Nematot Caenorhabditis Elegans - konak-mikrop etkileşimleri çalışmaya çok yönlü Vivo içinde manken

Bu testin genel amacı, model organizma C. Elegans'ta mantar enfeksiyonunun etkisini gözlemlemektir. Bu yöntem, patojen virülans faktörleri, konakçı bağışıklık efektörleri ve ilaç keşfi gibi bulaşıcı hastalık alanındaki temel mekanik soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, konak-patojen etkileşimlerini her iki açıdan da incelemek için deneysel olarak izlenebilir bir sistem olmasıdır.

Hızlı, kolay ve uygun maliyetli bir sistemdir. Bu özel yöntem, mantar patojenleri hakkında bilgi sağlayabilse de, canlı bir konakçıdaki mikrobiyal etkileşimleri incelemek için bakteriler ve hatta çoklu organizmalar gibi diğer bulaşıcı ajanlara da uygulanabilir. Solucan penası yapmak için, 1,5 santimetrelik bir alüminyum tel parçası kesin ve ardından telin yaklaşık 0,5 santimetresini bir pastör pipetinin ucuna dikkatlice yerleştirin.

Bir Bunsen brülörü veya alkol lambası kullanarak, pipet ucunun orijinal şeklinden ödün vermeden tel pipete güvenli bir şekilde yapışana kadar cam pipet ucunu alevin içinde yavaşça döndürerek eritin. Son olarak, forseps kullanarak, küçük bir halka oluşturmak için telin ucunu dikkatlice bükün. Büyük miktarlarda solucanları yeni plakalara hızlı bir şekilde aktarmak için, seçilen solucanları içeren bir NGM agar parçasını kesmek için bir spatula kullanın.

Ardından kesilen parçayı çıkarın ve yüzü aşağı bakacak şekilde OP50 yamasının kenarına yeni bir plaka üzerine yerleştirin. Solucanları tek tek aktarmak için, solucan penasındaki teli kırmızı olana kadar alevlendirin, ardından alevden çıkarın ve birkaç saniye soğumaya bırakın. Kazma üzerindeki teli kullanarak, yeni plaka üzerinde büyütülen OP50 kültürünün yamasını kazma üzerindeki teli kaplayacak şekilde nazikçe kazıyın.

Telin ucunu kaplayan viskoz kültür, solucanların çukurun ucuna yapışmasını sağlar. Bu nedenle, seçilen solucanları nazikçe almak için bir kaydırma hareketi kullanın. Seçilen solucanlar toplandıktan sonra, kültürü agar boyunca nazikçe kaydırarak onları yeni bir tabağa yerleştirin.

Ardından, kazma üzerinde kalan kültürü çıkarmak için teli aleve yerleştirin. Yaklaşık 20 yetişkin hayvanı, 50 mikrolitre E.coli suşu OP50 ile oturtulmuş bir tabağa toplayarak veya parçalayarak yerleştirin. Yumurtaları toplamak için, bir ila iki gün sonra, plakayı 10 mililitre M9 tamponu ile doldurun.

Daha sonra bir cam serolojik pipet kullanarak, OP50'ye yapışmış yetişkin hayvanları veya yumurtaları serbest bırakmak için agar plakasındaki içeriği döndürün ve hafifçe çalkalayın. Yumurtaları ve yetişkinleri içeren tüm sıvıyı toplayın. M9 ve OP50 çözeltisini 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Tüpü iki dakika boyunca 2.100 x g'da santrifüjleyin. Ardından, peleti rahatsız etmeden yaklaşık dokuz mililitre süpernatan aspire edin. Ardından, peleti yeniden süspanse etmek için iki mililitre steril su, bir mililitre çamaşır suyu ve bir mililitre 0.25 molar sodyum hidroksit kullanın.

Yetişkin hayvanların yaklaşık% 70'i parçalanmış görünene kadar ters çevirerek nazikçe karıştırın. Tipik olarak yumurtalar, kabukları nedeniyle bu kısa ağartma işlemi sırasında bozulmadan kalır. Bu adımda çamaşır suyuna maruz kalma miktarının sınırlı olması çok önemlidir.

Çamaşır suyuna uzun süre maruz kalmak yumurtaları tahrip eder. Yumurta hazırlığı başarısız olursa, ağartıcıya maruz kalma süresini sınırlayın veya çözeltiyi seyreltin. Konik tüpü 990 x g'da iki dakika santrifüjleyin.

Peleti rahatsız etmeden süpernatanı aspire edin. Ardından peleti 10 mililitre M9 tamponunda yeniden süspanse edin. Tekrar döndürdükten ve peleti bozmadan süpernatanı çıkardıktan sonra, peleti yeniden süspanse etmek için 200 mikrolitre M9 tamponu kullanın.

Üç ila beş mililitre YPD'yi steril bir test tüpüne dağıtın ve tek bir Candida albicans kolonisi ile aşılamak için steril bir halka kullanın. Tüpü yaklaşık 16 ila 18 saat boyunca 30 santigrat derecede döner bir tambur üzerine yerleştirin. Bir 1.5 mililitrelik mikrofüj tüpünü C.albicans içerecek şekilde ve diğerini OP50 içerecek şekilde etiketleyin, ardından her boş tüpün ağırlığını kaydedin.

Gece boyunca C.albicans kültürünün 500 mikrolitresini C.Albicans etiketli tüpe aktarın. Ve gece boyunca OP50 kültüründen 1500 mikrolitre OP50 etiketli tüpe. Tüpleri 16, 100 x g'da 10 dakika santrifüjleyin, ardından peletleri rahatsız etmeden süpernatanı aspire edin.

Her peleti yeniden süspanse etmek için 500 mikrolitre steril su kullanın. Daha sonra tüpleri beş dakika boyunca 16, 100 x g'de santrifüjleyin. Peletleri rahatsız etmeden süpernatanı aspire edin.

Ardından mikrofüj tüplerinin son ağırlığını kaydedin. Mikrofüj tüplerinin başlangıç ağırlığını son ağırlıktan çıkararak her bir peletin ağırlığını belirleyin. Steril su kullanarak, C.albicans peletini mililitre başına 10 miligrama ve OP50 peletini mililitre başına 20 miligrama kadar yeniden süspanse edin.

Daha sonra, mililitre Streptomisin çözeltisi başına 50 miligramlık 10 mikrolitreyi birleştirerek bir ana enfeksiyon karışımı yapın. 2.5 mikrolitre OP50 kültürü. 0.5 mikrolitre C.Albicans kültürü ve 7 mikrolitre steril su.

Kontrol plakaları için, C.albicans kültürünün hacmini steril su ile değiştirerek bir ana karışım oluşturun. Daha sonra 20 mikrolitre enfeksiyon karışımını veya OP50 kontrol solüsyonunu NGM plakalarının ortasına tohumlamak için bir mikropipet kullanın. Bu videoda daha önce gösterildiği gibi yumurtaları hazırladıktan sonra, diseksiyon kapsamı altındaki yumurtaları sayın.

Ve mikrolitre başına yaklaşık beş ila altı sağlıklı yumurta konsantrasyonu elde edilene kadar yumurta çözeltisini seyreltmek için M9'u kullanın. Bir pipet kullanarak, yaklaşık 30 yumurta içeren 20 mikrolitrelik bir numuneyi, bakteri kültürü ile plakanın kenarı arasındaki alanda hazırlanmış bir NGM plakasına dağıtın. Plakaları 48 saat boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra, bir diseksiyon mikroskobu altında, her plakadaki canlı ve ölü yetişkin solucanların sayısını sayın. Kafasına alüminyum bir tel ile vurulmasına veya plakaya vurulmasına yanıt vermiyorsa, hayvanın öldüğünü düşünmek. Ayrıca Dar ile solucan sayısını sayın ve diseksiyon mikroskobu sahnesinde plakaya hızlıca dokunarak bir hayvanın Dar'a sahip olup olmadığını onaylayın.

Dar'ı olmayan hayvanlar hemen geriye doğru hareket ederken, Dar'lı hayvanlar yönlerini tersine çevirmek için ya tekrar tekrar dokunma turlarına ihtiyaç duyacak ya da bunu hiç yapmayacaklar. Her iki günde bir, solucanları toplayarak kalan yetişkin solucanları yeni bir enfeksiyon veya kontrol plakasına aktarın. Bu noktada, gerekirse, her gün canlı, ölü ve eksik solucanların sayısını izleyerek bir hayatta kalma testi yapın.

Solucanları en az iki günde bir transfer etmek önemlidir. Bu, bu tahlilde puanlanan yetişkin solucanların döllerinde karıştırılmamasını sağlar. C. elegans, altı günlük bir süre boyunca C. albicans'a maruz bırakıldı ve enfeksiyon belirtileri, hastalığın ilerlemesi ve ölüm açısından gözlendi.

Dar fenotipi, enfekte olmamış hayvanda görünmeyen çıkıntılı bir anal bölge tarafından belirtildiği gibi, hayatta kalma testinin dördüncü gününde en çok görülür. C.albicans tarafından enfekte olan solucanların vulva bölgesinde şişlik sergilediği de bilinmektedir. Her iki durumda da solucan bu aşamaya ulaştıktan sonra enfeksiyonu temizleyemez.

Bağırsak lümeninde C. Albicans'ın kolonizasyonunu görselleştirmek için, solucanlar, kolonizasyon alanlarının kırmızı floresan olmasına neden olan RFP ile etiketlenmiş vahşi tip C.albicans ile beslendi. C.albicans, testin üçüncü gününde bağırsak lümenini kolonize eder. Burada gösterildiği gibi, enfekte solucanlar, enfekte olmamış kontrolde gözlenenden daha şiddetli bağırsak şişliği gösterdi.

Bu deneyde, solucanların öldürücü bir C.Albicans efg1/efg1 cph1/cph1 çift mutantının neden olduğu enfeksiyondan kurtulma yetenekleri test edildi. Çift mutant ile enfekte olmuş solucanlar, kontrollerden istatistiksel olarak anlamlı derecede daha uzun yaşarlar. Bu iki genin C. albicans'ın C. Elegans'a karşı virülansı için gerekli olduğunu düşündürmektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu tekniğin her bir parçası, solucanın ömrünün her günü bir ila iki saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, kişinin bulaşıcı ajanlar kullanıyor olabileceğini hatırlamak önemlidir. Bu nedenle uygun biyogüvenlik önlemleri uygulanmalıdır.

Bu temel prosedürde, canlı bir konakçı bağlamında mikrobiyal etkileşimleri incelemek için ek mikrobiyal ajanların tanıtılması gibi küçük değişiklikler yapılabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, bulaşıcı hastalıklar alanındaki araştırmacıların mikrobiyal virülansı, konakçı doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinin mekanizmalarını ve yeni antimikrobiyal ajanların keşfini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, C.Elegans'ı nasıl koruyacağınızı ve manipüle edeceğinizi iyi anlamalı ve organizmayı moleküler düzeyde konakçı mikrop etkileşimlerini incelemek için kullanmalısınız.

Mikrobiyal patojenler ve sodyum azid gibi kimyasal reaktiflerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve KKD ve atık bertaraf yöntemleri gibi uygun güvenlik önlemlerinin alınması gerektiğini unutmayın.