Plasenta Autophagy düzenlenmesi üzerinde anne obezite ile ilişkili iltihap etkisini incelemek için bir birincil insan Trofoblast modeli

Bu trofoblast hücre kültürü modelinin genel amacı, obezite ile ilişkili inflamasyonun trofoblastlardaki kritik yolların düzenlenmesi üzerindeki etkisini ölçmektir. Bu kontrol sisteminin en önemli avantajı, maternal obezite bağlamında TNF alfa aracılı inflamasyon ile plasentadaki gen regülasyonu arasında bir ilişki kurmasıdır. Bu deneysel sistemin temel avantajı, maternal obezite bağlamında plasentada TNF-alfa aracılı inflamasyon ile gen regülasyonu arasında ilişkiler kurmasıdır.

Prosedürü gösterenler, laboratuvarımdan teknisyenler Bailey Simon ve Matt Bucher olacak. Doğumdan sonra mümkün olan en kısa sürede, tercihen 30 dakika veya daha kısa sürede plasentadan vilayet dokusu örneklenmelidir. Koryonik plaka yukarı bakacak şekilde, plasentanın çevresinden iki ila üç santimetre içeride, rastgele iki ila üç tam kalınlıkta bölümü çıkarmak için forseps ve makas kullanın.

Plasentanın anormal görünen kısımlarından kaçının. Koryonik ve bazal plakaları ve büyük kan damarlarını kesin. Elde edilen villöz dokuyu ılık, tam bir ortama yerleştirin.

Villöz doku örneklemesinden 30 dakika sonra trofoblast izolasyonuna başlayın. Her bir villöz doku parçasını oda sıcaklığında PBS ile doldurulmuş 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin ve dokudaki fazla kanı serbest bırakmak için hafifçe çalkalayın. PBS'yi boşaltın ve yeni PBS ile değiştirin.

Fazla kanın çoğu çıkana kadar PBS durulamasını tekrarlayın. Doku iyice durulandığında PBS durulama açık kırmızı veya pembe olacaktır. Villöz dokuyu steril bir petri kabına yerleştirin ve yumuşak villöz dokuyu damarlardan nazikçe sıyırmak için bir mikroskop lamı kullanarak mümkün olduğunca çok kan damarını çıkarın.

Makas kullanarak, elde edilen villöz dokuyu ince bir şekilde kıyın. Kıyılmış villöz dokuyu, tripsin ve DNazın spesifik aktivitesine bağlı olarak hesaplanan hacimlere göre sindirim solüsyonu içeren steril bir şişeye aktarın. Sindirim şişesini 37 santigrat derece su banyosunda 70 rpm'de 35 dakika çalkalayarak inkübe edin.

35 dakika sonra, sindirim şişesini yan yatırın ve sindirilmemiş doku parçalarının şişenin dibine yerleşmesine izin verin. Süpernatanı, yerleşmiş dokudan kaçınarak serolojik bir pipetle dikkatlice çizin. Süpernatanı 100 mikronluk bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik konik tüpler arasında eşit olarak dağıtın.

Kalan çökmüş dokuya sindirim solüsyonu ekleyerek ve şişeyi 37 santigrat derece su banyosunda inkübe ederek ikinci sindirimi başlatın. Tüpün dibindeki serolojik bir pipetten yavaşça dağıtarak, ilk sindirimden itibaren süzülmüş süpernatantın altına üç ila beş mililitre yenidoğan buzağı serumu veya NCS'yi nazikçe katmanlayın. Trofoblast içeren gergin süpernatan ile NCS arasında bir menisküs görünür olmalıdır.

Süpernatanları NCS üzerinde 15 dakika boyunca 20 santigrat derecede 1, 250 kez g'de santrifüjleyin. Elde edilen pelet, en alt katmanda kırmızı kan hücrelerini ve ardından trofoblast hücrelerini içeren beyaz bir katmanı içerecektir. Aynı şekilde, süpernatanı ikinci ve üçüncü sindirimden süzün.

NCS'yi gergin süpernatantın altına yerleştirin ve 15 dakika boyunca 20 santigrat derecede 1, 250 kez g'de santrifüjleyin. Tüm süpernatantlar santrifüjlendikten ve NCS ve süpernatan katmanları çıkarıldıktan sonra, her peleti beş mililitre ılık, tam ortamda yeniden süspanse edin ve ardından süspansiyonları bir araya getirin. Hücre süspansiyonunu iki 50 mililitrelik konik tüp arasında eşit olarak bölün ve 15 dakika boyunca 20 santigrat derecede 1, 250 kez g'de santrifüjleyin.

Süpernatanı nazikçe çıkarın ve hücre peletlerinin her birini altı mililitre ılık, tam ortamda yeniden süspanse edin. Bu prosedüre başlamak için, hücre süspansiyonunu yoğunluk gradyanlarının üzerine yavaş ve dikkatli bir şekilde katmanlamak için bir transfer pipeti kullanarak hücre süspansiyonunu dört yoğunluk gradyanı arasında eşit olarak bölün. Yoğunluk gradyanlarını minimum hızlanma ve yavaşlama ile 20 dakika boyunca 20 santigrat derecede 1, 250 kez g'de santrifüjleyin.

Bu, ayırt edilebilir tortulu hücre bantları üretmelidir. Trofoblast hücreleri içeren opak banda ulaşılana kadar yoğunluk gradyan ortamının üst katmanını yavaşça ve dikkatlice çıkarın. Trofoblast bantlarını iki adet 50 mililitrelik konik tüpe aktarın ve ılık, tam ortamla doldurun.

Karıştırmak için tüpleri üç ila altı kez nazikçe ters çevirin ve 15 dakika boyunca 20 santigrat derecede 1, 250 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve her hücre peletini beş mililitre ılık, tam ortamda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonlarını birleştirin ve bir hemositometre ve tripan mavisi kullanarak canlı hücreleri sayın.

Hücre sayımından sonraki adım, hücreleri plakalamaktır. Her altı kuyucuklu plakada oyuk başına üç milyon hücre plaka. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakayı hafifçe ileri geri ve yan yana sallayın.

Hücrelerin eşit şekilde dağılmasına, yerleşmesine ve kuyucukların dibine yapışmaya başlamasına izin vermek için kaplanmış hücreleri laminer akış deliğinde yaklaşık 30 dakika bırakın. 30 dakika sonra, plakaları %5 karbondioksit ve %95 nem içeren 37 derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Bağlanmayı ve uygun trofoblast morfolojisini doğrulamak için 24 saatlik kültürden sonra trofoblastları mikroskop altında inceleyin.

Hücreler 24 saatlik kültürden sonra tedavi edilebilir. Kültür ortamını hücrelerden aspire edin ve oyuk başına iki mililitre TNF alfa takviyeli ortam ile değiştirin. Plakaları 37 santigrat derece inkübatöre geri koyun.

24 saatlik TNF alfa maruziyetinden sonra, TNF alfa takviyeli ortamı tam ortamla değiştirin. 24 saat daha kuluçkaya yatırın. TNF alfa'nın çıkarılmasından 24 saat sonra, ortamı aspire edin ve hücreleri oda sıcaklığında PBS ile nazikçe durulayın.

Her bir oyuğa doğrudan yeni eklenmiş proteaz ve fosfataz inhibitörleri içeren 80 mikrolitre buz gibi soğuk radyoimmünopresipitasyon test tamponu ekleyin. Hücreleri bir hücre kazıyıcı ile plakadan çıkarın. Hücreleri 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tedavi grupları içinde kuyuları toplayın.

Tüpleri en az üç kez 15 saniye boyunca yüksekte girdaplayarak hücreleri buzlayın. Hücreleri 15 dakika boyunca sallayarak dört santigrat derecede inkübe edin. Tüpleri tekrar yüksekte vorteksleyin.

Hücresel kalıntıları peletlemek için dört santigrat derecede beş dakika boyunca 10.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücresel protein örneklerini, ilgilenilen protein için Western blotting ile analiz edilene kadar 80 santigrat derecede saklayın.

72 saatlik kültürden sonra, primer trofoblastlarda kırmızı ile gösterilen sitokeratin 7'nin immünositokimyasal analizi, hücrelerin çok çekirdekli hücre kütlelerinin varlığı ile kanıtlanan sinsityalizasyona uğradığını doğrulamaktadır. Ayrıca, vimentinin immünositokimyasal analizi, yine kırmızı renkte, çok az sayıda kontamine fibroblast ortaya çıkardı. Nükleer karşı boyama her iki resimde de mavi renkle gösterilmiştir.

Mililitre başına 250 pikograma kadar TNF alfa ile muamele yukarı regüle edilmiş rubicon ekspresyonu. Mililitre başına 250 pikogramdan daha yüksek TNF alfa konsantrasyonlarında, rubicon ekspresyon seviyeleri taban çizgisine ve hatta altına doğru azalmıştır. Benzer şekilde, rubicon, dişi fetüsleri olan obez gebeliklerden elde edilen plasentalardan alınan flaş donmuş villöz doku biyopsilerinde, zayıf kontrollere kıyasla önemli ölçüde yukarı regüle edilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, trofoblastların villöz dokudan izolasyonu, uygun şekilde yapılırsa altı ila yedi saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, bilinçli ve verimli bir şekilde çalışabilmeniz için malzemeleri ve reaktifleri önceden hazırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, obez intrauterin ortamdaki iltihaplanmanın trofoblastların metabolik kapasitesini etkileyip etkilemediği gibi ek soruları yanıtlamak için hücresel biyoenerjetik ölçenler gibi başka testler de yapılabilir.

Bu gelişmeden sonra yöntem, plasental araştırmacıların maternal ortamın trofoblast fonksiyonu üzerindeki etkisini ortaya koymasının yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, hücre kültürü deneyiniz için trofoblastları villöz dokudan nasıl izole edeceğinizi ve trofoblastlardaki kritik yolların düzenlenmesinde TNF alfa aracılı inflamasyonun etkisini nasıl belirleyeceğinizi iyi bir şekilde anlayacaksınız. İnsan dokusu, kültürlenmiş hücreler, DMSO, akrilamid ve indirgeyici reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun KKD giymek ve aseptik teknik kullanmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.