Drosophila</em&gt; Testisler

Akış sitometrisi kullanarak fare spermatidleri için bir sıralama stratejisi açıklıyoruz. Spermatidler, yuvarlak (spermiyogenez aşamaları 1-9), erken uzayan (spermiogenez aşamaları 10-12), geç uzayan (spermiyogenez aşamaları 13-14) ve uzun spermatidler (spermiyogenez aşamaları 15-16) dahil olmak üzere oldukça saf dört popülasyona ayrılır. Seçim parametreleri olarak DNA boyama, boyut ve granülozite kullanılır.

Adım özgü Fare spermatidlerin Sıralama&#39;yı Akışı Sitometrinin tarafından

Mayoz hangi gamet DNA ikileşmesi bir turu ve kromozom ayrışma birbirini izleyen iki tur üzerinden kurulan gelişimsel işlemidir. Memeli mayoz segregasyonun kromozom yayılır hazırlamak için bir teknik kullanarak incelenebilir. Burada, yüzey-yayılım çekirdeği fare spermatocytes üzerinden hazırlama yöntemi göstermektedir.

Fare Spermatocytes segregasyonun kromozom hazırlanması yayılır

Meni الرسالة sperm seminal jel--dan özgür olmak için gereklidir. Bu çalışma yordamları kadın üreme sistemi sonrası cinsel birleşme sperm toplama ve meni الرسالة Süre ölçümünü sağlar.

Meni kadın üreme sistemi ve meni الرسالة farelerde ölçümü sonrası çiftleşme koleksiyonu

Burada sunulan pachytene spermatositler zenginleştirmek için bir protokol, yuvarlak spermatidler, ve yetişkin fare testislerinden uzayan spermatidler standart laboratuvar ekipmanları ile bir kesintili sığır serum albumin yoğunluğu gradyanı kullanarak.

Standart Laboratuvar Ekipmanları Kullanılarak Fare Testlerinden Pachytene Spermatosit ve Spermatidlerin Zenginleşmesi

Burada yetişkin fare testislerinden canlı meiotik ve post-meyotik mikrop hücrelerini izole etmek için basit ve etkili bir yöntem salıyoruz. Düşük sitotoksisite, menekşe heyecanlı DNA bağlayıcı boya ve floresan-aktive hücre sıralama kullanarak, bir birçok downstream uygulamaları için son derece zenginleştirilmiş spermatojenik hücre popülasyonları izole edebilirsiniz.

Mor-Heyecanlı Hücre-Geçirgen DNA Bağlayıcı Boya Kullanılarak Murine Spermatojenik Hücrelerin İzolasyon

Bu protokol, seminifer epitel döngüsünün belirli aşamalarını temsil eden yetişkin fare seminifer tübüllerinin segmentlerinin transilluminasyon destekli mikroseksiyonunu ve buradaki hücre tiplerini ve daha sonra kabak preparatlarının ve bozulmamış tübül segmentlerinin immünostainasyonunu açıklar.

Aşağı Akış İmmünasyon Analizleri için Fare Seminifer Epitel Döngüsünün Belirli Aşamalarının Transilluminasyon Destekli Diseksiyonu

Bu makalede, erkek mayotik bölünmesi için değerli bir model olan abdominal cerrahi ve testiküler GSK923295 enjeksiyonu yoluyla CENP-E'nin in vivo inhibisyonu bildirilmiştir. İmmünofloresan, akım sitometrisi ve transmisyon elektron mikroskobu tahlillerini kullanarak, CENP-E inhibisyonunun fare spermatositlerinde kromozom yanlış hizalaması ve genom instabilitesi ile sonuçlandığını gösterdik.

Kinesin-7 CENP-E'nin In Vivo İnhibisyon, İmmünofloresan ve Akım Sitometrisi Kullanılarak Spermatositlerde Fonksiyonel Değerlendirilmesi

Burada, farelerde yuvarlak spermatid enjeksiyonu (ROSI) gerçekleştirmek için bir yöntem sunuyoruz, umut verici klinik uygulamaları olan ve embriyonik gelişimin altında yatan mekanizmaları araştırmak için faydalı bir teknik.

Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Öğrenin fare modelinde seminifer tübül squash tekniği ile spermatositlerin sitolojik analizini. Bu yöntem, erkek üreme biyolojisinde hücre bütünlüğünü koruyarak mayoz bölünme ve spermatogenez süreçlerini incelemenizi sağlar.

Seminifer tübül Squash tekniği fare modeli kullanarak sperma saytolojik analizi için

Daha fazla video keşfet