Name: Yüksek hızlı süper çözünürlük hızı mikroskobu canlı birincil Cilium içinde uygulanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Öğrenin canlı hücrelerde yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme ile birincil silialardaki protein taşıma yollarını haritalamayı. Bu yöntem NIH-3T3 hücreleri kullanarak normal ve disfonksiyonel silialar arasındaki farklılıkları ortaya çıkarır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz Dr Kristen Verhey (Michigan Üniversitesi, Ann Arbor) ve Dr. Gregory Pazour (Massachusetts Üniversitesi Tıp Fakültesi) bazı plazmid verdiğiniz için teşekkür ederiz. Projenin Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH GM097037, GM116204 ve GM122552 W.Y. için) gelen hibe tarafından desteklenmiştir.

1. NIH 3T3 hücre hazırlık için hız mikroskobu stoktan
<ol><li>deneme hakkında 1,5 hafta 37 ° C'de çözdürme ve hücreleri bir 25 cm2 hücre kültür şişesi 3 mL, Dulbecco'nın modifiye kartal orta (110 mg/mL ile desteklenmiş DMEM) ile aktarma tarafından dondurulmuş stoktan NIH 3T3 hücre taze bir kültür kurtarmak Sodyum pyruvate, 2 mM glutamin, % 10 fetal sığır serum ve % 1 penisilin/streptomisin.</li>
	<li>%5 CO2 kuluçka 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
	<li>Hücreleri hakkında iki günde % 80 confluency, hücre döngüsü polimerlerin sağlamak için deneysel bir gün önce en az üç kez bölün. % 0.25 tripsin 37 ° C'de 2 min için hücrelerle trypsinize, tripsin Aspire edin ve orta 2 mL ile değiştirin. Pipet art arda hücre kümeleri kadar kırmak, hücreler için istediğiniz sayıyı kaldırmak ve medya hacmi getirmek için orta geri ilâ 3 mL. Not: NIH 3T3 daha önce genetik olarak NPHP-4, mCherry için C terminus, erimiş TZ26, yerelleştirir bir protein ifade etmek için. mCherry 561 nm aydınlatma ile kantitatif TZ seçicilik bariyer yerelleştirilmesine ve birincil kirpikler yönlendirmek için heyecanlı bir fluorophore var.</li>
	<li>İki gün önce deney, plaka 35 mm cam alt hücrelere aynı orta adım 1.1 olarak 1,5 mL ile % 60-70 confluency, bulaşık ve hücreleri için kuluçka dönün.</li>
	<li>Bir gün önce deneme, kimyasal olarak istenen plazmid hücrelerle transfect. 500-1000 istenen plazmid ng (bkz: Not aşağıdaki) 1:2.5 oranında transfection reaktif 0.25 ml 30 dk. 35 medyadan aspiratı için antibiyotik olmadan düşük serum medya ile mm cam alt çanak mix ve eski yerine koymak o ile 0.25 mL plazmid / transfection reaktif mix plus ilave 1,25 kalp krizi düşük serum medya olmadan antibiyotik. İndirimli serum medya başarılı bir transfection kolaylaştırılması, birincil kirpikler büyüme inducing, hem de hücreleri deney gerçekleştirmek için yeterince uzun süre hayatta tutan amaca hizmet eder. Hücreleri ertesi gün deneme için kuluçka dönün. Not: IFT20 tek molekül izlenmesini gerçekleştirirken, GFP için onun C terminus, genetiği değiştirilmiş IFT20 erimiş içeren bir plazmid kullanılan25' tir. Tek molekül gerçekleştirirken kendi N terminus bir alıcısı peptid (AP) etki alanı için genetiği değiştirilmiş SSTR3 içeren bir plazmid erimiş SSTR3 izleme ve C terminus GFP için kullanılan22yaşında. SSTR3 yapı yanı sıra ortak biotin ligaz BirA içeren bir plazmid dile getirdi ve transfection medya 10 µM biotin ile desteklenmiştir. BirA sonra biotin ER düzeyinde yeni sentezlenmiş AP-SSTR3-GFP moleküllerin AP etki alanı ekler. Streptavidin, dört biotin bağlama sitelerinde üçü için Birleşik Alexa647 ortalama, sonra fluorescently etiket için AP-SSTR3-GFP moleküller hücre22,27 dış yüzeyinde Imaging önce basına takıma . GFP ve AlexaFluor647 Bu yöntemde kullanılır; Ancak, diğer floresan problar onlar benzer şekilde yüksek fotoğraf-istikrar ve verim kuantum varsa kullanılabilir.</li>
	<li>SSTR3 yapı dışarıdan etiketli, cam alt medyadan deneme önce 1 h bulaşık, hücresinden fosfat tamponlu tuz (PBS) 1 mL 5 kere yıkayın ve düşük serum medya 1 mL 1 µM ile desteklenmiş Ekle Kaldır kullanarak Alexa647 Birleşik streptavidin.</li>
	<li>En fazla 15 dk önce deneme, cam alt çanak medyayı çıkarın ve 1 mL PBS ile 5 kere transfected ve etiketli hücreleri yıkayın.</li>
	<li>Görüntüleme arabelleği (20 mM HEPES, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7.3) 1 mL cam alt çanak yerleştirin. Not: görüntüleme arabellekte artık için 3 h uygun hücrelerdir. Bu nedenle, sadece 2 h deneyler her yemeğin üzerinde yapılmaktadır.</li>
</ol>2. hız mikroskobu
Not: Hız mikroskobu Kur bir 1.4-NA 100 × petrol-daldırma apochromatic amaç, 35 mW 633 nm He-Ne lazer, 50 mW katı hal 488-nm ve 561-nm lazerler, bir çip üzerinde çarpma kazanç ile donatılmış bir ters Floresans mikroskobu içerir. şarj birleştiğinde cihaz kamera ve bir mikroskop bilgisayar yazılımı paket için veri toplama ve işleme (şekil 1). Tek kanal görüntüleme için GFP, mCherry ve Alexa647 tarafından 488 heyecanlı mısın nm, 561 nm veya 633 nm lazerler, anılan sıraya göre. Tek molekül izleme için tek nokta aydınlatma bireysel moleküllerin fluorescently etiketli izlemek için kullanılır. Epifluorescence görüntüleme için ışın tek tip bir aydınlatma alana genişletmek için lazer aydınlatma yolundaki bir içbükey mercek yerleştirilir. Floresans emisyon aynı amaç tarafından toplanan, dikroik filtresi (405/488/561/635) ve bir emisyon filtresi (405/488/561/635) tarafından filtre ve tek molekül takibi için 500 Hz veya 2 Hz için çalışan yukarıdaki CCD kamera ile görüntülü epifluorescence görüntüleme.
<ol><li>Cam alt plaka mikroskop sahneye yapıştırmayın ve istenen yapıları düzgün ifade bir hücreyi bulun. Uygun bir hücreyi bulunca NPHP4 mCherry noktanın konumunu görüntüleme uçakta lazer'ın tek nokta aydınlatma için karşılık gelen birincil kirpikler temelini hizalayın.</li>
	<li>NPHP4-mCherry ve IFT20-GFP veya AP-SSTR3-GFP digital mikroskobu yazılım paketi kullanıyorsanız "Odak denetimler" pencere "Kamera" sekmesinde "Ek" işlevini kullanarak bir epifluorescence görüntü yakalama ( Tablo malzemelerigörmek). Not: Bu görüntüleri izleyen tek molekül konumları için bir başvuru olarak hareket edecek.</li>
	<li>Referans görüntüleri elde edilen bir kez yerel olarak etiketli tek moleküllerin konsantrasyonunu azaltmak. Fotoğraf-TZ 1 mW lazer aydınlatma 20 ile çamaşır suyu s ya da floresan yoğunluğu bu arka plan Floresans yakın olana kadar. Not: Otelde tam konsantrasyon kontrol edilebilir, 0.1-1 tek molekülleri etiketli nM kullanılır.</li>
	<li>Tek molekül izleme için hazırlamak için lazer aydınlatma gücü ~0.15 mW tek molekülleri ile GFP etiketli veya ~0.5 mW Alexa647 ile etiketli molekülleri düşür.</li>
	<li>En kısa zamanda lazer güç ve parametrelerini görüntüleme ayarla, maksimum kazanç ve yoğunlaştırılması ve 2 ms kare hızı, tek molekül görüntüleme için uygun aydınlatma lazer meşgul ve sigara-photobleached, onlar taşınmaktadır gibi tek molekülleri etiketli kaydetme "Odak denetimler" penceresindeki "Kamera" sekmesi "Stream" düğmesini tıklatarak TZ photobleached bölgeden. Not: En fazla 2 dk Video ihmal edilebilir bir düzeye silier drift etkilerini en aza indirmek için yakalanması.</li>
	<li>Tek molekül video yakalanıyor sonra belirti yanında tam olarak her molekülünü'nın uyarma PSF kapsayan bir alanda ilgi (AOI) centroid yerelleştirir Gelles laboratuvar gibi bir 2D Gauss uygun algoritması kullanarak video işlemek.</li>
	<li>Tüm tek molekül konumları hassasiyetle seçin < 10 nm ve dağıtım bir 2D Gauss fonksiyonu ile donatılmış tek molekül yerlerin dayalı kirpikler ortasına doğru. Not: 2D 3D dönüştürme algoritması kullanarak, IFT20-GFP ve AP-SSTR3 parkurları 3D ulaşım yolları açıkça silier axonemal veya silier membran üzerinde sırasıyla gösterilir.</li>
</ol>3. 2D 3D dönüştürme için
<ol><li>Bir kez içinde cilium molekülleri (sinyal gürültü oranı > 11) transit için birkaç bin yerelleştirmeler toplanır, cilium uzun ekseni X-boyut olarak seçin. 10 nm aralıklarla depo gözü toplamlar elde etmek ve konumları Y boyut histogramını olun. Not: 2D 3D dönüştürme için el veya herhangi bir yazılım veya programlama dili tarafından değerlendirilecek. Yazarlar başarıyla Matlab ve Python 2.7 dönüşümün hayata geçirdik.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li>
<li>Leung, B. O., Chou, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+super-resolution+fluorescence+microscopy+for+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Review of super-resolution fluorescence microscopy for biology.</a> Appl Spectrosc. 65, 967-980 (2011).</li>
<li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440, 935-939 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3, 793-796 (2006).</li>
<li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+distribution+of+transient+interactions+in+the+nuclear+pore+complex+obtained+from+single-molecule+snapshots%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional distribution of transient interactions in the nuclear pore complex obtained from single-molecule snapshots.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 7305-7310 (2010).</li>
<li>Ma, J., Goryaynov, A., Sarma, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-regulated+viscous+channel+in+the+nuclear+pore+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Self-regulated viscous channel in the nuclear pore complex.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7326-7331 (2012).</li>
<li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+three-dimensional+mapping+of+mRNA+export+through+the+nuclear+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">High-resolution three-dimensional mapping of mRNA export through the nuclear pore.</a> Nat Comm. 4, (2013).</li>
<li>Akey, C. W., Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+Xenopus+nuclear+pore+complex+revealed+by+three-dimensional+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Architecture of the Xenopus nuclear pore complex revealed by three-dimensional cryo-electron microscopy.</a> J Cell Biol. 122, 1-19 (1993).</li>
<li>Akey, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+and+structure+of+the+nuclear+pore+complex+revealed+by+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions and structure of the nuclear pore complex revealed by cryo-electron microscopy.</a> J Cell Biol. 109, 955-970 (1989).</li>
<li>Czarnecki, P. G., Shah, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+transition+zone%3A+from+morphology+and+molecules+to+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The ciliary transition zone: from morphology and molecules to medicine.</a> Trends Cell Biol. 22, 201-210 (2012).</li>
<li>Elf, J., Li, G. -W., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+transcription+factor+dynamics+at+the+single-molecule+level+in+a+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing transcription factor dynamics at the single-molecule level in a living cell.</a> Science. 316, 1191-1194 (2007).</li>
<li>Anzalone, A., Annibale, P., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+orbital+tracking+in+a+modified+two-photon+microscope%3A+an+application+to+the+tracking+of+intracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">3D orbital tracking in a modified two-photon microscope: an application to the tracking of intracellular vesicles.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitscheck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopy+for+single+molecule+tracking+in+living+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue.</a> PloS one. 5, 11639(2010).</li>
<li>Marshall, W. F., Nonaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia%3A+tuning+in+to+the+cell%27s+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cilia: tuning in to the cell's antenna.</a> Curr Biol. 16, 604-614 (2006).</li>
<li>Scholey, J. M., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport+and+cilium-based+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport and cilium-based signaling.</a> Cell. 125, 439-442 (2006).</li>
<li>Yang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+pattern+recognition+reveals+the+architectural+map+of+the+ciliary+transition+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Superresolution pattern recognition reveals the architectural map of the ciliary transition zone.</a> Sci Rep. 5, 14096(2015).</li>
<li>Craige, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEP290+tethers+flagellar+transition+zone+microtubules+to+the+membrane+and+regulates+flagellar+protein+content%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CEP290 tethers flagellar transition zone microtubules to the membrane and regulates flagellar protein content.</a> J Cell Biol. 190, 927-940 (2010).</li>
<li>Kee, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+size-exclusion+permeability+barrier+and+nucleoporins+characterize+a+ciliary+pore+complex+that+regulates+transport+into+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A size-exclusion permeability barrier and nucleoporins characterize a ciliary pore complex that regulates transport into cilia.</a> Nat Cell Biol. 14, 431-437 (2012).</li>
<li>Najafi, M., Maza, N. A., Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steric+volume+exclusion+sets+soluble+protein+concentrations+in+photoreceptor+sensory+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Steric volume exclusion sets soluble protein concentrations in photoreceptor sensory cilia.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 203-208 (2012).</li>
<li>Nachury, M. V., Seeley, E. S., Jin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+to+the+ciliary+membrane%3A+how+to+get+across+the+periciliary+diffusion+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Trafficking to the ciliary membrane: how to get across the periciliary diffusion barrier.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 59-87 (2010).</li>
<li>Ye, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+imaging+reveals+a+major+role+for+diffusion+in+the+exploration+of+ciliary+space+by+signaling+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Single molecule imaging reveals a major role for diffusion in the exploration of ciliary space by signaling receptors.</a> Elife. 2, 00654(2013).</li>
<li>Ross, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+ciliary+proteins+perturbs+planar+cell+polarity+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genetics%22%5BJournal%5D)">Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates.</a> Nat Genetics. 37, 1135-1140 (2005).</li>
<li>Handel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+targeting+of+somatostatin+receptor+3+to+neuronal+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia.</a> Neuroscience. 89, 909-926 (1999).</li>
<li>Follit, J. A., Tuft, R. A., Fogarty, K. E., Pazour, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intraflagellar+transport+protein+IFT20+is+associated+with+the+Golgi+complex+and+is+required+for+cilia+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The intraflagellar transport protein IFT20 is associated with the Golgi complex and is required for cilia assembly.</a> Mol Biol Cell. 17, 3781-3792 (2006).</li>
<li>Awata, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NPHP4+controls+ciliary+trafficking+of+membrane+proteins+and+large+soluble+proteins+at+the+transition+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">NPHP4 controls ciliary trafficking of membrane proteins and large soluble proteins at the transition zone.</a> J Cell Sci. 127, 4714-4727 (2014).</li>
<li>Howarth, M., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+proteins+in+live+mammalian+cells+with+biotin+ligase+and+monovalent+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin.</a> Nat Protoc. 3, 534-545 (2008).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Bu iletişim kuralı hız mikroskobu uygulamaya birincil cilium, son derece verimli protein araçta güvenen bir hücresel sinyal organel açıklar. Onlar TZ üzerinde ortalanmış tek nokta aydınlatma yoluyla geçerken hız mikroskobu (&lt; 10 nm) konumları fluorescently etiketli moleküller için yüksek çözünürlüklü sağlayabilir. Daha önce NPC6,7,8ile ticareti protein çalışmaya uygulanmıştır. Ancak, herhangi bir alt kırınım hücresel boşluğu ...

Ernst Abbe tarafından 1873 yılında belirtilen beri konvansiyonel ışık mikroskobu çözünürlüğe objektif1,2ışık kırınım nedeniyle sınırlı yaklaşık 200 nm olduğuna inanılan. Şu anda, süper çözümleme ışık mikroskobu teknikleri bu sınırlama kırmak ve alt kırınım (&lt; 200 nm) çözünürlük ile dinamik görüntü yakalama sağlar. Teknikleri, genellikle iki geniş kategoriye ayrılır: uyarılmış alt kırınım Aydınlatma Cilt fluorophores doğrusal olmayan optik tepki nedeniyle örnekleri3' te; oluşturmak emisyon tükenmesi (STED) mikroskopi dayalı yaklaşımlar ve photoactivated ışık mikroskobu (PALM) ve Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)-fluorophores cisimlerin yerelleştirilmesine ve bu cisimlerin yeniden oluşturmak için Matematiksel işlevler kullanmak süper çözümleme teknikleri dayalı süper çözünürlük görüntüleri4,5oluşturmak için. Şu anda, nispeten basit optik Kur nedeniyle PALM ve fırtına geniş yalnızca küçük bir alt kümesine fluorophores biyolojik hazırlanması uzun bir videonun her çerçevede etkinleştirerek istihdam edilmektedir. Bu daha doğru yerelleştirme için floresan spot, 2D Gauss montaj tarafından noktaya yayılmış işlevi (PSF) olarak adlandırdığı video her çerçevede fluorescently etiketli proteinlerin sağlar. Her fluorescently etiketli molekül 2D konumunu sonra biyolojik hazırlık1,2süper çözünürlük görüntü üretmek için tek bir görüntüleme uçağa bindirilen. Bu tek molekül yerelleştirme sırasında mikroskobu süper çözünürlük yaklaşımlar kesinlikle nasıl görüntüleme biyolojik örneklerin gerçekleştirilen devrim, hala aşılması gereken sorunlar vardır. Örneğin, fırtına ve PALM onların en iyi uzamsal çözünürlük sonra biyolojik örneklerin fiksasyonu elde etmek ve böylece fluorescently etiketli proteinler, statik bir temsili olan elektron mikroskobu benzer bir kısıtlamasıdır mevcut. Ayrıca, canlı hücrelerdeki her fluorescently etiketli protein için yüksek Uzaysal çözünürlük elde etmek için örnekleri protein dynamics yakalamak mümkün değildir çok uzun framerate yansıması gerekir. Bu nedenle, bu ana teknik engellerin üstesinden gelmek gereklidir.
Çok hızlı hareket eden protein veya RNA'ların canlı hücrelerde algılamak için uygundur yüksek bir kronolojik zamanmekansal çözünürlük elde etmek için biz süper çözünürlük hızı mikroskobu bizim laboratuvar (şekil 1)6,7', gelişen 8. hız mikroskobu birkaç önemli teknik gelişmeler bizi küçük moleküllerin nucleocytoplasmic taşıma başarılı bir şekilde izlemek daha önce etkinleştirdiyseniz, proteinler, mRNA ve virüs-den geçerek yerli nükleer gözenek kompleksleri (NPCs)6, 7 , 8. kısaca, hız mikroskobu, aşağıdaki özellikleri hızlı hareket eden oluştururlar alt mikrometre rotasyonel simetrik yapıları NPCs ve birincil kirpikler gibi canlı hücrelerdeki üzerinden izlemek için kullanılan: (1) bir eğimli veya bir Dikey aydınlatma PSF odak düzlemi (şekil 1); küçük kırınım-limit hacmindeki içinde tek moleküllerin uyarma sağlar (2) eğimli PSF büyük ölçüde odak floresan önlemek ve böylece sinyal-gürültü oranı geliştirmek. (3) 100-500 kW optik yoğunluk / cm2 aydınlatma PSF'hızlı algılama hızı (&gt; 500 Hz) ile tek fluorophores üzerinden tahsil edilecek fotonlar binlerce sağlar. (4) hızlı algılama hızı da büyük ölçüde azaltır tek molekül kayma yerelleştirme hata (&lt; 10 nm) moleküler Difüzyon önemli faktörlerden biri olduğu için canlı hücrelerde, floresan molekülleri hareket kayma yörüngeleri belirlemede molekülleri hareket etmek için tek molekül yerelleştirme kusurları neden. (5) well-established 2D 3D dönüştürme algoritmaları molekülleri NPC veya birincil cilium 3D mekansal olasılık yoğunluk haritalar ulaşım yollarının sağlamamıza olanak sağlar. Bu bizim dönüştürme işlemi Kartezyen ve silindirik koordinasyon sistemi arasında bir 3D mekansal olasılık yoğunluk 3D yerine harita tek molekül izleme (Şekil 2) oluşturmak için kullanılan dikkat çekicidir. Daha önce elektron mikroskobu veri-si olmak kâşif NPC9,10 ve11 birincil cilium hem de rotasyonel simetrik bir yapıya sahip. Prensip olarak, rasgele NPC veya birincil cilium aracılığıyla hareketli moleküllerin Difüzyon rotasyonel simetrik dağıtımları da olmalıdır. Şekil 2' de gösterildiği gibi rastgele silindir içinde moleküllerin Difüzyon yüksek bir dizi bu kesit görünümü, rotasyonel simetrik dağıtımları daha fazla bir yaklaşık Tekdüzen kaynaklanan NPC oluşturmak kayma Dağıtım iki komşu yüzük (Şekil 2E) arasında çok küçük her alt bölge içerisinde. Bu tekdüze dağılım silindirik sistemdeki θ boyuttaki kayma dağıtım sabittir yol açar. Sonra 3D koordinatları (R, X, θ)-ebilmek var olmak kolaylaştırmak-2B koordinatları (R, X, Sabit) olmak. Aslında, bizim dönüştürme işlemi Kartezyen ve silindirik sistemleri arasındaki 2D (R, X, Sabit) 2D (X, Y) etmektir. Sürekli θ, Şekil 2Emekansal yoğunluk p başvurduğu, ADenklem kullanılarak hesaplanır<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56475/56475eq1.jpg">.
Sonuçta, tek molekül izleme geniş uygulama Biyolojik araştırma vardır, böylece, bu teknikleri bir bolluk belirli biyolojik nişler12,13,14doldurmak için geliştirilecek doğaldır. Böyle hız mikroskobu ile durumdur. Daha önce bir 3B dönüştürme algoritması ile birleştiğinde, moleküller NPCs, alt diffraction ölçekli ve rotasyonel simetrik biyolojik yapısı6üzerinden transit, 3D ulaşım yolları çözmek için bu teknik geliştirilmiştir. Bu yazıda, birincil kirpikler mükemmel model organelleri de olduğu gösterilmiştir. Birincil kirpikler en memeli hücreleri15,16,17yüzeyinden Project'in silindirik, anten gibi organellerin (~ 125 nm RADIUS) vardır. Onlar dış sinyalleri alma ve genellikle büyüme ve metabolizma15,16ile ilgili hücre içi bir yanıt gönderme için sorumludur. Bu nedenle, yapısal proteinlerin akı, geri dönüşüm transmembran reseptörler ve hücre içi haberci iletimini birincil kirpikler önemli sorumlulukları vardır. Dönemde birincil kirpikler ve hücre beden arasındaki geçiş bölgesi veya TZ, hangi aracılığıyla bu protein taşıma11,18,19ortaya çıkması gereken bir kritik seçicilik engel vardır, 20. TZ gating işleve ek olarak, en az iki taşıma işlemi, intraflagellar taşıma ve pasif difüzyon, protein bu bölge16,21, üzerinden hareket sorumlu olduğu düşünülür 22. bir insan sağlığı açısından birincil kirpikler kaybı ve aşağı akım sinyal sonraki deregülasyon birçok kanser özelliğidir. Buna ek olarak, Bardet-Biedl sendromu ve Polikistik böbrek hastalığı, gibi birçok genetik hastalıkların arızalı protein taşıma23ile ilişkilidir. Alt kırınım boyutu sınırı ve seçici protein taşıma TZ aracılığıyla karmaşık süreci birincil kirpikler için bu tekniği ilk hedef olun. Bu yöntemleri yazıda, biz silier transmembran protein, somatostatin reseptörü 3 (SSTR3) izleme gösterecektir24dışarıdan Alexa Fluor 647 ve bir bileşeni olan bir yuvarlak GFP molekül ile etiketli LFT, IFT2025, taşır,.

<table><tbody><tr><td>25 cm2 doku kültürü kabı</td><td>Corning</td><td>VV-01936-00</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/streptomisin</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>ThermoFisher</td><td>10438018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>OPTIMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Transit LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>35 mm cam alt çanak</td><td>MatTek</td><td>P35GCOL-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647-konjuge streptavidin</td><td>ThermoFisher</td><td>S21374</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>633 nm He-Ne lazer</td><td>Melles Griot</td><td>25-LHP-928-249</td><td></td></tr><tr><td>561 nm katı hal lazeri</td><td>Tutarlı</td><td>OBIS 561-50 LS</td><td></td></tr><tr><td>488 nm katı hal lazeri</td><td>Tutarlı</td><td>1185053</td><td></td></tr><tr><td>Ters floresan mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>1.4-NA 100&x; yağa daldırma apokromatik objektif</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 100 kez;</td><td></td></tr><tr><td>Çip üzerinde çarpma kazancı şarjlı cihaz kamerası</td><td>Roper Scientific</td><td>Cascade 128+</td><td></td></tr><tr><td>Dikroik filtre</td><td>Semrock</td><td>Di01- R405/488/561/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Emisyon filtresi</td><td>Semrock</td><td>NF01-405/488/561/635-25X5.0</td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 6.0</td><td>Akıllı Görüntüleme Yenilikleri</td><td></td><td>dijital mikroskopi yazılımı</td></tr></tbody></table>

yüksek hızlı süper çözünürlük hızı mikroskobu canlı birincil cilium içinde uygulanması

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

Birincil cilium bir Mikrotubul tabanlı çıkıntı yüzeyi birçok ökaryotik hücre ve proteinlerin benzersiz bir tamamlayıcı bu işlev eleştirel hücre hareketliliği ve sinyal içerir. Kirpikler kendi protein sentezleme aciz olduğundan, 200'e yakın benzersiz silier proteinler sitozol ve birincil kirpikler ticareti gerekir. Ancak, hala taşıma yolları bu proteinler arasında şu an mevcut olan sınırlamaları nedeniyle canlı birincil kirpikler için üç boyutlu (3D) yerlerini eşlemek için teknik bir sorun olduğunu teknikleri. Meydan fethetmek için son zamanlarda biz geliştirdik ve tek-noktaya kenar-uyarma alt kırınım (hız) mikroskopi, taşıma yolları için 3D uzaysal konumunu belirlemek için olarak adlandırdığı bir yüksek hızlı sanal 3D süper çözünürlük mikroskobu istihdam hem sitozolik ve birincil kirpikler canlı hücre membran proteinlerinin. Bu makalede, biz hız mikroskobu, silier protein Floresans protein etiketli, gerçek zamanlı tek molekül izleme canlı cilium bireysel proteinlerin ve başarı ifade hücreleri hazırlanması ayrıntılı kurulum gösterecektir 3D mekansal olasılık yoğunluk haritaları silier proteinler için ulaşım yollarının.

HIZ mikroskobu, Alexa647 için bir ~ 15 nm dış bağlayıcı tarafından bağlı SSTR3 taşıma güzergahı çalışmaya TZ birincil kirpikler, performans elde edilen veriler bu bölümde gösterilmiştir (şekil 3A). Bu, 3B dönüştürme algoritması doğrulama çift amaçlı hizmet vermektedir. Etiket birincil cilium ve bu nedenle, 3D aktarım yol dış yüzeyinin bu konumda bir yüksek yoğunluklu aktarım yol ortaya çıkarmak sadece Alexa647 gerekir. NIH 3T3 stabil NPHP3-mC...

Son zamanlarda ulaşım yolları çeşitli proteinlerin canlı hücrelerdeki birincil kirpikler içinde translocating için üç boyutlu (3D) kayma yerlerini eşleştirilmiş. Burada deneysel kurulum, biyolojik örneklerin işlem ve veri analizleri yaklaşım yeni görüntüleme 3D süper çözünürlük floresan için uygulanan bu kağıt ayrıntıları birincil kirpikler yaşıyorum.

Yüksek hızlı süper çözünürlük hızı mikroskobu canlı birincil Cilium içinde uygulanması

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

Bu deneyin genel amacı, birincil kirpiklerdeki protein taşıma yollarını belirlemektir. Bu yöntem, normal ve işlevsiz kirpiklerdeki protein taşıma yolu farklılıkları gibi kirpikler alanındaki anahtar soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, canlı hücrelerde alt kırınım protein taşıma yollarını görmek için yeterince yüksek çözünürlüğe sahip olmasıdır.Başlamak için, deneyden bir buçuk hafta önce, 37 santigrat derecede, özel olarak tasarlanmış NIH-3T3 hücrelerinin donmuş stokunu çözün. Çözülmüş hücreleri, üç mililitre önceden ısıtılmış ortam içeren 25 santimetre karelik hücre kültürlü bir şişeye aktarın. Hücreleri %5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede tutun.Hücreleri %80 birleşim noktasına ulaşana kadar kültürleyin ve ardından hücreleri bölün. Hücreleri bölmek için, 37 santigrat derecede iki dakika boyunca% 0.25 Tripsin ile deneyin. Kısa inkübasyonun ardından, Tripsin'i aspire edin ve iki mililitre önceden ısıtılmış kültür ortamı ile değiştirin.Herhangi bir hücre kümesini parçalamak için ortamı pipetleyin, ardından hücrelerin %75'ini şişeden çıkarın ve toplam ortam hacmini üç mililitreye kadar geri getirin. Hücre döngüsünün homojenliğini

application-high-speed-super-resolution-speed-microscopy-live-primary

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Havayolu kirpikler hareketliliği ve kirpikler oluşturulan akış fare trakea kullanarak görselleştirme ve ölçülmesi için kolay ve güvenilir bir tekniktir açıklanmıştır. Bu teknik faktörler çok çeşitli farmakolojik ajanlar, genetik faktörler, çevresel maruziyet, ve / veya mukus yük gibi mekanik faktörler de dahil olmak üzere, kirpikler hareketliliği nasıl etkilediğini belirlemek için değiştirilebilir.

Kemirgen Havayolu Epiteli içinde Cilia Motilite Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme için ex vivo Yöntemi

Canlı hücrelerin içindeki dinamik proteinler hakkındaki uzay-zamansal bilgi, biyolojiyi anlamak için çok önemlidir. Hızlı 3D yapılı aydınlatma mikroskobu (f3D-SIM) adı verilen bir tür süper çözünürlüklü mikroskopi, bakterilerdeki sitokinetik Z halkası hakkında benzersiz bilgiler ortaya çıkarır: hem boncuk benzeri görünümü hem de halka içindeki FtsZ'nin hızlı dinamikleri.

Hızlı 3D-Yapılandırılmış Aydınlatma mikroskopi ile Canlı Bakteri Cytokinetic Z Yüzük Süper çözünürlük Görüntüleme (F3D-SIM)

Bu çalışmada, ayrıntılı bir ışık mikroskobik tekniği, ultrastrüktürel analiz için bir elektron mikroskobik yöntemle birlikte CPEC kirpiklerin ex vivo hareketinin gerçek zamanlı gözlemi ve analizi için optimize edilmiştir.

Koroid Pleksus Epitel Hücreleri Silier Hareketi Gözlem<em&gt; Ex Vivo</em

Primer silia centriole ile ilişkili hücre dışı yapılardır. İmmünfloresan boyama ile primer silia tespiti son derece yüksek kaliteli görüntülerle sonuçlanan nispeten basit bir işlemdir. Bu protokolde primer silya yı ifade eden fibroblastlar sabit, immünolekeli ve floresan veya konfokal mikroskopta görüntülendi.

İmmünfluoresan siyon ile Primer Silya'nın Basit Tespiti

Burada, bozulmamış dokuda süper çözünürlüklü canlı hücre görüntüleme için bir protokol sunulmaktadır. Son derece hassas bir erişkin kök hücre popülasyonunu doğal doku ortamında görüntüleme koşullarını standartlaştırdık. Bu teknik, biyolojik olayların canlı dokuda doğrudan gözlemlenmesine izin vermek için zamansal ve mekansal çözünürlüğü dengelemeyi içerir.

Hücre Altı Yapıların Süper Çözünürlüklü Canlı Hücre Görüntülemesi

2D ve 3D insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hIPSC) tabanlı neokortik gelişim modellerinin üretimi ve karakterizasyonu için ayrıntılı protokollerin yanı sıra primer selyyum (PC) biyogenez ve fonksiyonunun nitel ve nicel analizini sağlayan tamamlayıcı metodolojiler sunuyoruz.

Neokortik Gelişim Sırasında Primer Seyum Tutulumını Diseksiyona Yönelik 2D ve 3D İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Bazlı Modeller

Burada, primer serebellar granül hücre öncüllerinin (GCP' ler) genetik manipülasyonu için uygun maliyetli, verimli ve uygulanabilir bir tekrarlanabilir in vitro elektroporasyon protokolü sunuyoruz. Ayrıca, bu protokol ayrıca birincil GCP hücrelerindeki birincil ekyuma bağımlı Kirpi sinyal yollarının moleküler çalışması için basit bir yöntem göstermektedir.

Granül Hücre Öncüsünde Birincil Seyuma Bağımlı Sinyal Yollarını İncelemek için Verimli ve Uygun Maliyetli Elektroporasyon Yöntemi

Yüksek hızlı video mikroskopi analizi, gerçekleştirilmesi nispeten kolay, hızlı, uygun maliyetli ve deneyimli ellerde, primer siliyer diskinezinin birinci basamak teşhisi için oldukça güvenilir bir araçtır ve ciddi akciğer hastalıklarının teşhisi ve tedavisinde yer alan her merkezde mevcut olmalıdır.

Primer Siliyer Diskinezinin Birinci Basamak Tanısı için Yüksek Hızlı Video Mikroskopi Analizi

Süper çözünürlüklü mikroskopi, mayozdaki sinaptonemal kompleks içindeki bileşenlerin organizasyonu hakkında ayrıntılı bir fikir verebilir. Burada, Caenorhabditis elegans synaptonemal kompleksinin bireysel proteinlerini çözmek için bir protokol gösteriyoruz.

Caenorhabditis elegans Germline İçindeki Sinaptonemal Kompleksin Süper Rezolüsyonlu Mikroskopisi

Bu yöntem, bir ARL13B-CENTRIN-2 transgenik fare modelindeki endojen sinyalin, doku toplamadan kirpik organizasyonunun analizine kadar, mineralize dokunun geniş alanlarında üç boyutlu olarak primer kirpikleri yerinde görüntülemek için kullanılmasını tanımlar. Bu protokol diğer doku tiplerine de uygulanabilir.

Kas-İskelet Dokusundaki Primer Kirpiklerin ARL13B-CENTRIN-2 Fare Modeli Kullanılarak Hacimsel Görüntülenmesi ve Analizi

Bu protokol, yüksek çözünürlüklü hücresel ve alt hücresel görüntüleme için çoklu dizi dedektörüyle entegre edilmiş lazer taramalı konfokal mikroskop sisteminin gelişmiş görüntüleme uygulamalarını ve paylaşılan kaynak yönetimini detaylandırır. Bu iş akışı, tek bir platform içinde konfokalden süper çözünürlükle (~120 nm) çok modal görüntülemeyi mümkün kılarak nano ölçekli görselleştirmeyi daha erişilebilir kılar.

Süper Çözünürlüklü Görüntüleme ve Paylaşılan Yönetim: Multiplex Algılama ile Konfokal Mikroskopi İçin Bir Protokol

Öğrenin canlı hücrelerde yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme ile birincil silialardaki protein taşıma yollarını haritalamayı. Bu yöntem NIH-3T3 hücreleri kullanarak normal ve disfonksiyonel silialar arasındaki farklılıkları ortaya çıkarır.

Yüksek hızlı süper çözünürlük hızı mikroskobu canlı birincil Cilium içinde uygulanması

Daha fazla video keşfet