Yüksek hızlı süper çözünürlük hızı mikroskobu canlı birincil Cilium içinde uygulanması

Bu deneyin genel amacı, birincil kirpiklerdeki protein taşıma yollarını belirlemektir. Bu yöntem, normal ve işlevsiz kirpiklerdeki protein taşıma yolu farklılıkları gibi kirpikler alanındaki anahtar soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, canlı hücrelerde alt kırınım protein taşıma yollarını görmek için yeterince yüksek çözünürlüğe sahip olmasıdır.

Başlamak için, deneyden bir buçuk hafta önce, 37 santigrat derecede, özel olarak tasarlanmış NIH-3T3 hücrelerinin donmuş stokunu çözün. Çözülmüş hücreleri, üç mililitre önceden ısıtılmış ortam içeren 25 santimetre karelik hücre kültürlü bir şişeye aktarın. Hücreleri %5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede tutun.

Hücreleri %80 birleşim noktasına ulaşana kadar kültürleyin ve ardından hücreleri bölün. Hücreleri bölmek için, 37 santigrat derecede iki dakika boyunca% 0.25 Tripsin ile deneyin. Kısa inkübasyonun ardından, Tripsin'i aspire edin ve iki mililitre önceden ısıtılmış kültür ortamı ile değiştirin.

Herhangi bir hücre kümesini parçalamak için ortamı pipetleyin, ardından hücrelerin %75'ini şişeden çıkarın ve toplam ortam hacmini üç mililitreye kadar geri getirin. Hücre döngüsünün homojenliğini sağlamak için deneyden önce hücreleri en az üç kez bölün. Deneyden iki gün önce, hücreleri bölün ve aynı kültür ortamının 1,5 mililitresi ile 35 milimetrelik bir cam alt plaka üzerinde% 60-70 oranında birleştirin.

Daha sonra, deneyden bir gün önce, hücreleri istenen plazmit ile kimyasal olarak transfekte edin. 500-1000 nanogram plazmidi bir ila 2.5 oranında transfeksiyon reaktifi ve 0.25 mililitre indirgenmiş serum ortamını 30 dakika boyunca antibiyotiksiz olarak karıştırın. Transfeksiyon kompleksi oluştuktan sonra, ortamı 35 milimetre cam alt çanaktan aspire edin ve bunu 0.25 milimetre transfeksiyon karışımı ve antibiyotiksiz ekstra 1.25 milimetre azaltılmış serum ortamı ile değiştirin ve plakayı inkübatöre geri koyun.

Harici olarak etiketlenmiş SSTR3 yapısına sahip hücreler için, deneyden bir saat önce ortamı cam alt tabaktan çıkarın. Hücreleri bir mililitre PBS ile beş kez yıkayın ve bir mikromolar Alexa 647 konjuge streptavidin ile desteklenmiş bir mililitre azaltılmış serum ortamı ekleyin. Deneyden en fazla 15 dakika önce, ortamı cam alt tabaktan çıkarın ve hücreleri bir mililitre PBS ile beş kez yıkayın.

Ardından cam alt tabağa bir mililitre görüntüleme tamponu ekleyin. Cam alt plakayı mikroskoptaki sahneye sabitleyin. GFP filtre setini kullanarak bir GFP ekspres hücresi bulun ve birincil kirpiklerde SSTR3-GFP'yi düzgün bir şekilde ifade eden bir hücre bulun.

Uygun bir hücre bulunduğunda, birincil kirpiklerin tabanındaki NPHP4-mCherry noktasını, lazerin tek noktalı aydınlatmasına karşılık gelen görüntüleme düzlemindeki konumla hizalayın. Yakalama işlevini kullanarak, odak kontrolleri penceresinin kamera sekmesinde, yeşil floresan proteini ile etiketlenmiş NPHP4-mCherry ve SSTR3 proteinlerinin epifloresan görüntüsünü yakalayın. Referans görüntüler elde edildikten sonra, geçiş bölgesini 20 saniye boyunca bir miliwatt'lık bir lazer aydınlatması ile fotoağartarak etiketli tek moleküllerin konsantrasyonunu lokal olarak azaltın.

Tek molekül takibine hazırlanmak için, Alexa 647 ile etiketlenmiş moleküller için lazer aydınlatma gücünü 0,5 miliwatt'a düşürün. Kazanç ve yoğunlaştırmayı maksimuma ve kare hızını iki milisaniyeye ayarlayın. Ardından, odak kontrolleri penceresinin kamera sekmesindeki akış düğmesine tıklayın ve uygun aydınlatma lazerini devreye sokun.

Foto-ağartılmamış etiketli tek molekülleri, geçiş bölgesinin foto-ağartılmış bölgesinden taşınırken kaydedin. Siliyer kaymanın etkilerinden kaçınmak için iki dakikadan fazla video kaydetmemeyi unutmayın. Tek molekülleri yakaladıktan sonra, videoları, her bir molekülün uyarma noktasının, yayılma fonksiyonunun ve kapsayıcı bir ilgi alanının merkez noktasını hassas bir şekilde lokalize eden Gelles laboratuvarı tarafından Glimpse gibi bir 2D Gauss uydurma algoritması kullanarak işleyin.

Son olarak, tüm tek molekül konumlarını 10 nanometreden daha iyi bir hassasiyetle seçin ve 2D Gauss fonksiyonu ile donatılmış tek molekül konumlarının dağılımına dayalı olarak kirpiklerin merkezini düzeltin. Bu videoda açıklandığı gibi, tek noktalı aydınlatma, NPHP4-mCherry ile işaretlenen geçiş bölgesi boyunca AF647 etiketli SSTR3 molekülünü izlemek için kullanılabilir. Veri analizinden önce, tek moleküllü videonun geniş alan aydınlatması üzerine bindirilmesi, lazerin düzgün bir şekilde hizalandığından ve yeterli bir sinyal-gürültü oranı olduğundan emin olmak için yararlı bir doğrulama adımıdır.

Burada görülen, boyama ile tanımlanan birincil silyuma sahip bir hücredir. IFT20, Arl13b-mCherry ile işaretlenmiş birincil kirpikler içindeki mikrotübüller boyunca kargo taşıyan intraflagellar taşıma kompleksinin bir bileşenidir. Tanımlandıktan sonra, tek tek IFT20-GFP proteinlerini izlemek için hız mikroskobu kullanılır.

Daha sonra, birincil kirpikler içindeki proteinin tek bir boyut boyunca uzamsal olasılık yoğunluk dağılımını üretmek için 2B'den 3B'ye dönüşüm algoritması kullanılır. Bu yüksek yoğunluklu bölge, muhtemelen intraflagellar taşıma yolunun bilinen konumu ile uyumlu olarak aksonimal mikrotübüllerle birlikte lokalize olur. Bu prosedürü denerken, sistematik hatayı en aza indirmek için numuneyi lazerle hassas bir şekilde hizalamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, hız mikroskobu ile tek molekül takibinin nasıl yapıldığını iyi anlamış olacaksınız ve primer kirpiklerde tek molekül taşıma yolunu nasıl elde edeceğinizi öğreneceksiniz.