Name: İntraselüler Protein-protein etkileşimleri çalışmaya Biotinylated hücre Penetran peptidler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Öğrenin, biyotinle işaretlenmiş hücre penetrasyon peptidleri kullanarak G166 glioma kök hücrelerinde intraselüler protein-protein etkileşimlerini incelemeyi. Bu yöntem, hücre içi bağlamda moleküler etkileşimleri canlı hücrelerde çalışmanıza olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz M. Morales ve J. Bravo CPPs ve JC Arévalo tasarımı onun yardımıyla açılan iletişim kuralı için onların yardım için teşekkür ederim. T. del Rey teknik yardım için sana şükrediyoruz. Bu eser "gayri resmi" de Economía y Competitividad, İspanya tarafından desteklenen; FEDER BFU2015-70040-R, cunta de Castilla y Leon, İspanya; FEDER SA026U16 ve Fundación Ramon Areces. M. Jaraíz-Rodríguez ve A. González-Sánchez cunta de Castilla y Leon bir Bursu ve Avrupa Sosyal Fonu alıcıları vardır.

Tüm deneysel prosedürler Salamanca Üniversitesi gerçekleştirilmiştir.
1. hücre
<ol>
	<li>Yordamı, başlamadan önce iki gün hücreleri denemenin gün Konfluent olmak gerekli yoğunluğu, plaka. Şişeler veya tabak hücrelerde plaka. Ancak, protein ayıklama plakalar daha kolay olacak. 78 cm2 en az 4 plakaları veya koşul deney, başına başına 150 cm2 2 Şişeler emin olmak için sonuçları tutarlı hazırlamak uygundur.</li>
	<li>Bu çalışmada, insan G166 GSCs 150 cm2ile %2 B27, %1 N2, 20 ng/mL EGF ve b-FGF Pollard ve ark.22tarafından açıklandığı gibi takıma RHB-A kök hücre ortamda kültürlü, 4 Şişeler içinde plaka. İzdiham ulaşıldığında işlemi. Örneğin, 5 x 106 G166 hücreleri bir 150 cm2 şişeye kaplama zaman, 2 gün sonra kaplama işlendi.</li>
</ol>
2. Biotinylated CPPs
<ol>
	<li>8200 x g 30 için de lyophilized biotinylated CPPs (BCPPs) içeren şişeleri spin s bazı kapağını kalan toz önlemek için. Bir denetim bulundu etkileşimleri hedef sırasını belirli olduğundan emin olmak için BCPP içerir. Bu çalışmada, kontrol BCPP TAT-biotin (TAT-B) ve tedavi BCPP TAT-Cx43266-283oldu -d. TAT yuvarlak şifreli veya mutasyona uğramış parçaları bond için biotin gibi diğer denetimleri kullanılabilir.</li>
	<li>BCPPs üretici tarafından belirtilen stok çözüm için karşılık gelen Kültür ortamında dağıtılması; Örneğin, 2 mg/mL stok bir çözüm elde etmek için BCPP GSCs tedavi etmek için ekleyin GSC kültür ortamının 0.5 mL 1 mg BCPP içeren bir şişe. Girdap ve peptid de çözünmüş emin olun.</li>
</ol>
3. tüpler
Not: Bölüm 7'gerekli koşul başına en az on iki 1,5 mL tüpler hazır olun.
<ol>
	<li>Koşul başına ilk 3 tüpler işaretleyin. 6.4. adımda elde hücresel lysates hacmi olacaktır.</li>
	<li>Koşul başına 3 tüpler içinde A işaretleyin. Bu tüpler lysing ve hücresel lysates iplik adım sonra 7,2 elde edilen ilk supernatants olacaktır.</li>
	<li>Koşul başına 3 tüpler bir B işaretle. Bu tüpler ilk supernatants küçük bir aliquot olacak. Bu lysates adım 7,3 Western blot örneklerinde olarak görev yapacak.</li>
	<li>Koşul başına 3 tüpler C'de işaretleyin. Bu tüpler sonra açılan NeutrAvidin, adım 7.7 ile elde edilen supernatants olacaktır. Not: Western blot proteinler, proteinler aşağı çekti değil veya yordamı bazı aşamada kayıp anlamına gelen sinyali yok gösterdi diye bu önemlidir. Bu durum olsaydı, proteinler çekmek için işlemi yineleyin.</li>
</ol>
4. BCPPs ile hücresel tedavi
<ol>
	<li>Kültür orta Aspire edin.</li>
	<li>Taze orta BCPPs orta göre kuluçka times en küçük olası hacmine kuluçkaya için gerekli karşılık gelen hacmi değiştirin. Böylece hücreleri dışarı, mesela 6 mL 150 cm2 30 dk kuluçka için başına kuru değil ne olursa olsun, orta tamamen plaka/şişeye tüm yüzeyini kapsar çok önemlidir.</li>
	<li>BCPP hisse senedi çözüm hacmi etkili olduğu kanıtlanmıştır toplama ulaşmak için hücre kültürleri ekleyin. Bu çalışma 50 µM TAT-Cx43266-283- B GSC nükleer silahların yayılmasına karşı azaltmak için kanıtlanmıştır.
	<ol>
		<li>Bu nedenle, 2 mg/ml TAT-Cx43266-28392.8 µL eklemek -B (MW = 3723.34 g/mol) mL 50 µM TAT-Cx43266-283son bir konsantrasyon elde etmek için kültür ortamının başına -d. Eklenecek birim denetim peptidler için farklı ise, aynı son hacim kadar kültür orta ile tamamlayın. Örneğin, 49.1 µL TAT-B (MW = 1914.31 g/mol) 43.7 µL GSC orta 50 µM son bir konsantrasyon elde etmek için kültür ortamının mL eklenen TAT-d.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>37 ° C ve % 5 CO2 BCPP ve hücre içi ortakları arasındaki etkileşimler yerini almak emin olmak 30 dk için kuluçka hücreleri yerleştirin. Etkileşim daha uzun sürerse, daha uzun süreleri için kuluçkaya veya deneme süresi tabii oluşuyordu durumunda kez ayarlayabilirsiniz. Buna ek olarak, faiz arasındaki etkileşimin terfi veya uyarıcı farklı hücre içi sinyal yolları tarafından engelledi.</li>
</ol>
5. arabellekleri ve çözümleri.
<ol>
	<li>PBS pH 7.4: 136 mM NaCl hazırlamak; 2.7 mM KCl; 7,8 mM Na2HPO4·2H2O; 1.7 mM KH2PO4.</li>
	<li>Protein lizis arabellek hazırlamak: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 137 mM NaCl, % 1'IGEPAL, önceden kullanmak için aşağıdaki ekleyin: 1/100 (v/v) proteaz inhibitörü kokteyl, 1 mM sodyum florid, 1 mM Phenylmethanesulfonyl flor (PMSF) ve 0,1 mM sodyum orthovanadate.</li>
	<li>Laemmli arabellek hazırlamak: (4 x: 0,18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M gliserol; % 3.7 SDS (p/v); 0,6 M β-mercaptoethanol veya 9 mM DTT; %0,04 (v/v) bromophenol mavi (BB)).</li>
</ol>
6. protein çıkarma
Not: Protein çıkarma yukarıda açıklanan20,23gerçekleştirildi. Bu bölüm 4 ° C'de yordam yürütmek
<ol>
	<li>Kültür orta tamamen Aspire edin.</li>
	<li>Yıkama buz gibi fosfat ile 3 x 10 mL serum fizyolojik (PBS) 150 cm2 başına hücre dekolmanı önlemek için çok dikkatli bir şekilde arabelleğe alınmış.</li>
	<li>Lysate hücre elde etmek için 3 mL 150 cm2 başına lizis arabellek ekleyin ve iyice bir hücre kazıyıcı kullanarak yüzey raspa. Plaka/şişesi yaklaşık 45 derece için devirme hücre lysates onların karşılık gelen tüpler içine toplamak daha kolay hale getirecek.</li>
	<li>Üç 1,5 mL tüpler içinde hücresel tüp lysate 1 mL dökün. Bu tüpler koşul ve 3.1 adımda gösterildiği gibi çoğaltma işaretlenmiş.</li>
</ol>
7. açılan
<ol>
	<li>11.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de 1,5 mL tüpler santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Supernatants yeni tüpler (A) aktarın.</li>
	<li>Bir aliquot, bu süpernatant koşul başına farklı tüpler (B), yani 50 µL tüp başına götürün. 4 x Laemmli arabellek (lysate, 50 µL için 16,6 µL) ekleyin ve -20 ° C'de dondurmak Bu lysates zamanki Western blot örnekleri görev yapacak.</li>
	<li>Çok iyi NeutrAvidin özel nazik sallayarak lunaparkçı. Kendi çapında artırmak ve boncuk pipetting geliştirmek için pipet ipuçları ipuçları kesmek.</li></ol>NeutrAvidin özel 50 µL hücre (A) tüplerde lysate mL başına ekleyin.
	<li>4 ° C'de gecede NeutrAvidin BCPPs bağlı hücre içi eşleri ile etkileşimine izin vermek için çok nazik sallayarak ile kuluçkaya.</li>
	<li>4 ° C'de NeutrAvidin kompleks protein ile toplamak için 1 dk 3000 x g , santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Dikkatle supernatants kaldırın ve temiz tüpler (C) aktarabilirsiniz. Onları aşağı açılır başarılı değil diye onları kullanmaya devam.</li>
	<li>Adımları yıkama: taze lizis arabellek granül (a tüpler) eklemek, INVERSION tarafından resuspend ve tekrarlamak belgili tanımlık merdiven 7,6) ve 7.7) 5 kez daha için. Bu supernatants göz ardı.</li>
	<li>Supernatants kaldırın ve 2 x Laemmli Arabellek istenen son hacim (1,5 mL tüp 150 cm2 şişeler Konfluent hücre elde edilen Pelet başına 40 µL) ekleyin.</li>
	<li>Proteinler ve santrifüj 30 arasındaki etkileşimler ayırmak 5 min için 100 ° C'de elute NeutrAvidin boncuk cips için 8,200 x g s.</li>
	<li>Kapiller keyif-e doğru yeni tüpler (D) ile Disosiye protein içeren supernatants, al. Boncuk elüsyon adımları gereklidir yinelenen durumunda tutulabilir. Not: Supernatants (tüpler D) Western blot yüklenecek veya -20 ° C'de dondurmak için hazırsınız</li>

8. Western Blot
Not: Western Blot yukarıda açıklanan24gerçekleştirildi.
<ol>
	<li>Bis-Tris (4-%12) midigels bir MIDI-hücre Elektroforez Sistemi Lane'de başına her örneğinin eşdeğer birim yük.</li>
	<li>Transblot protein nitroselüloz düzenli yığını kuru bir blotting sistem kullanarak.</li>
	<li>Membran % 10 ile leke Ponceau 10 dk için.</li>
	<li>Membran TTBS dakika 3 x 5 5 mL ile yıkayın.</li>
	<li>Membranlar ile yumuşak tüpler veya küçük kutular içinde sallayarak ile % 7 süt TTBS için 1 h blok. Kullanılan birimin membran kapak için yeterli olduğunu ve onlar değil kuru olduğunu, Yani tüm MIDI membran başına 40 mL emin olun.</li>
	<li>TTBS dakika 3 x 5 5 mL ile yıkayın.</li>
	<li>Gecede karşı nazik sallayarak ile ilgi protein birincil antikor ile 4 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>TTBS dakika 3 x 5 5 mL ile yıkayın.</li>
	<li>Membran ile muhabir peroksidaz Birleşik ikincil antikor TTBS içinde 1 h için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>TTBS dakika 3 x 5 5 mL ile yıkayın.</li>
	<li>Chemiluminescent yüzey ile bir Kemiluminesan sistemi geliştirmek.</li>
</ol>
9. problem çözme
<ol>
	<li>Geliştirme sonra Western blot herhangi bir sinyal yok tüm proteinler için gösterdi örnekleri, Ponceau kontrol edin. Not: Membran Ponceau içinde tanımlanmamış göstermelidir ve şerit boyunca çok sayıda bantları yüklendi. Bantları çok fark yoksa, yüklü protein miktarı yeterli olmayabilir veya aktarım yanlış gitmiş olabilir. Western blot yinelenen göz önünde bulundurun.</li>
	<li>Hiçbir leke hiç herhangi bir şeritte Ponceau membran ise, (C) tüpler 7,4 adımdaki tüm yordamı yineleyin.</li>
	<li>Eğer Western blot geliştirme sonra protein sinyal çok zayıftır ama daha uzun süre membran ile birincil antikor kuluçkaya proteinler, Ponceau gösterdi. Sinyal hala oldukça zayıf ise, yine oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
</ol>
10. diğer teknikleri kullanılmış bu makaledeki
<ol>
	<li>BCPPs Immunocytochemistry
	<ol>
		<li>%4 paraformaldehyde (cm2başına 0.2 mL) 20 dk için hücrelerde düzeltmek.</li>
		<li>3 x 5 min PBS (cm2başına 0.2 mL) ile yıkayın.</li>
		<li>Gecede 4 ° C'de ilgi üreticinin belirtilen konsantrasyon, protein karşı antikor çözüm içinde seyreltilmiş karşılık gelen antikor (en azından cm2başına 0,15 mL) Uygula</li>
		<li>Bir fluorophore Birleşik ikincil antikor (cm2başına 0,15 mL) oda sıcaklığında 2 h ile kuluçkaya.</li>
		<li>Adımları 10.1.2-10.1.4 diğer antikorlar karşı ilgi, proteinler ile yineleyin. Farklı birincil antikorlar veya aynı dalga boyu fluorophores ikincil karşı antikorlar için aynı tür kullanmamaya dikkat et.</li>
		<li>Antifade reaktifi (cm2başına 0.005 mL) kullanarak hücreleri bağlayın.</li>
		<li>Bir dijital fotoğraf makinesi için bağlı floresan mikroskop analiz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MTT tahlil
	<ol>
		<li>24-şey tabak içinde 37 ° C'de hücreler kültür.</li>
		<li>Kültür Orta 0,5 mg/mL MTT içeren cm2 başına 0,15 mL ile 75 dk için karanlık hücrelerde kuluçkaya.</li>
		<li>Orta Aspire edin ve hafif sallayarak ile Dimetil sülfoksit (cm2başına 0.25 mL) ile karanlıkta 10 min için hücreleri kuluçkaya.</li>
		<li>Bir dalga boyu 570 Absorbans ölçmek Mikroplaka okuyucu kullanarak nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin.+3.+The+nature+of+the+biotin-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site.</a> Biochem J. 89, 599-609 (1963).</li>
<li>Wilchek, M., Bayer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+avidin-biotin+technology%3A+literature+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Applications of avidin-biotin technology: literature survey.</a> Methods Enzymol. 184, 14-45 (1990).</li>
<li>Herce, H. D., Garcia, A. E., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+molecular+mechanism+for+the+cellular+uptake+of+guanidinium-rich+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Fundamental molecular mechanism for the cellular uptake of guanidinium-rich molecules.</a> J Am Chem Soc. 136 (50), 17459-17467 (2014).</li>
<li>Ramsey, J. D., Flynn, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides+transport+therapeutics+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides transport therapeutics into cells.</a> Pharmacol Ther. 154, 78-86 (2015).</li>
<li>Fominaya, J., Bravo, J., Rebollo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+stabilize+cell+penetrating+peptides+for+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Deliv%22%5BJournal%5D)">Strategies to stabilize cell penetrating peptides for in vivo applications.</a> Ther Deliv. 6 (10), 1171-1194 (2015).</li>
<li>Vives, E., Brodin, P., Lebleu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+truncated+HIV-1+Tat+protein+basic+domain+rapidly+translocates+through+the+plasma+membrane+and+accumulates+in+the+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus.</a> J Biol Chem. 272 (25), 16010-16017 (1997).</li>
<li>Gump, J. M., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAT+transduction%3A+the+molecular+mechanism+and+therapeutic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects.</a> Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).</li>
<li>Brooks, H., Lebleu, B., Vives, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tat+peptide-mediated+cellular+delivery%3A+back+to+basics%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Tat peptide-mediated cellular delivery: back to basics.</a> Adv Drug Deliv Rev. 57 (4), 559-577 (2005).</li>
<li>Cuesto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide-3-kinase+activation+controls+synaptogenesis+and+spinogenesis+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide-3-kinase activation controls synaptogenesis and spinogenesis in hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 31 (8), 2721-2733 (2011).</li>
<li>Schmidt, N., Mishra, A., Lai, G. H., Wong, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine-rich+cell-penetrating+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Arginine-rich cell-penetrating peptides.</a> FEBS Lett. 584 (9), 1806-1813 (2010).</li>
<li>Sorgen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+in+the+carboxyl+terminus+of+the+gap+junction+protein+connexin43+indicates+signaling+between+binding+domains+for+c-Src+and+zonula+occludens-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural changes in the carboxyl terminus of the gap junction protein connexin43 indicates signaling between binding domains for c-Src and zonula occludens-1.</a> J Biol Chem. 279 (52), 54695-54701 (2004).</li>
<li>Giepmans, B. N., Hengeveld, T., Postma, F. R., Moolenaar, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+c-Src+with+gap+junction+protein+connexin-43.+Role+in+the+regulation+of+cell-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interaction of c-Src with gap junction protein connexin-43. Role in the regulation of cell-cell communication.</a> J Biol Chem. 276 (11), 8544-8549 (2001).</li>
<li>Tabernero, A., Gangoso, E., Jaraíz-Rodríguez, M., Medina, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+connexin43-Src+interaction+in+astrocytomas%3A+A+molecular+puzzle%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of connexin43-Src interaction in astrocytomas: A molecular puzzle.</a> Neuroscience. 323, 183-194 (2016).</li>
<li>Giaume, C., Koulakoff, A., Roux, L., Holcman, D., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglial+networks%3A+a+step+further+in+neuroglial+and+gliovascular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astroglial networks: a step further in neuroglial and gliovascular interactions.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (2), 87-99 (2010).</li>
<li>Shinoura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+and+messenger+RNA+expression+of+connexin43+in+astrocytomas%3A+implications+in+brain+tumor+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Protein and messenger RNA expression of connexin43 in astrocytomas: implications in brain tumor gene therapy.</a> J Neurosurg. 84, 839-845 (1996).</li>
<li>Soroceanu, L., Manning, T., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+expression+of+connexin-43+and+functional+gap+junction+coupling+in+human+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Reduced expression of connexin-43 and functional gap junction coupling in human gliomas.</a> Glia. 33, 107-117 (2001).</li>
<li>Pu, P., Xia, Z., Yu, S., Huang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+expression+of+Cx43+in+astrocytic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neurol+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Altered expression of Cx43 in astrocytic tumors.</a> Clin Neurol Neurosurg. 107 (1), 49-54 (2004).</li>
<li>Crespin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+gap+junction+protein%2C+connexin43%2C+in+a+large+panel+of+human+gliomas%3A+new+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Med%22%5BJournal%5D)">Expression of a gap junction protein, connexin43, in a large panel of human gliomas: new insights.</a> Cancer Med. 5 (8), 1742-1752 (2016).</li>
<li>Gangoso, E., Thirant, C., Chneiweiss, H., Medina, J. M., Tabernero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-penetrating+peptide+based+on+the+interaction+between+c-Src+and+connexin43+reverses+glioma+stem+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">A cell-penetrating peptide based on the interaction between c-Src and connexin43 reverses glioma stem cell phenotype.</a> Cell Death & Disease. 5, (2014).</li>
<li>Gonzalez-Sanchez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+recruits+PTEN+and+Csk+to+inhibit+c-Src+activity+in+glioma+cells+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Connexin43 recruits PTEN and Csk to inhibit c-Src activity in glioma cells and astrocytes.</a> Oncotarget. 7 (31), 49819-49833 (2016).</li>
<li>Jaraíz-Rodríguez, M., et al. A short region of connexin43 reduces human glioma stem cell migration, invasion and survival through Src, PTEN and FAK. Stem Cell Reports. , In press (2017).</li>
<li>Pollard, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cell+lines+expanded+in+adherent+culture+have+tumor-specific+phenotypes+and+are+suitable+for+chemical+and+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 568-580 (2009).</li>
<li>Yu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+regulation+of+NGF-mediated+functions+by+Nedd4-2+ubiquitination+of+TrkA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo regulation of NGF-mediated functions by Nedd4-2 ubiquitination of TrkA.</a> J Neurosci. 34 (17), 6098-6106 (2014).</li>
<li>Herrero-Gonzalez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+inhibits+the+oncogenic+activity+of+c-Src+in+C6+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Connexin43 inhibits the oncogenic activity of c-Src in C6 glioma cells.</a> Oncogene. 29 (42), 5712-5723 (2010).</li>
<li>Cooper, G. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCooper%2C+GM+%22The+Cell%3A+A+Molecular+Approach%22">The Cell: A Molecular Approach</a>. , 2nd ed, Sinauer Associates. (2000).</li>
<li>Fittipaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+lipid+rafts+mediate+caveolar+endocytosis+of+HIV-1+Tat+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell membrane lipid rafts mediate caveolar endocytosis of HIV-1 Tat fusion proteins.</a> J Biol Chem. 278 (36), 34141-34149 (2003).</li>
<li>Dirks, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+stem+cells%3A+the+cancer+stem+cell+hypothesis+writ+large%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large.</a> Mol Oncol. 4 (5), 420-430 (2010).</li>
<li>Hopp, T. P., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nbt/journal/v6/n10/abs/nbt1088-1204.html">A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification.</a> Nat Biotech. 6 (10), 1204-1210 (1988).</li>
<li>Benard, V., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+Cdc42%2C+Rac%2C+and+Rho+GTPase+activation+by+affinity+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Assay of Cdc42, Rac, and Rho GTPase activation by affinity methods.</a> Methods Enzymol. 345, 349-359 (2002).</li>
<li>Guidotti, G., Brambilla, L., Rossi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Penetrating+Peptides%3A+From+Basic+Research+to+Clinics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell-Penetrating Peptides: From Basic Research to Clinics.</a> Trends Pharmacol Sci. 38 (4), 406-424 (2017).</li>
<li>Hu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+therapy+using+tumor+homing+and+penetrating+peptide-functionalized+PEG-PLA+nanoparticles+loaded+with+paclitaxel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Glioma therapy using tumor homing and penetrating peptide-functionalized PEG-PLA nanoparticles loaded with paclitaxel.</a> Biomaterials. 34 (22), 5640-5650 (2013).</li>
<li>Babu, M. M., van der Lee, R., de Groot, N. S., Gsponer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+disordered+proteins%3A+regulation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Intrinsically disordered proteins: regulation and disease.</a> Curr Opin Struct Biol. 21 (3), 432-440 (2011).</li>
<li>Anthis, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+integrin+tyrosine+phosphorylation+is+a+conserved+mechanism+for+regulating+talin-induced+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Beta integrin tyrosine phosphorylation is a conserved mechanism for regulating talin-induced integrin activation.</a> J Biol Chem. 284 (52), 36700-36710 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Protein-protein etkileşimlerini incelemek için pek çok yöntem vardır. Bu çalışmada sunulan yöntem hangi biotinylated yem etkileşim kurulmasını sağlamak için hücre lysates ile inkübe yaygın olarak kullanılan biotin-avidin açılan sistemine bağlıdır. Bu çalışmada sunulan değişiklik bu teknik hücre Penetran serileri ile kombinasyonu içerir. Canlı hücreler yerine hücre lysates ile inkübe hücre Penetran yemler tasarım için teklif ve bu nedenle bulundu etkileşimleri bu hücresel bağlamı içinde gerçekleşen yansıtır.
Burada TAT hücre Penetran sıralaması, biotin açılan etiket ve hücre içi etkileşimler insan GSCs bulmak için hedef olarak amino asitler 266-283 arasında oluşan Cx43 bölge olarak kullanırız. Yapısal Cx43 ve c-Src arasındaki etkileşimi için iyi bilinen11,12temelidir. C-Src gliyom hücreleri24,13oncogenic aktivitesini inhibe önemli bir etkileşim olmasıdır. Aslında, bu bölge (TAT-Cx43266-283) içeren CPPs Cx43 antioncogenic özellikleri gliyom hücreleri19,20,21üzerinde taklit. Sıçan gliyom C6 hücrelerinde c-Src, endojen inhibitörleri CSK ve PTEN20ile birlikte alımı hangi c-Src TAT-Cx43266-283 engeller mekanizması içerir. Çünkü onlar konvansiyonel tedavilere dirençli ve bu nedenle bu kötü huylu beyin tümörü27tekrarını sorumlu bir subpopulation teşkil GSCs çok ilginç bir hedef olarak tümörü tedavisi, belirtilmelidir. Ayrıca, onlar zor transfect hücreleri ve bu nedenle hücre içi etkileşimler çalışmanın daha zor olur. CPPs hızla ve verimli bir şekilde GSCs19 kullanımları için hücre içi etkileşimler çalışmanın lehine içselleştirilmiş. Bu çalışma, biz Cx43266-283 sıra etkileşim c-Src CSK ve PTEN insan GSCs içinde endojen inhibitörleri ile birlikte onaylamak için biotin erimiş CPPs kullanarak.
Bu yöntem biyoaktif bileşiklerin hücre içi mekanizması çalışmaya çok güçlüdür. Ancak, biotinylated hücre içine işleyen yem biyolojik etkisini farklı sigara-biotinylated ile bir elde değildir onaylamak çok önemlidir. Biyoaktif bileşik etkisi ile bulundu etkileşimleri ilişkilendirmek için bu adım gereklidir. Ayrıca, bileşik, onun olası bozulma proteaz tarafından yanı sıra olası onun toksisitesi, kararlılığını olmalı dikkatle test ve deneme planlamadan önce göz önünde. Sunulan örnekte, önceden belgelenen20G166 insan GSCs anti-proliferatif TAT-Cx43266-283 etkisi olmuştur. Bu çalışmada, biz bunu teyit TAT-Cx43266-283anti-proliferatif etkisi -B ve TAT-Cx43266-283 çok benzerdir. Buna ek olarak, bu α-tübülin hücresel Morfoloji analizi ortaya ve F-aktin dağıtım çok G166 TAT-Cx43266-283ile tedavi GSCs içinde benzer -B veya TAT-Cx43266-283. Özet olarak, bu sonuçlar dahil biotin c-terminus, TAT-Cx43266-283 , insan GSCs üzerine bu bileşik etkisi değiştirmek değil gösterir. Biotin biyoaktif molekül etkilerini değiştirmek istiyorum, ancak, diğer Etiketler protein arıtma, bayrak octapeptide (DYKDDDDK)28gibi insan grip hemagglutinin kaynaklı etiket HA (YPYDVPDYA) ya da glutatyon test edilebilir S-transferaz (GST)29. Benzer şekilde, TAT faiz hücre nüfusu hedef değil, diğer penetratin, MPG (için bir daha gözden geçirme, bkz:30) gibi delici dizileri, hücre veya hücre belirli dizileri-ebilmek var olmak kullanılmış31.
Özellikle hedef sıra ile etkileşim çalışma proteinler yanı sıra, hem denetim hem hedef sıra ile etkileşim proteinler ve bileşenlerle, pozitif ve negatif denetimleri etkileşimli olarak proteinler varlığı en ideali ele. Bu anlamda Cav-1 denetimde bulunan ve daha önce26gösterilmiştir gibi caveolae içselleştirilmesi, mekanizma içinde yer düşündüren durum, tedavi. Ayrıca, c-Src ile etkileşim kurar ama Cx43 c-terminal ile etkileşimli olarak beklenir, FAK yok oldu hem denetim hem de tedavi durumu. Bu sonuçlar TAT-Cx43266-283- B, c-Src, CSK ve PTEN arasındaki etkileşimi özgüllük güçlendirmek. Bu iletişim kuralı ile elde edilen sonuçları onaylamak için confocal mikroskobu etkileşen proteinlerin dağılımını görselleştirmenizi ve onların ortak yerelleştirme eğitim için kullanılabilir. Böylece, eş yerelleştirme sonuçları teyit bazı noktaları ile benzer bir hücre içi dağıtım açılan deneylerden elde edilen bu TAT-Cx43266-283- B ve c-Src sergi bulduk. Aslında, TAT-Cx43266-283- B kargo, bu çalışmada Cx43266-283, hücre içi ortaklarına molekül yönlendirir düşündüren plazma zarı yakın dağıtılır.
Bir önerilen yöntemi sınırlamaları gibi yem düzgün pas için başarısız olabilir kullanılan molekül ve beklenen etkileri değil bulunur. Bu durumda bulunan etkileşimleri efekte ilişkili olabilir. Ancak, çünkü onlar genellikle özünde düzensiz bölgeler32 tarafından yapılır ve bu nedenle onlar bir sıralı katlama gerektirmeyen bu yöntem özellikle ilginç etkileşimleri sinyal iletim yollarının içinde dahil olabilir. Ayrıca, önerilen yöntemin avantajları, etkileşimin zaman ders, için geçici etkileşimler özellikle ilgili olduğu izlenebilir olduğunu biridir. Ayrıca, her kalıntı etkileşimi alaka kolayca okudu olabilir. Nitekim, Glutamat serin veya treonin phosphomimetic ikame tarafından protein-protein etkileşimi, örneğin, ardından değişiklikleri uygunluğunu incelemek mümkündür. Benzer şekilde, serin veya treonin alanin için veya fenilalanin tirozin ikame phosphorylatable serin, treonin veya tirozin. etkisini test sağlarFosfo-tirozin taklit etmek için Tyr ikame p-Tyr33için en doğru yoldur.
Çünkü bu sistem RNA dizileri, nano tanecikleri, virüsler veya biotin için erimiş ve CPP ile çalışmaya transduced diğer moleküller gibi biyoaktif diğer yükleri için uygulanabilir son olarak, bu iletişim kuralı çok protein-protein etkileşimi kapsamıdır onların hücre içi etki mekanizmaları.

Protein-protein etkileşimleri çok çeşitli hücresel süreçler için gereklidir. Bu işlemler tamamen anlamak için yöntemleri protein etkileşimleri karmaşık hücre içi ortamda tanımlamak için gereklidir. Bir protein etkileşim ortakları tanımlamak için en çok kullanılan yöntemlerden birini protein veya benzeşme açılan deneylerde proteinler algılama tarafından takip yem olarak protein bir parçası bir mimetic peptid kullanmaktır. Avidin-biotin sistemi yüksek afinite, özgüllük ve avidin ve biotin1,2arasında istikrarlı etkileşim nedeniyle sık sık kullanılır. Genellikle, biotin kovalent yemi (protein veya peptid) bağlıdır ve kuluçka etkileşim kurulmasını sağlamak için hücre lysates ile bir süre sonra hücre içi ortaklarına bağlı biotinylated yem avidin veya avidin aşağı çekti türevleri destek boncuk ile Birleşik. Sonra yem-protein etkileşimleri çamaşır, elüsyon ve analiz sonra Western blot tarafından takip Elektroforez denaturing tarafından tespit edilir. Bu teknik sorunlardan biri faiz protein ve hücre içi ortakları arasındaki etkileşimler hücresel bağlamı dışında yer alıyor olduğunu. Çünkü belirli hücre içi yerlerde gerçekleşecek, onlar geçici ve onlar genellikle değil bol proteinler tarafından yürütülmektedir sinyal iletim yollarının içinde ilgili etkileşimleri için önem kazanır. Bu nedenle, hücre lysates içinde bu etkileşimler daha bol diğer proteinler veya genellikle yakın değildir proteinler maskelenebilir.
Hücre Penetran peptidler (CPPs) kısa peptidler (≤40 amino asitler), hemen hemen her hücre3içine moleküllerin çeşitli taşıma kapasitesine sahip Katyonik amino asitler tarafından çoğunlukla oluşan vardır. Proteinler, plazmid DNA, siRNA, virüs, görüntüleme ajanlar ve çeşitli nano tanecikleri gibi yükleri CPPs ve verimli bir şekilde içselleştirilmiş4,5Birleşik. Bu taşıma yeteneği nedeniyle onlar da protein iletim etki alanları (PTDs), membran translocating dizileri (MTSs) ve Truva peptidler verilir. CPPs arasında TAT peptid TAT6 biri en yaygın olmuştur HIV transactivator protein üzerinden 7,8,9okudu. TAT 6 arginin ve 2 lizin kalıntılar içeren ve sonuç olarak son derece Katyonik bir nonapeptide var. İkame çalışmalar TAT pozitif net ücretten ökaryotik hücreler ve onun sonraki içselleştirilmesi10plazma membran ile Elektrostatik etkileşimler için gerekli olduğunu gösterdi. Benzer şekilde diğer CPPs için olumlu tahsil TAT şiddetle Elektrostatik çeşitli olumsuz ücret türü hücre zarlarında lipid kafa grupları, glikoproteinlerin ve Proteoglikanlar3 de dahil olmak üzere, için hücre dışı yüzeyde mevcut bağlar , 10. TAT tarafından taşınan biyoaktif yükleri sitozol hücre içi eşleri ulaşmak için hemen serbest hale.
Burada TAT CPP hücre içi etkileşimler çalışmaya biotin ile birleştirir bir yöntem mevcut. Amaç hedef biomolecule TAT ve biotin eritme tarafından hücre Penetran yemler tasarlamaktır. Bu öneri büyük avantajı yem ve ortakları arasındaki etkileşimler hücresel bağlamı içinde gerçekleşecek olduğunu. Bu yöntemin etkinliğini göstermek için protein ile proto-oncogene c-Src11,12,13intracellularly etkileşimine bildirilmiştir Cx43 küçük bir dizi yem olarak kullanılır. Cx43 astrocytes14' te yaygın olarak ifade edilir ve aşağı-yüksek dereceli gliomas düzenlenmiş bir integral membran proteini en sık görülen malign tümör merkezi sinir sistemi15,16,17 olduğunu ,18. Bu daha önce gösterilen bu c-Src (amino asitler 266-283 insan Cx43; ın etkileşim Cx43 bölge PubMed: P17302) erimiş (TAT-Cx43266-283) TAT için c-Srcin tümörü hücreleri oncogenic aktivitesini inhibe ve tümörü kök hücreleri (GSCs)19,20,21. Hücre içi yem tasarlamak için Cx43266-283 N-terminus (TAT-Cx43266-283), TAT ve biotin C-terminus adlı eritti (TAT-Cx43266-283- B). Bu stratejiyi başarıyla sıçan gliyom C6 hücre kültürünü c-Src, c-terminal Src kinaz (CSK) ve fosfataz ve homolog (PTEN) bu bölge Cx4320hücre içi ortağı olarak tensin tanımlamak için kullanılmıştır. Burada, tümörü tedavisi için ama daha zor daha olmayan kök gliyom hücre transfect için çok ilgili insan GSCs kendi etkinliğini test bu yöntem açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>G166 GSC hattı</td><td>BioRep</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RHB-A kök hücre ortamı</td><td>Takara</td><td>Y40001</td><td></td></tr><tr><td>Laminin Fare Proteini</td><td>İnvitrojen, Yaşam Teknolojileri, ThermoFisher Scientific</td><td>23017-015</td><td>10 & g/ml</td></tr><tr><td>B-27 Serum İçermeyen Takviye Edici Gıda (50X)</td><td>Canlandırıcı, Yaşam Teknolojileri, ThermoFisher Scientific</td><td>17504-044</td><td>%2</td></tr> <tr><td>N-2 Takviyesi (100x)</td><td>Canlandırıcı, Yaşam Teknolojileri, ThermoFisher Scientific</td><td>17502-048</td><td>%1</td></tr> <tr><td>Rekombinant İnsan EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan b-FGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-18B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4: Deiyonize suda, 136 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2HPO4 ve orta nokta; 2H2O ; 1.7 mM KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10 kriyoprezervasyon ortamı</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>7930</td><td></td></tr><tr><td>TAT</td><td>GenScript-Özel</td><td></td> <td>yapım</td></tr><tr><td>TAT-B</td><td>GenScript-Özel</td><td></td> <td>yapım</td></tr><tr><td>TAT-Cx43266-283</td><td>GenScript-Özel</td><td></td> <td>yapım</td></tr><tr><td>TAT-Cx43266-283-B</td><td>GenScript-Özel</td><td></td> <td>yapım</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td><td>Moleküler Problar, Yaşam Teknolojileri, ThermoFisher Scientific</td><td>A1275737</td><td>1/20</td></tr><tr><td>Monoklonal & alfa; -tubulin fare antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td>1/500</td></tr><tr><td>4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td> <td>Moleküler Problar, Yaşam Teknolojileri, ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>1.25 mg/ml</td></tr><tr><td>Pierce & trade; NeutrAvidin ve ticaret; Agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>29200</td><td></td></tr><tr><td>Protein lizis tamponu: 5 mM Tris-HCl (pH 6.8), %2 (a/h) SDS, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyl Seti III. EDTA İçermeyen</td><td>Calbiochem, Bionova</td><td>539134</td><td>1/100 (h/h)</td></tr><tr><td>Sodyum Florür</td><td>PanReac AppliChem</td><td>141675</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>Fenilmetansülfonil florür (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>Sodyum ortovanadat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td>0,1 mM</td></tr><tr><td>Laemmli tamponu: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M gliserol; %3.7 (a/h) SDS; 0.6 M beta;-merkaptoetanol veya 9 mM DTT; %0.04 (h/h) bromofenol mavisi (BB).</td><td></td><td></td><td>1X</td></tr><tr><td>Xcell 4 SureLock Midi-Cell Elektroforez Sistemi</td><td>Yaşam Teknolojileri, ThermoFisher Scientific</td><td>WR0100</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex Bis-Tris Midi-Jeller 4-12%</td><td>Life Teknolojileri, ThermoFisher Scientific</td><td>WG1402box</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Çalıştırma Tamponu (20X)</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>NP0001</td><td>1X</td></tr><tr><td>NuPAGE Aktarım Tamponu 20x</td><td>Yaşam Teknolojileri, ThermoFisher Scientific</td><td>NP0006</td><td>1X</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Çift Renk Standardı</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 NC Düzenli Yığınlar (nitroselüloz membranlar)</td><td>Yaşam Teknolojileri, ThermoFisher Scientific</td><td>IB23001</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Kuru Kurutma Sistemi - Jel transfer cihazı</td><td>Yaşam Teknolojileri, ThermoFisher Scientific</td><td>IB21001</td><td></td></tr><tr><td>Suda %10 Ponceau S Çözeltisi (%0.1 Ponceau (a/h)) %5 asetik asit (h/h))</td><td>içinde Sigma</td><td>P7170</td><td></td></tr><tr><td>FAK poliklonal tavşan antikoru</td><td>Yaşam Teknolojileri, ThermoFisher Scientific</td><td>AHO0502</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Src poliklonal tavşan antikoru</td><td>Hücre Sinyali (WERFEN)</td><td>2108S</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Csk poliklonal tavşan antikoru</td><td>Hücre Sinyali (WERFEN)</td><td>4980</td><td>1/500</td></tr><tr><td>PTEN poliklonal fare antikoru</td><td>Hücre Sinyali (WERFEN)</td><td>9552</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Caveolin-1 poliklonal tavşan antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab2910</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgG-HRP antikoru</td><td>Quimigen, Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>Sc-2005</td><td>1/5000</td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan IgG-HRP antikoru</td><td>Quimigen, Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-2030</td><td>1/5000</td></tr><tr><td>Western Blotting Luminol Reaktif</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-2048</td><td></td></tr><tr><td>Src poliklonal tavşan antikoru</td><td>Hücre Sinyali (WERFEN)</td><td>2108S</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Antikor çözeltisi: PBS, %10 FBS, 0.1 M lizin, %0.02 sodyum azid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG</td><td>Invitrogen, Yaşam Teknolojileri, ThermoFisher Scientific</td><td>A11029</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Cy2-konjuge streptavidin</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-220-089</td><td>1/500</td></tr><tr><td>MicroChemi Lüminesans sistemi</td><td>DNA Biyo-Görüntüleme Sistemleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Annexin V Alexa Fluor & reg; 488 & ile Ölü Hücre Apoptoz Kiti Propidyum İyodür (PI)</td> <td>Moleküler Problar, Yaşam Teknolojileri, ThermoFisher Scientific</td><td>V13241</td><td>1/500</td></tr><tr><td>SlowFade Gold antifade reaktifi</td><td>Yaşam Teknolojileri, ThermoFisher Scientific</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>Tiazolil Mavi Tetrazolyum Bromür (MTT)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>UV spektroskopisi için Dimetil sülfoksit, >=%99,8 (GC)</td><td>Honeywell</td><td>41641-1L</td><td></td></tr><tr><td>Uygulama 2001</td><td>Termo Elektron Şirketi, Termo Bilimsel</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İntraselüler protein-protein etkileşimleri çalışmaya biotinylated hücre penetran peptidler

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Burada yaygın olarak kullanılan biotin-avidin açılan sistemi temelinde intraselüler protein-protein etkileşimleri çalışma Protokolü mevcut. Sunulan değişiklik bu teknik hücre Penetran serileri ile kombinasyonu içerir. Canlı hücreler yerine hücre lysates ile inkübe hücre Penetran yemler tasarım için teklif ve bu nedenle bulundu etkileşimleri hücre içi bağlamı içinde ortaya yansıtır. Connexin43 (Cx43), formları gap junction kanalları ve hemichannels bir protein yüksek kalitede gliomas aşağı düzenlenir. Amino asitler 266-283 oluşan Cx43 bölge c-Src gliyom hücrelerdeki oncogenic aktivitesinin inhibisyonu için sorumludur. Burada TAT hücre Penetran sıralaması, biotin açılan etiket ve amino asitler 266-283 insan gliyom zor transfect kök hücre hücre içi etkileşimler bulmak için hedef olarak arasında oluşan Cx43 bölge olarak kullanırız. Önerilen yöntem sınırlamaları gibi yem fold düzgün ve sonuç olarak başarısız kullanılan molekül bulundu etkileşimleri etkisi ile ilişkili olamazdı biridir. Ancak, onlar genellikle özünde düzensiz bölgeler tarafından yapılır ve bu nedenle, onlar bir sıralı katlama gerek yoktur çünkü bu yöntem özellikle ilginç etkileşimleri sinyal iletim yollarının içinde dahil olabilir. Ayrıca, önerilen yöntemin avantajları, etkileşimin her kalıntı alaka kolayca okudu biridir. Bu modüler bir sistemdir; Bu nedenle, diğer hücre Penetran dizileri, diğer etiketleri ve diğer hücre içi hedefleri istihdam edilebilir. Çünkü bu sistem RNA dizileri, nano tanecikleri, virüsler veya hücre Penetran dizileri ile transduced herhangi bir molekül gibi biyoaktif diğer yükleri için uygulanabilir son olarak, bu iletişim kuralı çok protein-protein etkileşimi kapsamıdır ve onların hücre içi etki mekanizması çalışmaya açılan Etiketler erimiş.

Hücre içi etkileşim çalışmaya BCPPs kullanmadan önce BCPP vs BCPP ile elde edilen sonuçları doğrulamak için CPP etkileri karşılaştırmak için önemlidir. Sonuç olarak, hedef sıra aktivite dahil biotin değiştirir olup olmadığını incelemek için biz ilk TAT-Cx43266-283etkisini analiz -B karşılaştırıldığında TAT-Cx43266-283 G166 GSCs Morfoloji tarih ile. Bunu yapmak için bazı ayirt analizleri iki hücre iskeleti proteinleri, F-aktin ve α-tübülin tedavinin 24 saat sonra yapılır. Şekil 1 gösterir bu G166 GSCs 50 µM TAT-Cx43266-283 veya TAT-Cx43266-283huzurunda -B denetim (TAT veya TAT-B) gösterilen daha uzun ve genişletilmiş hücresel prolongations kıyasla daha yuvarlak bir şekil almak. Aslında, Şekil 1b hücreleri TAT-Cx43266-283 veya TAT-Cx43266-283ile tedavi edildi zaman aktin filamentleri çoğunlukla aktin ağlar olarak monte edilir gösterir -B sahipken onlar kontrol hücreleri daha fazla aktin demetleri (TAT ile tedavi veya TAT-B)25. Buna ek olarak, α-tübülin dağıtım arasında farklı koşulları farklı değil. Bu sonuçlar biotin varlığı hedef sıra etkisi G166 GSCs Morfoloji değiştirmek değil gösterdi. Önceki çalışmalar20,21', TAT-Cx43266-283 G166 GSCs yayılması azalma göstermiştir. Bu çalışmada, biz araştırdık olup olmadığını TAT-Cx43266-283- B giderek artan büyüme TAT-Cx43266-283olarak aynı etkileri. Bunu yapmak için G166 GSCs yayılması MTT tahlil tarafından tedavi 72 h sonra analiz ettik. MTT tahlil hücre metabolik etkinliğini değerlendirmek için kolorimetrik bir tahlil olduğunu. MTT hücrelerin mevcut sayısı yansıtan mitokondri içinde NAD (P) H oxidoreductase enzimler tarafından metabolize edilir. Şekil 2 gösterir hücreleri 50 µM TAT-Cx43266-283 veya 50 µM TAT-Cx43266-283ile tedavi edildi zaman G166 GSCs hücre canlılığı azalma önemli ölçüde farklı olmadığını -d. Gerçekten de, her ikisi de önemli ölçüde azalmış G166 GSCs yayılma denetimi, TAT veya TAT-d. karşılaştırıldığında
Biz G166 GSCs (TAT-Cx43266-283) bizim hedef sırada etkisini dahil biotin C-terminus adlı tarafından değiştirilmedi onayladıktan sonra (TAT-Cx43266-283- B), biz bu dizi hücre içi ortaklarının araştırdık Protokol sonrası açıklanan bu çalışmada (şekil 3). Caveolae dahil çünkü TAT içselleştirilmesi26yönteminde, caveolin-1 (Cav-1) çekme-çıkışlar'varlığı analiz ettik. Western blot analizi (şekil 4) gösterdi o TAT-B ve TAT-Cx43266-283- B Cav-1 ile etkileşim. Ancak, TAT-Cx43266-283yeteneği -B-c-Src, PTEN ve CSK askere TAT-b ile bulunan daha güçlü Odak yapışma kinaz (FAK) Cx43 ile etkileşim gösterilen değil c-Src substrat var. Nitekim, FAK TAT-B ya da TAT-Cx43266-283önemli herhangi bir etkileşim yoktu -d.
TAT-Cx43266-283arasındaki etkileşimi onaylamak için -B ve c-Src, G166 GSCs inkübe ile 50 µM TAT-Cx43266-283- B 30 dk ve onların yerelleştirme için confocal mikroskobu (şekil 5 ile floresan streptavidin izledi ). Bizim sonuçları gösterdi ki hücre içi dağıtım TAT-Cx43266-283- B plazma zarı (Fosfatidilserin boyama tarafından gösterilen) yakındır ve c-Src ile eşleşecek. Aslında, co yerelleştirme analizleri co yerelleştirme (beyaz) arasında TAT-Cx43266-283bazı noktaları ortaya -B ve c-Src birleştirme görüntü. Sonuç olarak, confocal mikroskobu çalışmalar bu çalışmada açıklanan BCPP açılan iletişim kuralı ile elde edilen sonuçları desteklemektedir.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig1.jpg"> 
Resim 1: BCPP ve CPP üzerindeki etkisini GSC morfolojisi. G166 GSCs düşük yoğunluklu kaplama (2 x 104 hücreleri / cm2) ve BCPP (TAT-B), tedavi CPP (TAT-Cx43266-283) ya da tedavi BCPP onlar 50 µM denetim CPP (TAT) ile inkübe 24 saat sonra kontrol (TAT-Cx43266-283- B) . a) F-aktin (kırmızı), α-tübülin (yeşil) ve birleştirilmiş + G166 GSCs Morfoloji gösteren aynı alanın DAPI immunostaining. Barlar 50 µm. b =) F-aktin immunostaining F-aktin G166 GSCs sonra kuluçka için 50 µM ile 24 saat içinde farklı dağılımını gösteren CPP (TAT) kontrol ya da BCPP (TAT-B) ile karşılaştırıldığında 50 µM tedavi CPP (TAT-Cx43266-283) veya BCPP (TAT-Cx43 kontrol 266-283-B). Barlar 10 µm. = <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig2.jpg"> 
Resim 2: BCPP ve CPP üzerindeki etkisini GSC canlılığı. G166 GSCs 5500 hücreler/cm2 24-multiwell plakaları'de kaplama ve 50 µM denetim peptidler, CPP (TAT) veya BCPP (TAT-B), veya 50 µM tedavi peptidler, CPP (TAT-Cx43266-283) ya da BCPP ile inkübe (TAT-Cx43266-283- B). Hücre canlılığı bir ÇMT tahlil 72 h sonra kullanılarak analiz. Sonuçları MTT absorbances ifade edilir ve en az 3 deneyler ortalama ± s.e.m. vardır (++ p˂0.01 vs denetim. ** p˂0.01, *** TAT veya TAT-B p˂0.001 vs; tek yönlü ANOVA withTukey sonrası test). CPPs vs BCPPs. etkileri arasında önemli farklılıklar Not <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig3.jpg"> 
Resim 3: Protokol şeması. Eluted BCPPs ve onların etkileşen proteinler obtained.1 olana BCPPs bölümünü "Protokol", kuluçka üzerinden yordamda açıklandığı gibi adım adım grafik gösterimi) için istenen konsantrasyon BCPPs ile Kültür hücreleri kuluçkaya gerekli zaman. 2) sırasında kuluçka BCPPs içselleştirilmiş ve hücre içi eşleri ile etkileşim. 3) hücreleri üç kez on Ice buz gibi PBS ile yıkayın. 4) proteinler ayıklamak için hücreleri parçalayıcı. 5) hücre lysates tüpler için transfer.6) 11000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de spin 7) «««tüp (B) transfer örnekleri yeni tüpler (A) ve devam düzenli Western işlemek için lysates küçük bir aliquot supernatants leke. 8) resuspend NeutrAvidin özel boncuk ve 50 µL her tüp kesme pipet ucu kullanarak ekleyin. 9) 12 h 4 ° C'de NeutrAvidin özel boncuk BCPPs ve eşleri ile etkileşimine izin vermek için hafifçe sallayarak ile kuluçkaya. 10) boncuk biotinylated ile cips için spin için 1 dk 3000 x g , Yemler ve onların etkileşen proteinler onlara bağlı. 11) transfer supernatants yeni tüpler (C) ve aşağı açılır gerekebileceğinden yinelenmesi kullanmak üzere saklayın. 12) Pelet beş kez taze lizis arabelleği ile yıkayın, inversiyon, 1 dk, 3000 x g tur tarafından resuspend ve süpernatant atın. 13) tüm süpernatant dikkatli bir şekilde çıkarın. 14) 4 x Laemmli Arabellek istenen birim ekleme ve proteinler için 5 dk. 15 100 ° C'de elute) Spin, 8200 x g 30 s boncuk cips. 16) bulunan süpernatant kapiller keyif-e doğru yeni tüpler (D) ile eluted proteinler aktarın. 17) Western blot analizi için jeller üzerine yükleyin. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig4.jpg"> 
Şekil 4: Çalışma TAT-Cx43266-283hücre içi etkileşimlerinin -B G166 GSCs tarafından açılan takip tarafından Western blot. G166 GSCs 50 µM TAT-B veya TAT-Cx43266-283ile inkübe -d. Sonra 30 dk hücreleri lysed ve TAT-B ya da TAT-Cx43266-283- B hücre içi eşleri bağlı indirdi NeutrAvidin boncuk ile. Eluted protein yüklü ve Western blot tarafından FAK, c-Src, CSK, düzeyde çalışmaya analiz PTEN ve Cav-1. CAV-1 her iki TAT-B ile etkileşim ve TAT-Cx43266-283- B, c-Src, PTEN ve CSK etkileşim tercihen ile TAT-Cx43266-283- B ve FAK Not TAT-B ya da TAT-Cx43266-283herhangi bir etkileşimi göstermektedir değil-B. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig4large.jpg" target="_blank">lütfen Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig5.jpg"> 
Şekil 5: TAT-Cx43266-283- B hücre içi etkileşimler G166 GSCs confocal mikroskobu tarafından doğrulanması. G166 GSCs 50 µM TAT-Cx43266-283ile inkübe -d. 30 dakika sonra hücreleri sabit ve TAT-Cx43266-283yerelleştirmek için işlenen -B ile Cy2-Streptavidin (yeşil), c-Src ayirt (kırmızı) ve V (mavi) annexin ile Fosfatidilserin. Co yerelleştirme (beyaz) arasında TAT-Cx43266-283bazı noktalara dikkat edin -B ve c-Src plazma zarı birleştirme görüntüleri yakın. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Bu hücre Penetran dizileri birleştirme biotin avidin açılan yenilik ile tabanlı sisteme intraselüler protein-protein etkileşimleri çalışmaya bir protokoldür. Ana avantajdır hedef sıra canlı hücreler yerine hücre lysates ile inkübe ve bu nedenle etkileşimleri hücresel bağlamı içinde ortaya çıkar.

İntraselüler Protein-protein etkileşimleri çalışmaya Biotinylated hücre Penetran peptidler

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Bu prosedürün genel amacı, protein-protein etkileşimlerini hücre içi bağlamda incelemektir. Bu, kendi kendine nüfuz eden dizilerle birleştirilmiş bir biyotin-avidin aşağı çekme sistemi ile elde edilir ve hedef dizide canlı hücrelerle inkübasyona izin verir. Bu yöntem, belirli sinyalleri elde etmek için biyomoleküller arasındaki hızlı ve dinamik etkileşimler gibi hücre sinyalleme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin temel avantajı, moleküler etkileşimlerin hücre içi bir bağlamda gerçekleşmesidir. Bu çalışmada, insan G166 glioma kök hücreleri veya GSC'ler metin protokolünde tarif edildiği gibi 150 santimetre karelik dört şişeye plakalandırılmıştır. Birleşmeye ulaşıldığında hücreleri işleyin.Beş milyon G166 hücresi 150 santimetre karelik bir şişeye katlandığında, kaplamadan iki gün sonra işlenir. Kapakta kalan tozun bir kısmını önlemek için liyofilize biyotinile hücreye nüfuz eden peptitleri içeren şişeleri 30 saniye boyunca 8, 200 kez g'de döndürün. Bulunan etkileşimlerin hedef diziye özgü olduğundan emin olmak için kontrollü bir BCPP ekleyin.Ardından, BCPP'leri ilgili kültür ortamında üretici tarafından belirtilen stok çözeltisine çözün. GSC'leri tedavi etmek için mililitre BCPP başına iki miligramlık bir stok çözeltisi elde etmek için, bir miligram BCPP içeren bir şişeye 0.5 mililitre GSC kültür ortamı ekleyin. Şişeleri vorteksleyin ve peptidin iyi çözündüğünden emin olun.Yapılacak pull-down testinde koşul başına en az 12 adet 1.5 mililitre tüp hazırlayın. Koşul başına ilk üç tüpü işaretleyin. Hücresel lizatların toplam hacmine sahip olacaklar.Ardından, koşul başına üç tüpte bir A işaretleyin. Bu tüpler, hücresel lizatların parçalanmasından ve döndürülmesinden sonra elde edilen ilk süpernatanlara sahip olacaktır. Ardından, koşul başına üç tüpte bir B işaretleyin.Bu tüpler, batı lekesi örnekleri için ilk süpernatanların küçük bir alikotuna sahip olacaktır. Son olarak, koşul başına üç tüp üzerinde bir C işaretleyin. Bu tüpler, NeutrAvidin ile aşağı çekildikten sonra elde edilen süpernatantlara sahip olacaktır.Kültür ortamını hücrelerden aspire ettikten sonra, BCPP'leri inkübasyon sürelerine göre mümkün olan en küçük hacimde besiyerinde inkübe etmek için gereken karşılık gelen hacimdeki taze besiyeri ile değiştirin. Her durumda, ortamın şişenin tüm yüzeyini tamamen kaplaması çok önemlidir. Etkili olduğu kanıtlanmış konsantrasyona ulaşmak için BCPP'nin stok çözeltisinin hacmini hücre kültürlerine ekleyin.Bu nedenle, mililitre kültür ortamı başına mililitre TAT-connexin 43 266-283 biotin başına 92.8 mikrolitre iki miligram ekleyin. BCPP ve hücre içi ortakları arasındaki etkileşimlerin gerçekleştiğinden emin olmak için hücreleri 30 dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübatöre yerleştirin. Protein ekstraksiyonunu gerçekleştirmek için, önce kültür ortamını tamamen aspire edin, daha sonra hücreleri, kendi kendine ayrılmayı önlemek için 150 santimetrede 10 mililitre buz gibi soğuk fosfat tamponlu tuzlu su ile çok dikkatli bir şekilde yıkayın.Hücre lizatını elde etmek için, 150 santimetrekare şişeye üç mililitre lizis tamponu ekleyin ve bir hücre kazıyıcı kullanarak yüzeyi iyice kazıyın. Şişeyi yaklaşık 45 dereceye kadar eğmek, hücre lizatlarının karşılık gelen tüplerine toplanmasını kolaylaştıracaktır. Tüp başına bir mililitre hücresel lizat, koşul başına işaretlenmiş üç adet 1.5 mililitrelik tüpe dökün.Aşağı çekmek için, 1.5 mililitrelik tüpleri 11.000 kez g'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanları A etiketli yeni tüplere aktarın. Daha sonra, 50 mikrolitre lizat için 16.6 mikrolitre 4x Laemmli tamponu ekleyin ve eksi 20 santigrat derecede dondurun. Daha sonra, NeutrAvidin agarozunu hafifçe çalkalayarak çok iyi homojenize edin.Çaplarını artırmak ve boncukların pipetlenmesini iyileştirmek için pipet uçlarının uçlarını kesin. Daha sonra, A tüplerinde mililitre hücre lizatı başına 50 mikrolitre NeutrAvidin agaroz ekleyin. NeutrAvidin'in hücre içi ortaklarına bağlı BCPP'lerle etkileşime girmesine izin vermek için hücre lizatlarını gece boyunca dört santigrat derecede çok hafif çalkalama ile inkübe edin.Daha sonra, NeutrAvidin kompleksini proteinlerle toplamak için dört santigrat derecede bir dakika boyunca 3.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanları dikkatlice çıkarın ve bunları C etiketli temiz tüplere aktarın. NeutrAvidin kompleksini proteinlerle yıkamak için, A tüplerinin topaklarına taze lizis tamponu ekleyin.Peleti ters çevirerek yeniden süspanse edin ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Bu yıkamayı beş kez daha tekrarlayın. Bütün bu süpernatantlar atılabilir.Daha sonra, 150 santimetre karelik birleşik hücre şişelerinden elde edilen peletler için 1,5 mililitrelik tüp başına 40 mikrolitre 2x Laemmli tamponu ekleyin. Ardından, proteinler arasındaki etkileşimleri ayırmak için beş dakika boyunca 100 santigrat derecede elüte edin. Elüsyonu takiben, NeutrAvidin boncuklarını peletlemek için 8.200 kez g'de 30 saniye santrifüjleyin.Ayrışmış proteinleri içeren süpernatantları kılcal uçlarla D etiketli yeni tüplere aktarın.Bu süpernatanlar artık metin protokolünde açıklandığı gibi bir batı lekesine yüklenmeye hazırdır veya eksi 20 santigrat derecede dondurulabilir. Burada, biyotinin TAT-connexin 43 266-283'e füzyonunun, hücreye nüfuz eden peptidin glioma kök hücre morfolojisi üzerindeki etkilerini değiştirmediğini gösteren immünositokimya görüntüleri gösterilmektedir. BCPP veya CPP ile muamele edilen GSC'nin MTT analizi, biyotinin TAT-connexin 43 266-283'e füzyonunun, TAT-connexin 43: 266-283'ün GSC üzerindeki anti-proliferatif etkisini değiştirmediğini göstermektedir.Bir BCPP pull-down'ın temsili sonuçları ve ardından western blot burada gösterilmektedir. Western blot, TAT ile etkileşime girdiği açıklanan proteinlerin, örneğin Cav-1'in her iki durumda da ortaya çıktığını göstermektedir. Cx43 ile etkileşime girdiği açıklanan proteinler, örneğin, c-Src ve PTEN, TAT-connexin 43 266-283 aşağı çekildikten hemen sonra ortaya çıkarken, Cx43 veya TAT ile doğrudan etkileşime girmeyen proteinler, örneğin FAK mevcut değildir.Konfokal mikroskopi görüntüleri, BCPP'lerle bulunan hücre içi etkileşimleri doğrular. Görüntüler, G166 GSC'lerde TAT-connexin 43 266-283'ün plazma membranına yakın c-Src ile hücre içi kolokalizasyonunu göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa iki gün içinde yapılabilir.Bu prosedürü denerken, peptitleri eklemeden önce reaktiflerin ve santrifüjün sıcaklığının yanı sıra hücrelerin birleştiğini doğrulamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, biyotinile hücreye nüfuz eden peptitler kullanarak hücre içi protein-protein etkileşimlerini nasıl inceleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Geliştirildikten sonra, bu teknik, kültür hücrelerinde, organotipik kültürlerde ve hatta in vivo modellerde hücre içi moleküler mekanizmaları ve bunların çizgiye özgü yolaklarını keşfetmek için hücre sinyalizasyonu alanındaki araştırmaların önünü açmaktadır.Bu prosedürü takiben, hücre içi etki mekanizmalarını incelemek için hücre içi etki mekanizmalarını incelemek için RNA dizileri, nanopartiküller, virüsler veya hücreye nüfuz eden peptitlerle transfüze edilebilen ve aşağı çeken TAT'lara kaynaştırılabilen diğer moleküller gibi diğer biyoaktif kargolar kullanılabilir. Bu protokolde son derece tehlikeli maddeler yer almasa da, bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven ve laboratuvar önlüğü giymeyi unutmayın.

biotinylated-cell-penetrating-peptides-to-study-intracellular-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video kullanımı ile mikro-desenli yüzeyler, protein-protein etkileşimleri sonraki analizi ile deneyler gösterir. Bu yaklaşım, canlı hücreler protein etkileşimleri tespit etmek imkanı sunar ve kantitatif bilgileri ayıklamak imkanı ile yüksek verimlilik özellikleri bir araya getiriyor.

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Bu videoda, hücre içi protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için biyotinile hücreye nüfuz eden peptitlerin kullanıldığı bir teknik gösterilmektedir. Hücreye nüfuz eden peptitler, konjuge peptitin bir hücreye girmesini ve spesifik olarak etkileşen proteinlerine bağlanmasını kolaylaştırır. Biotin, avidin'e bağlandıktan sonra, etkileşen proteinlerin kompleksinin bir hücre lizatından saflaştırılmasına izin verir.

Protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için biyotinile hücreye nüfuz eden peptit probu

Bu video, başarılı içselleştirmeyi doğrulamak için biyotinilasyon ve ardından hücre lizisi, streptavidin bazlı protein ekstraksiyonu, denatürasyon ve Western blot analizi kullanarak fare kortikal astrositlerinde hedef protein içselleştirmesini değerlendirmek için bir yöntem gösterir.

Bir Biyotin Türevi Kullanılarak Hedef Yüzey Proteinlerinin İçselleştirilmesinin Değerlendirilmesi

Peptit dizisi taraması, protein-protein etkileşim bölgelerini tanımlamak için yüksek verimli bir testtir. Bu, bir hedef proteinin çoklu etkileşimlerinin haritalanmasına izin verir ve bir proteini hedef alan inhibitörler için bölgeleri belirlemek için bir yöntem olarak hizmet edebilir. Burada peptit dizilerini taramak ve analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz.

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Protein fonksiyonunu, uzay-zamansal hücre altı lokalizasyonunu ve protein-protein etkileşim ağlarını araştırmak için lokalizasyon ve afinite saflaştırma (LAP) etiketli indüklenebilir kararlı hücre hatları oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz.

Incelenmesi Protein Fonksiyonu, Spatiotemporal Yerelleştirme ve Protein Etkileşim Ağları için İndüklenebilir LAP-etiketli Kararlı Hücre Hatları

Böl-BioID, BioID yakınlık etiketleme tekniğine dayalı bir protein parçaları-uluslara tahlil için adım adım bir protokol sağlar. İki verilen protein etkileşimi harekete geçirmek, o kendi yerel hücresel ortamlarında içerik bağımlı protein kompleksleri proteomik analiz sağlar. Yöntemi basit, uygun maliyetli ve yalnızca standart Laboratuar donanımları gerektirir.

Split-BioID — Proteomik analiz onların yerel hücresel ortamında içeriğe özel Protein kompleksleri

Bu protokol, inositol fosfatlar veya fosfoinositidler bağlayan proteinlerin tanımlanması üzerinde duruluyor. Bu etanol veya manyetik boncuklar için streptavidin üzerinden immobilize olan biyotinlenmiş inositol fosfatlar veya fosfoinositidler ile benzeşme Kromatografi kullanır. Inositol fosfat veya fosfoinositide bağlayıcı proteinler Batı lekesi veya kütle spektrometresi ile tanımlanır.

Inositol fosfat veya Phosphoinositide etkileşim proteinleri yakınlık Kromatografi Batı Blot veya kütle spektrometresi ile bağlantılı olarak tanımlanması

Floresan sızıntı tahlili, peptit/membran etkileşimlerinin araştırılmasını sağlayan basit bir yöntemdir, böylece çeşitli biyolojik süreçlere dahil olmaları ve özellikle hücre nüfuz eden peptitlerin doğrudan hücresel translokasyon işlemi sırasında fosfolipid bilayerleri rahatsız etme yeteneği.

Hücre Delici Peptit ile Membran Dengesizleşmesini Araştırmak için Floresan Sızıntı Tahlil

Doğası gereği düzensiz birçok proteinin, çok sayıda hücresel süreç için önemli bir davranış olan oldukça dinamik biyomoleküler kondensatların oluşumuna katıldığı gösterilmiştir. Burada, canlı hücrelerdeki biyomoleküler kondensatlarda proteinlerin birbirleriyle etkileşime girdiği dinamikleri ölçmek için tek moleküllü görüntüleme tabanlı bir yöntem sunuyoruz.

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

Protokol, ilgilenilen bir proteine kaynaşmış bir biyotin ligaza yakınlıklarına dayalı olarak biyotinin proteinlere in vivo kovalent bağlanması için bir yöntem sunar. Bu modifikasyon, protein etkileşim çalışmalarında gerektiği gibi streptavidin boncukları kullanılarak proteinlerin seçici olarak zenginleştirilmesine izin verir.

İn vivo Paramecium tetraurelia'da Protein Etkileşim Çalışmaları için Yakınlık Biyotinilasyonu

Öğrenin, biyotinle işaretlenmiş hücre penetrasyon peptidleri kullanarak G166 glioma kök hücrelerinde intraselüler protein-protein etkileşimlerini incelemeyi. Bu yöntem, hücre içi bağlamda moleküler etkileşimleri canlı hücrelerde çalışmanıza olanak tanır.

İntraselüler Protein-protein etkileşimleri çalışmaya Biotinylated hücre Penetran peptidler

Daha fazla video keşfet