Vezikül Geri Dönüşümünde FM Boyaları

FM boyaları, vezikül geri dönüşümünü görüntülemek için yaygın olarak kullanılan membran boyalarıdır. Bu, bir hücrenin, hücre boyutunu korumak, pahalı proteinleri yeniden kullanmak ve molekülleri ardışık olarak hücre dışı boşluğa taşımak için kendi zarından veziküller oluşturduğu süreçtir. Bu süreç en yaygın olarak, nörotransmiterlerin salınımında rol oynadığı nöronal sinapslarda incelenir. Vezikül geri dönüşümünü incelemeye ek olarak, FM boyaları, kromafin hücrelerinde salgılanma ve yaralanma sonrası hücre zarı onarımı gibi diğer bazı fenomenleri incelemek için kullanılır.

Bu video, vezikül geri dönüşümünü inceleyen bir deneyde FM boyalarının kullanımına odaklanacaktır. Uyarılmış nöronlardaki geri dönüşüm sürecini ölçmek için FM boyalarını kullanan adım adım bir protokolün üzerinden geçeceğiz. Son olarak, bu eşsiz molekülü farklı şekillerde kullanan bazı örnek deneyleri gözden geçireceğiz.

Prosedüre geçmeden önce, vezikül geri dönüşüm deneylerindeki işlevlerini anlamamıza yardımcı olacak FM boyalarının biyokimyasal özelliklerini gözden geçirelim.

Yapısal olarak, FM boyaları, isimlerini onları sentezleyen bilim adamı Fei Mao'dan alan strail molekülleridir. Bu boyaların üç ana yapısal özelliği vardır: baş, kuyruk ve köprü. Köprü, aralarında değişken bir çift bağ bölgesi bulunan iki aromatik halkadan oluşur. Bu bölümün tamamı floroforu oluşturur.

Herhangi bir floroforun doğası gereği, belirli bir uyarma dalga boyunda gelen ışık tarafından vurulduğunda, atomları bu enerjiyi emer ve elektronlarını uyarılmış bir duruma yükseltir. Bu elektronlar, titreşimli olarak enerji yayarak ve son olarak bir emisyon dalga boyunda ışık olarak temel duruma geri dönerler. Hidrofobik kuyruk, FM molekülünün hücre zarının lipid çift katmanlarına bölünmesine izin verir ve hidrofilik başı, dış zar broşürü ile lokalizasyonunu sınırlayan bir yüke sahiptir.

Bu nedenle, hücreye girebilmesinin tek yolu endositozdur. FM boyaları çevreye duyarlıdır ve polar çözücülerde zayıf floresan gösterir, ancak membranlar gibi hidrofobik ortamlarda güçlü floresan gösterir. Bu, bir floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilebilen ve ölçülebilen yüksek kontrastlı membran etiketlemesi oluşturur.

Bu özellikler, FM boyalarını sinapslarda vezikül geri dönüşümünü değerlendirmek için özellikle uygun hale getirir. Kısaca işlem, kültürlerin FM boya ile inkübe edilmesini içerir. FM moleküllerinin bir kısmı zarlara bağlanır ve bu da floresan yoğunluklarını önemli ölçüde artırır. Daha sonra, bir uyaran zar içselleştirme sürecini başlatır. Bu nedenle, bazı FM molekülleri vezikül zarında tutulur ve dış lokalize boya moleküllerinin geri kalanı yıkanır.

İkinci stimülasyonda, içselleştirilmiş lekeli veziküller, içeriklerini serbest bırakmak için hücre zarı ile birleşir ve boya hızla ayrılır, bu da floresan yoğunluğunda hızlı bir azalmaya neden olur. Bu lekelenme, bir floresan mikroskobu yardımıyla ölçülebilir.

Artık FM boyalarının biyokimyasal prensiplerine aşina olduğunuza göre, bu boyaları kullanarak sinaptik vezikül geri dönüşümünü inceleyen bir deneyin nasıl yapılacağına dair bir prosedürü gözden geçirelim.

Lameller üzerindeki nöronal kültürlerin temiz, sağlıklı örnekleri önceden hazırlanır. Bu hücreler bir FM boya çözeltisine taşınarak zarların etiketlenmesine neden olur. Numune lamel daha sonra mikroskobun görüntüleme odasına monte edilir.

Yıkama gibi sıvı manipülasyonlarına izin vermek için, sıvı giriş ve çıkış hatları sızdırmaz bir perfüzyon odası oluşturmak üzere bağlanır. Odayı bir floresan mikroskobu tablasına monte edin. Kabloları hazneye takın ve bunları elektrik stimülatörüne bağlayın. Takıldıktan sonra, uyarma ve emisyon filtreleri kullanılan FM boyasına göre ayarlanır.

Endositoz yoluyla veziküllere boya yüklemesi, bir elektrik stimülasyonu kullanılarak indüklenir. Stimülasyondan sonra sinir terminallerinin iyileşmesine izin verilir. Daha sonra, hücre dışı boya tampon ile yıkanır; Bu aynı zamanda arka plan floresansını da en aza indirir. Uyarma yoğunluğunu minimumda tutmak önemlidir, çünkü FM boyaları, uzun süreli uyarılma nedeniyle floresan yoğunluğunun zayıflaması olan fotoağartmaya eğilimlidir. Kısa inkübasyonun ardından ilk görüntüler elde edilir. Daha sonra, ekzositoz ikinci bir elektrik sinyali ile indüklenir.

Stimülasyonu takiben farklı zaman noktalarında floresan ölçüldükten sonra, sonunda, sinir terminalleri tüm serbest bırakılabilir boyayı boşaltmak için kapsamlı bir şekilde uyarılabilir. Bundan sonra kalan floresan, arka plan floresan yoğunluğu olarak kabul edilir. Daha sonra, her görüntünün içsel floresansı, görüntünün sinaptik olmayan bir alanında "İlgi Bölgesi" aracı kullanılarak ölçülür. Arka plan floresansı ve içsel floresan daha sonra normalleştirilmiş floresan yoğunluğu elde etmek için her bir zaman noktasının floresan yoğunluğundan çıkarılır ve bu daha sonra zamana karşı çizilir. Zamanla yoğunluktaki azalma, vezikül geri dönüşümünün dolaylı bir ölçüsü olan lekelenmeyi temsil eder.

Artık metodolojiyi gözden geçirdiğimize göre, FM boyalarının belirli deneylerde nasıl kullanıldığına bakalım.

Uyarılmış nöronlarda FM boyaları kullanan protokolü tartıştık. Burada, bilim adamları spontan vezikül geri dönüşümünü incelemekle ilgilendiler. Bunu, floresan yoğunluğundaki küçük değişiklikleri tespit edebilecek kadar hassas bir görüntüleme sistemi ile birlikte yerleşik protokolü kullanarak yaptılar. Sonuçlar, doğrudan spontan sinaptik salınıma bağlı olan floresan yoğunluğunda bir azalmayı temsil eder.

Presinaptik nöron içinde, veziküller iki havuza ayrılır: bir rezerv havuzu veya RP ve kolayca serbest bırakılabilir bir havuz veya RRP. Burada bilim adamları, vezikül popülasyonundaki her türün fraksiyonunu analiz etmek için FM boyaları kullandılar. Artan yoğunluklardaki elektriksel uyaranların sıralı uygulanmasıyla, bu bilim adamları her bir vezikül havuzunun nispi yüzdelerini ölçebildiler.

Son olarak, hücre biyoloğu, yaralı plazma zarlarının ekzositik onarımında rol oynayan faktörleri incelemek için FM boyaları da kullanır. Bu deneyde, araştırmacılar özellikle lipid modifiye edici bir enzim olan sfingomiyelinazın zarın yeniden mühürleme sürecindeki rolüne odaklandılar. İlk olarak, susturucu RNA tedavisinin yardımıyla sfingomiyelinaz enziminde eksik olan hücreler ürettiler. Daha sonra, bu hücreleri ve bir kontrol grubunu eksojen FM boyası ve plazma zarı lezyonları oluşturan bir toksin ile tedavi ettiler. Son olarak, tüm örnekleri konfokal bir mikroskop kullanarak incelediler. Sonuçlar, sfingomiyelinaz eksikliği olan hücrelerin hücre içi FM moleküllerinin sağlam birikimini gösterdiğini gösterdi. Öte yandan, kontrol hücreleri minimal FM akışı gösterdi, bu da plazma membranı onarımında sfingomiyelinazın rolünü düşündürdü.

Az önce JoVE'nin vezikül geri dönüşümündeki FM boyaları hakkındaki videosunu izlediniz. Video, FM boyalarının biyokimyasını tanımladı, sinaptik vezikül geri dönüşümünü boyamak ve ölçmek için bir protokolü detaylandırdı ve son olarak bu boyaları farklı şekillerde kullanan mevcut deneyleri özetledi. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!