C57BL/6 farelerde deneysel otoimmün nörite fonksiyonel ve Neuropathological değerlendirmeler için ikna etmek için basit bir yaklaşım

Bu prosedürün genel amacı, hastalık sürecinin fonksiyonel ve patolojik analizi için bir fare modelinde Deneysel Otoimmün Nörit veya EAN'yi başarılı bir şekilde indüklemektir. EAN modeli, periferik nöropati ile ilgili temel soruları ele almak için kullanılabilir. Aynı zamanda, yeni terapötik ajanların etkinliğini potansiyel olarak araştırmak için harika bir modeldir.

Bu yaklaşımın temel avantajı, farede EAN modeli kullanılırken uygulanabilecek basit ve objektif bir işlevsel test paradigması sağlamasıdır. Bugün benimle prosedürü gösteren, Melbourne Üniversitesi'ndeki nörotrofin ve miyelin biyoloji laboratuvarında lisans öğrencisi olan Sang Won Yoo. Hastalık indüksiyonundan üç gün önce, motor fonksiyon değerlendirme cihazını açın ve ışık düğmesini açın.

Fareyi alın ve bir kırmızı gıda boyası kabının üzerine indirin. Fareyi yürüme bölmesine yerleştirin ve koşu bandı hızını saniyede 15 santimetreye ayarlayın. Koşu bandını açın ve farenin 36 saniye boyunca koşu hareketini yakalamak için yürüyüş işlevi görüntüleme sistemini kullanmak için kaydı tıklayın.

36 saniye sonra kaydı ve koşu bandını durdurun ve antrenman koşusu video dosyasını kaydedin file antrenman koşusunun belirlenen klasörde. İlk bağışıklamadan bir gün önce, anestezi uygulanmış altı ila sekiz haftalık erkek C57BL / 6 farelere 250 mikrolitre fare izotonik PBS IP'sinde mililitre başına 1.6 mikrogram Boğmaca toksini uygulamak için 30-1 / 2 gauge iğne ile donatılmış 0.5 mililitrelik bir şırınga kullanın. Daha sonra, fareleri EAN'ın klinik belirtileri için tabloya göre sıfırdan dörde kadar bir ölçekte puanlayın ve az önce gösterildiği gibi bir motor fonksiyon değerlendirmesi yapın.

Ertesi gün, eşit hacimlerde taze hazırlanmış peptit çözeltilerini% 0.9 salin ve mililitre başına 20 miligram Mycobacterium tuberculosis içinde tam Freund'un adjuvanında bir boncuk boncuk içinde birleştirin ve çözeltileri oda sıcaklığında bir dakika boyunca maksimum hızda karıştırın. Aşı ile birlikte 23 gauge iğne ile donatılmış bir şırınga yükleyin ve şırınga mili içindeki herhangi bir havayı boşaltmadan önce şırıngayı ters çevirin ve sallayın. İnkülumu vermeden önce, kürek kemiği arasındaki orta hattın hemen yanındaki tüyleri çıkarın ve maruz kalan cildi% 70 etanol ile dezenfekte edin.

Ardından, cildi kavramak için bir çift Adson forseps kullanın ve 50 mikrolitre solüsyonu deri altı enjeksiyon yoluyla Boğmaca toksini enjekte edilen fareye verin. Ertesi sabah, gösterildiği gibi 250 mikrolitre PBS IP'de mililitre başına 1.2 mikrogram Boğmaca toksini verin ve ardından 48 saat sonra mililitre başına 1.2 mikrogram Boğmaca toksini IP'si enjeksiyonu yapın. Üçüncü Boğmaca enjeksiyonundan üç gün sonra, daha önce olduğu gibi aynı enjeksiyon bölgesine 50 mikrolitre daha taze hazırlanmış inokülum uygulayın ve deneyin sonuna kadar hayvanların klinik skorunu ve motor fonksiyonunu haftada iki kez izleyin.

C57BL / 6 farelerde P0 180-199 peptit kaynaklı EAN, ilk aşılamadan altı gün sonra klinik skor başlangıcı ve ilk aşılamadan 25 gün sonra maksimum skor şiddeti ile monofazik bir hastalığa yol açar, ardından ilk aşılamadan 40 gün sonra bir miktar klinik skor iyileşmesi olur. Fareler, ilk aşılamadan altı gün sonra basit bir koşu görevinde başarısız olmaya başlar ve basit bir koşu bandı koşu görevini aşılamadan 35 gün sonra tamamlama kapasitesi çok azdır ve bu, ilk aşılamadan 55 gün sonra koşma kabiliyetinde iyileşme göstermez. Peptit kaynaklı EAN farelerinin siyatik sinirlerinin yarı ince bölümlerinin incelenmesi, yaşa uygun sağlıklı kontrollerden alınan siyatik sinirlere kıyasla demiyelinizasyon alanlarını ortaya koymaktadır.

Yüksek güçlü iletim elektron mikroskobu görüntüleri, demiyelinizasyon, miyelin lamel hasarı ve mitokondriyal şişme gibi akson stresi belirtileri gibi spesifik nöropatolojik özelliklerin tanımlanmasına izin verir. Bu hayvanlar ayrıca, yaşa uygun sağlıklı kontrol dokularında gözlenmeyen, siyatik sinirlerde travmatik olarak yükselmiş beta-amiloid öncü protein ekspresyonu ile kanıtlandığı gibi akut aksonal hasar gösterir. Düğümlerin genişlemesi ve paranotlarda bir bozulma da gözlenir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, deri altı enjeksiyonlar, herhangi bir enjeksiyon hatası olasılığı en az olan fare başına yaklaşık beş ila 10 dakika içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, tüm aşının enjeksiyon bölgesinde kaldığından ve hiçbirinin dışarı sızmadığından emin olmak için enjeksiyon bölgesini gözlemlemeniz gerçekten önemlidir. Koşu bandı yürüyüşünün video çekimi harikadır, çünkü salınım fazı veya adım uzunluğu gibi diğer parametrelerin hesaplanmasını sağlar ve bu ölçümler yeni terapötiklerin etkinliğini test ederken önemli hale gelebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, C57BL / 6 erkek farelerde EAN'nin nasıl indükleneceği konusunda gerçekten iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Ek olarak, deri altı enjeksiyonların güvenli ve doğru bir şekilde nasıl yerleştirileceği konusunda gerçekten iyi bir anlayışa sahip olmalısınız ve enjeksiyon hatası olmadığından emin olmalısınız. İğne ve aşı ile çalışırken, özellikle kesici aletler kullanıldığında yaralanma olasılığı olduğunu unutmayın.

Bu nedenle, herhangi bir yaralanma olasılığını önlemek için, her zaman forseps kullanmak ve asla cildi veya dokuyu elle kavramamak ve ayrıca tek kullanımlık şırıngalar kullanmak, işlem sırasında asla geri almamak gerçekten iyi bir fikirdir.