İntraselüler Protein-protein etkileşimleri çalışmaya Biotinylated hücre Penetran peptidler

Bu prosedürün genel amacı, protein-protein etkileşimlerini hücre içi bağlamda incelemektir. Bu, kendi kendine nüfuz eden dizilerle birleştirilmiş bir biyotin-avidin aşağı çekme sistemi ile elde edilir ve hedef dizide canlı hücrelerle inkübasyona izin verir. Bu yöntem, belirli sinyalleri elde etmek için biyomoleküller arasındaki hızlı ve dinamik etkileşimler gibi hücre sinyalleme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, moleküler etkileşimlerin hücre içi bir bağlamda gerçekleşmesidir. Bu çalışmada, insan G166 glioma kök hücreleri veya GSC'ler metin protokolünde tarif edildiği gibi 150 santimetre karelik dört şişeye plakalandırılmıştır. Birleşmeye ulaşıldığında hücreleri işleyin.

Beş milyon G166 hücresi 150 santimetre karelik bir şişeye katlandığında, kaplamadan iki gün sonra işlenir. Kapakta kalan tozun bir kısmını önlemek için liyofilize biyotinile hücreye nüfuz eden peptitleri içeren şişeleri 30 saniye boyunca 8, 200 kez g'de döndürün. Bulunan etkileşimlerin hedef diziye özgü olduğundan emin olmak için kontrollü bir BCPP ekleyin.

Ardından, BCPP'leri ilgili kültür ortamında üretici tarafından belirtilen stok çözeltisine çözün. GSC'leri tedavi etmek için mililitre BCPP başına iki miligramlık bir stok çözeltisi elde etmek için, bir miligram BCPP içeren bir şişeye 0.5 mililitre GSC kültür ortamı ekleyin. Şişeleri vorteksleyin ve peptidin iyi çözündüğünden emin olun.

Yapılacak pull-down testinde koşul başına en az 12 adet 1.5 mililitre tüp hazırlayın. Koşul başına ilk üç tüpü işaretleyin. Hücresel lizatların toplam hacmine sahip olacaklar.

Ardından, koşul başına üç tüpte bir A işaretleyin. Bu tüpler, hücresel lizatların parçalanmasından ve döndürülmesinden sonra elde edilen ilk süpernatanlara sahip olacaktır. Ardından, koşul başına üç tüpte bir B işaretleyin.

Bu tüpler, batı lekesi örnekleri için ilk süpernatanların küçük bir alikotuna sahip olacaktır. Son olarak, koşul başına üç tüp üzerinde bir C işaretleyin. Bu tüpler, NeutrAvidin ile aşağı çekildikten sonra elde edilen süpernatantlara sahip olacaktır.

Kültür ortamını hücrelerden aspire ettikten sonra, BCPP'leri inkübasyon sürelerine göre mümkün olan en küçük hacimde besiyerinde inkübe etmek için gereken karşılık gelen hacimdeki taze besiyeri ile değiştirin. Her durumda, ortamın şişenin tüm yüzeyini tamamen kaplaması çok önemlidir. Etkili olduğu kanıtlanmış konsantrasyona ulaşmak için BCPP'nin stok çözeltisinin hacmini hücre kültürlerine ekleyin.

Bu nedenle, mililitre kültür ortamı başına mililitre TAT-connexin 43 266-283 biotin başına 92.8 mikrolitre iki miligram ekleyin. BCPP ve hücre içi ortakları arasındaki etkileşimlerin gerçekleştiğinden emin olmak için hücreleri 30 dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübatöre yerleştirin. Protein ekstraksiyonunu gerçekleştirmek için, önce kültür ortamını tamamen aspire edin, daha sonra hücreleri, kendi kendine ayrılmayı önlemek için 150 santimetrede 10 mililitre buz gibi soğuk fosfat tamponlu tuzlu su ile çok dikkatli bir şekilde yıkayın.

Hücre lizatını elde etmek için, 150 santimetrekare şişeye üç mililitre lizis tamponu ekleyin ve bir hücre kazıyıcı kullanarak yüzeyi iyice kazıyın. Şişeyi yaklaşık 45 dereceye kadar eğmek, hücre lizatlarının karşılık gelen tüplerine toplanmasını kolaylaştıracaktır. Tüp başına bir mililitre hücresel lizat, koşul başına işaretlenmiş üç adet 1.5 mililitrelik tüpe dökün.

Aşağı çekmek için, 1.5 mililitrelik tüpleri 11.000 kez g'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanları A etiketli yeni tüplere aktarın. Daha sonra, 50 mikrolitre lizat için 16.6 mikrolitre 4x Laemmli tamponu ekleyin ve eksi 20 santigrat derecede dondurun. Daha sonra, NeutrAvidin agarozunu hafifçe çalkalayarak çok iyi homojenize edin.

Çaplarını artırmak ve boncukların pipetlenmesini iyileştirmek için pipet uçlarının uçlarını kesin. Daha sonra, A tüplerinde mililitre hücre lizatı başına 50 mikrolitre NeutrAvidin agaroz ekleyin. NeutrAvidin'in hücre içi ortaklarına bağlı BCPP'lerle etkileşime girmesine izin vermek için hücre lizatlarını gece boyunca dört santigrat derecede çok hafif çalkalama ile inkübe edin.

Daha sonra, NeutrAvidin kompleksini proteinlerle toplamak için dört santigrat derecede bir dakika boyunca 3.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanları dikkatlice çıkarın ve bunları C etiketli temiz tüplere aktarın. NeutrAvidin kompleksini proteinlerle yıkamak için, A tüplerinin topaklarına taze lizis tamponu ekleyin.

Peleti ters çevirerek yeniden süspanse edin ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Bu yıkamayı beş kez daha tekrarlayın. Bütün bu süpernatantlar atılabilir.

Daha sonra, 150 santimetre karelik birleşik hücre şişelerinden elde edilen peletler için 1,5 mililitrelik tüp başına 40 mikrolitre 2x Laemmli tamponu ekleyin. Ardından, proteinler arasındaki etkileşimleri ayırmak için beş dakika boyunca 100 santigrat derecede elüte edin. Elüsyonu takiben, NeutrAvidin boncuklarını peletlemek için 8.200 kez g'de 30 saniye santrifüjleyin.

Ayrışmış proteinleri içeren süpernatantları kılcal uçlarla D etiketli yeni tüplere aktarın.Bu süpernatanlar artık metin protokolünde açıklandığı gibi bir batı lekesine yüklenmeye hazırdır veya eksi 20 santigrat derecede dondurulabilir. Burada, biyotinin TAT-connexin 43 266-283'e füzyonunun, hücreye nüfuz eden peptidin glioma kök hücre morfolojisi üzerindeki etkilerini değiştirmediğini gösteren immünositokimya görüntüleri gösterilmektedir. BCPP veya CPP ile muamele edilen GSC'nin MTT analizi, biyotinin TAT-connexin 43 266-283'e füzyonunun, TAT-connexin 43: 266-283'ün GSC üzerindeki anti-proliferatif etkisini değiştirmediğini göstermektedir.

Bir BCPP pull-down'ın temsili sonuçları ve ardından western blot burada gösterilmektedir. Western blot, TAT ile etkileşime girdiği açıklanan proteinlerin, örneğin Cav-1'in her iki durumda da ortaya çıktığını göstermektedir. Cx43 ile etkileşime girdiği açıklanan proteinler, örneğin, c-Src ve PTEN, TAT-connexin 43 266-283 aşağı çekildikten hemen sonra ortaya çıkarken, Cx43 veya TAT ile doğrudan etkileşime girmeyen proteinler, örneğin FAK mevcut değildir.

Konfokal mikroskopi görüntüleri, BCPP'lerle bulunan hücre içi etkileşimleri doğrular. Görüntüler, G166 GSC'lerde TAT-connexin 43 266-283'ün plazma membranına yakın c-Src ile hücre içi kolokalizasyonunu göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa iki gün içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, peptitleri eklemeden önce reaktiflerin ve santrifüjün sıcaklığının yanı sıra hücrelerin birleştiğini doğrulamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, biyotinile hücreye nüfuz eden peptitler kullanarak hücre içi protein-protein etkileşimlerini nasıl inceleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Geliştirildikten sonra, bu teknik, kültür hücrelerinde, organotipik kültürlerde ve hatta in vivo modellerde hücre içi moleküler mekanizmaları ve bunların çizgiye özgü yolaklarını keşfetmek için hücre sinyalizasyonu alanındaki araştırmaların önünü açmaktadır.

Bu prosedürü takiben, hücre içi etki mekanizmalarını incelemek için hücre içi etki mekanizmalarını incelemek için RNA dizileri, nanopartiküller, virüsler veya hücreye nüfuz eden peptitlerle transfüze edilebilen ve aşağı çeken TAT'lara kaynaştırılabilen diğer moleküller gibi diğer biyoaktif kargolar kullanılabilir. Bu protokolde son derece tehlikeli maddeler yer almasa da, bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven ve laboratuvar önlüğü giymeyi unutmayın.