4.8: Hücre Yüzeyi Biyotinilasyon Testi

Hücre yüzey proteinlerinin biyotin ile etiketlenmesi, zar proteinlerinin düzenlenmesinde yer alan hücresel taşıma yollarını incelemek için güçlü bir araç sunar. Bir hücre, yüzeyde sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir protein seti tutar, böylece çeşitli sinyal yolları aracılığıyla hücre dışı bilgileri alabilir ve bunlara yanıt verebilir. Bir yutma süreci olan endositozun, bu hücre yüzey proteinlerinin içselleştirilmesine neden olarak düzenlenmesinde rol oynadığı öne sürülmektedir. Bu nedenle, bu proteinleri biyotin gibi ajanlarla endosite edilmeden önce etiketlemek, bilim adamlarının içselleştirmelerini ölçmelerine ve hücresel yollardaki rollerini incelemelerine yardımcı olur.

Bu videoda, hücre yüzeyi biyotinilasyon deneylerinin ilkelerini ve metodolojisini tartışacağız ve bilim adamlarının bugün bu yöntemi uyarlamanın bazı yollarını keşfedeceğiz.

Önce hücre yüzeyi biyotinilasyon testinin arkasındaki ilkeleri gözden geçirelim.

Daha önce de belirtildiği gibi, hücreler yüzey proteinlerinin uzay-zamansal yoğunluğunu ve dağılımını düzenlemek için endositik yollar kullanır. İçselleştirilmiş proteinler, belirli hücresel yollar yoluyla taşınır, daha sonra ya bozunma için lizozoma şöntlenebilir ya da sürekli aktivite için hücre yüzeyine geri dönüştürülebilirler. Hücre yüzeyi biyotinilasyonu bu süreçleri ölçmek için tasarlanmıştır.

Bu tahlilde kullanılan etiket, H vitamini olarak da bilinen biotin, küçük, suda çözünür bir moleküldür. Yüzey etiketleme deneyleri için yaygın olarak kullanılan bir biyotin türevi, sülfo grubu, N-hidroksi süksinimid ester grubu, disülfid bağı ve tabii ki biotin'den oluşan sülfo-NHS-SS-biotin'dir. Biyotini "B" harfiyle değiştirerek bu devasa yapıyı basitleştirelim.

Bu yapıdaki sülfo grubu, bu biyotin zarı formunu geçirimsiz kılan güçlü bir yük verir. Hücre yüzey proteinlerinin etiketlenmesi, endositozu kısıtlayıcı bir sıcaklıkta tutulan hücrelere sülfo-NHS-SS-biyotin eklenerek yapılır. NHS grubu, yüzey proteinleri üzerindeki birincil aminlerle reaksiyona girerek kovalent bağlar oluşturur.

Daha sonra, etiketli hücreler, etiketli proteinlerin bir kısmının içselleştirileceği endositoza izin veren bir sıcaklığa taşınır. Son olarak, hücreler endositozu durdurmak için kısıtlayıcı sıcaklığa geri taşınır. İçselleştirilmiş proteinleri spesifik olarak ölçmek için, L-glutatyon gibi hidrofilik, zar geçirimsiz bir indirgeyici ajan eklenir. Bu, endositoza uğramamış sülfo-NHS-SS biyotini üzerindeki disülfür bağları ile reaksiyona girecek ve biyotin gruplarını parçalayacaktır. Bu noktada, kalan biyotinile proteinler, daha önce içselleştirildikleri için etiketleri indirgeyici ajandan korunan proteinlerdir.

Hücreler daha sonra parçalanır ve endositoza uğramış biyotinile proteinler niceliksel olarak ölçülmek üzere izole edilir. İzolasyon genellikle streptavidin ile kaplanmış sentetik boncuklara hücre lizatları eklenerek gerçekleştirilir. Streptavidin biotin için son derece yüksek bir afiniteye sahip olduğundan, biyotinile proteinler kendilerini kaplanmış boncuklara bağlar. Kirletici proteinleri uzaklaştırmak için bir dizi yıkama adımı ve son olarak bağlı proteinleri serbest bırakmak için bir elüsyon adımı gerçekleştirilir. Hedef proteinler daha sonra Western blotlama gibi tekniklerle analiz edilebilir.

Artık biyotinilasyon testinin arkasındaki kavramları bildiğinize göre, yüzey proteinlerinin endositozunu ölçmek için bu prosedürün nasıl gerçekleştirileceğini gösteren genelleştirilmiş bir protokole bakalım.

4 ° C'ye soğutulmuş kültürlenmiş hücrelerle başlayın. Endositozu kısıtlayan sıcaklığı korumak için onları buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, membran geçirimsiz sülfo-NHS-SS-biyotin reaktifi eklenir ve hücreler karanlıkta yaklaşık 30 dakika inkübe edilir. Bu, biyotin etiketlerinin yüzey proteinlerine kovalent olarak bağlanması için yeterli zaman sağlar. Hücreler daha sonra buzdan çıkarılır ve 37 ° C'de yaklaşık 30 dakika inkübe edilir. Bu sıcaklıkta, biyotinile yüzey proteinleri endositoze edilir. İnkübasyonun ardından hücreler 4°C'ye soğutulur ve L-glutatyon gibi hidrofilik bir indirgeyici ajan eklenir. Bu, disülfid bağları ile reaksiyona girer ve biyotin gruplarını etiketli, endositozlanmamış proteinlerden serbest bırakır.

Daha sonra, hücreler santrifüjleme ile parçalanır, böylece hücre zarları kırılır ve biyotinile edilmiş proteinler açığa çıkar. Bunu takiben, streptavidin kaplı boncuklara lizatlar eklenir ve biyotinillenmiş proteinlerin bağlanmasına izin verilir. Boncuklar soğuk fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkanır ve deterjanlar ve indirgeyici maddeler içeren bir tampon ile ayrıştırılır. Bu reaktifler, boncuklardan bağlı proteinleri denatüre eder ve elüatta geri kazanımlarını sağlar. Elüattaki proteinler, jel elektroforezi ile moleküler kütlelerine göre ayrılır. Son olarak, Western blotlama ve lekenin proteine özgü antikorlarla sondalanması, hedef proteinin görselleştirilmesine izin verir. Endositozlu protein yüzdesi, elde edilen bant yoğunluklarından ölçülebilir.

Artık hücre biyotinilasyonunun metodolojisini anladığınıza göre, belirli deneylerde nasıl kullanıldığına bakalım.

Bu biyotinilasyon protokolünün en yaygın uygulaması, spesifik hücre yüzey proteinlerinin endositik hızını ölçmektir. Burada, bilim adamları dopamin taşıyıcısının veya DAT'ın içselleştirilmesini değerlendirmekle ilgilendiler. Standart protokolü izleyerek, bilim adamları endositozlu DAT'ların yüzdesini ölçebildiler. Bu, içselleştirmeden önce "toplam" protein miktarına karşılık gelen şerit T'yi gösteren temsili bir immünoblottur, şerit S, hücrelerin endositoz yoluyla ilerlemesine asla izin verilmediği, ancak indirgeyici ajan ile muamele edildiği "soyulmuş" numuneler içindir ve şerit I, "içselleştirilmiş" proteinlerin sonuçlarını temsil eder.

Bilim adamları, sadece yüzey proteinlerinin endositozunu ölçmenin yanı sıra, ilaçların bu süreç üzerindeki etkilerini de inceler. Bu çalışmada araştırmacılar, eyleminin DAT içselleştirmesini indüklediği öne sürülen bir protein kinaz C (PKC) aktivatörü ile tedaviye yanıt olarak DAT'ların yüzey yoğunluğunu değerlendirdiler. Bilim adamları, fare beyin dokusu üzerinde ex vivo testinde kullanılmak üzere in vitro biyotinilasyon protokolünü uyarlayarak bunu doğruladılar. Veriler, PKC aktivasyonuna yanıt olarak hücre zarından yaklaşık% 30'luk bir DAT kaybı olduğunu ortaya koydu.

Son olarak, biyotinilasyon testini değiştirerek, bilim adamları zar proteinlerinin geri dönüşümünü de ölçebilirler. Burada araştırmacılar, klorür iyonlarını iletmekten sorumlu yüzey kanalı proteini CFTR'yi araştırıyorlardı. Geri dönüşümü değerlendirmek için, araştırmacılar bir hücre grubunda standart bir biyotinilasyon protokolü uyguladılar ve endositozlanmamış yüzey proteinlerinden biyotini parçaladıktan sonra adımlar ekleyerek ikinci hücre grubu için protokolü değiştirdiler. Bu ek adımlar, içselleştirilmiş, biyotin etiketli reseptör proteinlerinin bir kısmının geri dönüştürülmesine izin vermek için sıcaklığın 37 ° C'ye yükseltilmesini içeriyordu. Bu bilim adamları, geri dönüşüm gerçekleşmeden önce ve sonra içselleştirilmiş proteinler arasındaki farkı hesaplayarak, zara geri dönüştürülen CFTR yüzdesini ölçebildiler.

Az önce JoVE'nin hücre yüzeyi biyotinilasyon testine girişini izlediniz. Video, bu testin prosedürel adımlarını açıkladı ve her adımda meydana gelen reaksiyonu açıkladı. Son olarak, bu yöntemin uygulanabilirliğini gösteren bazı örnek deneyleri inceledik. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!