Numune hazırlama ve transmisyon elektron mikroskobu tarafından Exosomes görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, saflaştırılmış hücre dışı veziküllerin morfolojisini gözlemlemek ve elektron mikroskobu kullanarak hücre dışı veziküller içinde spesifik protein lokalizasyonu gerçekleştirmektir. Bu yöntem, hücre dışı vezikül araştırma döneminde, eksozomun ve içinde bulunan spesifik proteinlerin kategorizasyonu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, eksozomun hem içinde hem de dışında bulunan spesifik proteinlerin bir kısmını gözlemlemek için kullanılabilmesidir.

Bu tekniğin anlamı, kanser ve bakteri enfeksiyonları dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların teşhisini sağlamaktır. Bu yöntem eksozom hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer biyolojik örneklere, mikro hücresel inkübasyona ve spesifik protein lokalizasyonuna da uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, immünogold partikülünün spesifik olmayan bağlanması sırasında kontaminasyon oluşturması nedeniyle mücadele edeceklerdir.

Standart teknikleri kullanarak, kültürde eksozomlar hazırlayın. Daha sonra, eksozomları ortamdan peletlemek için HCT116 hücrelerinin kültür süpernatantını ultrasantrifüjleyin. Peletlendikten sonra, kültür süpernatantını dikkatlice çıkarın.

Saflaştırılmış eksozom peletini sabitlemek için, PH 7.0'da 0.1 molar soldium kakodilat çözeltisine bir mililitre %2.5 glutaraldehit ekleyin. Lipid yan tabaka veziküllerini dört santigrat derecede bir saat inkübe edin. Daha sonra, fiksatifi çıkarın ve peletleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir mililitre 0.1 molar sodyum kakodilat tampon çözeltisi ile durulayın.

Daha sonra numuneleri dört santigrat derecede bir saat boyunca bir mililitre% 2 osmiyum tetroksit ile sabitleyin. Sabitleyiciyi çıkarın ve eksozom peletini 0.1 molar sodyum kakodilat tamponu ile üç kez durulayın ve tamponu her on dakikada bir değiştirin. Daha sonra numuneyi, her biri bir dizi kademeli aseton konsantrasyonunda 10 dakika çalkalayarak kurutun.

Daha sonra, üç kısım aseton ve bir kısım düşük viskoziteli gömme karışımından oluşan bir çözeltiyi karıştırın. Asetonu bu karışımla değiştirin ve numuneyi 30 dakika inkübe edin. Düşük viskoziteli gömme ortamının oranını artırmaya devam edin, her adımda 30 dakika inkübe edin.

En sonunda, eksozom peletini düşük viskoziteli gömme karışımının %100'ünde gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Ertesi gün, numuneyi bir gömme kalıbı kullanarak saf düşük viskoziteli gömme karışımına gömün ve 65 santigrat derecede 24 saat pişirin. Bir ultramikrotom kullanarak, 60 nanometre kalınlığında bölümler hazırlayın.

Bölümleri bir nikel ızgara üzerine yerleştirin ve bazılarını 20 dakika boyunca %2 uranil asetat ile çift boyayın, ardından 10 dakika kurşun sitrat ile boyayın. Ardından, lekeli bölümü bir transmisyon elektron mikroskobuna yerleştirin ve numuneyi 80 kilovolt kullanarak görüntüleyin ve maruz kalma süresi için otomatik ayarları izleyin. Görünümde bir eksozom görüntüsü varken, mikroskop yazılımını kullanarak görüntüyü alın ve kaydedin.

Başlamak için, serbest aldehit gruplarını söndürmek için 60 nanometre kalınlığında, boyanmamış bölümler içeren ızgaraları 50 mikrolitrelik damlalarda 0.02 molar glisin 10 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, bölümleri 100 mikrolitre damıtılmış suda her biri 10 dakika boyunca üç kez durulayın. Son durulamayı takiben, bölümleri %1 BSA içeren PBS'de oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Daha sonra, ızgaraları bir saat boyunca 50 ila 100 mikrolitrelik bir anti-KRS antikoru damlasında inkübe edin. Daha sonra, ızgaraları her biri% 0.1 BSA içeren bir PBS damlasında 10 dakika boyunca beş kez yıkayın. Daha sonra, ızgaraları uygun bir ikincil antikorun bir damlasına aktarın ve bölümleri oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Şimdi, ızgaraları 10 dakika boyunca beş kez, her biri% 0.1 BSA içeren ayrı bir PBS damlası ile yıkayın. Bölümleri karanlıkta 20 dakika boyunca %2 uranil asetat ile çift boyayın, ardından 10 dakika boyunca Reynolds kurşun sitrat uygulayın. Lekeli bölümü bir transmisyon elektron mikroskobuna yerleştirin ve numuneyi 80 kilovolt kullanarak görüntüleyin ve daha önce gösterildiği gibi görüntüleyin.

Negatif boyama yapmak için, izolasyonu takiben saflaştırılmış eksozomları bir mililitre %2 paraformaldehit ile beş dakika boyunca sabitleyin. İnce, formvar / karbon film kaplı, 200 gözenek, bakır EM ızgaralarını bir dakika boyunca kızdırma deşarjı ile tedavi edin, ardından bir ızgaraya beş ila yedi mikrolitre eksozom süspansiyon çözeltisi yükleyin ve bir dakika boyunca inkübe edin. Eksozom konsantrasyonu çok yüksekse, konsantrasyonu uygun bir seviyeye seyreltin.

Eksozomları, EM ızgarasının yüzeyinde yaklaşık 20 damla filtrelenmiş %1 uranil asetat çözeltisi ile hemen boyayın. Izgara kenarını filtre kağıdı ile temas ettirerek fazla uranil asetat çözeltisini ızgaradan çıkarın, ardından ızgarayı bir damla su ile hızlıca durulayın. Izgarayı masanın üzerine yerleştirmek için bir cımbız kullanın ve ızgarayı kısmen bir kültür kabı ile örtün.

Izgaranın oda sıcaklığında 10 dakika kurumasını bekleyin ve ardından ızgarayı görüntüleyin veya ileride gözlemlemek için bir elektron mikroskobu ızgara kutusunda saklayın. İnce formvar / karbon film kaplı, 200 gözenekli bakır EM ızgaralarını 30 saniye boyunca kızdırma deşarjı ile işlemden geçirerek başlayın. Daha sonra, ızgaraya% 2 paraformaldehit çözeltisine sabitlenmiş eksozomların beş ila yedi mikrolitresini yükleyin ve beş dakika boyunca orada inkübe edin.

Daha sonra, eksozomları 100 mikrolitre PBS ile her biri 10 dakika boyunca üç kez durulayın. Serbest aldehit gruplarını söndürmek için eksozom içeren ızgaralara 50 mikrolitre 0.5 molar glisin çözeltisi ile 10 dakika muamele edin. Ardından, ızgaraları %1 BSA içeren bir PBS damlasına aktarın ve 30 dakika boyunca bloke edin.

Şimdi ızgaraları 50 ila 100 mikrolitre anti-PD-L1 antikoru ile oda sıcaklığında bir saat veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Izgarayı, her biri 10 dakika boyunca% 0.1 BSA içeren beş ayrı PBS damlası ile yıkayın, ardından ızgarayı bir saat boyunca ikincil antikorun bir damlasına aktarın. Daha sonra, ızgarayı her biri 10 dakika boyunca% 0.1 BSA içeren beş ayrı PBS damlası ile yıkayın, ardından ızgarayı iki ayrı damla damıtılmış su ile yıkayın.

Bittiğinde, daha önce gösterildiği gibi %2 uranil asetat ile negatif boyama yapın ve numuneleri görüntüleyin veya ileride gözlemlemek için bir EM ızgara kutusunda saklayın. Burada gözlenen eksozom morfolojisi, negatif boyamanın ürünüdür. Bu eksozomlar, kurutma işlemi sırasında meydana gelebilecek bir artefakt olan tipik bir fincan şeklinde morfoloji gösterir.

Eksozomdaki spesifik proteinlerin yeri gibi tam montajlı immünogold boyama kullanılarak ek bilgiler elde edilebilir. Burada, beyaz oklar PD-L1'in konumunu gösterir. Kesitli görüntülerde veziküller, eksozomların yapısal bir özelliği olarak bilinen bir lümen yapısı gösterdi.

Bunlar da eksozomlar boyunca spesifik proteinleri tanımlamak için immünogold ile boyanabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, immünogold boyama tekniği, uygun şekilde yapılırsa basit bir hazırlık ve kesit alma işleminden sonra fibröz hücrelerde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, iki farklı proteinin yerini aynı anda belirlemek için çift immünoboyama gibi başka bir yöntem de gerçekleştirilebilir.

Her gelişmeden sonra, bu teknik biyopsilerde hastalık teşhislerini araştırmak için hücre dışı veziküller alanında kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, eksozom içindeki spesifik protein lokalizasyonunu nasıl tanımlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Klorhidrat, paraformaldehit ve osmiyum tetroksit gibi sabitleyici solüsyonlarla çalıştıklarını ve son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman havalandırmalı çeker ocak ve lateks eldiven gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.