İmalat ve Fiber Griffithsin-modified iskele karakterizasyonu önlenmesi için cinsel enfeksiyonlar iletilen

Bu prosedürün genel amacı, değişen miktarlarda antiviral protein Griffithsin ile polilaktik asit, ko-glikolik asit, elektrospun lifleri imal etmek ve yüzey modifiye etmektir. Bu yöntem, HIV-1 gibi cinsel yolla bulaşan viral enfeksiyonları önleyebilecek yeni dağıtım araçlarının nasıl formüle edileceği ve karakterize edileceği gibi ilaç dağıtım alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Tekniğin ana avantajı, Griffithsin'in antiviral aktivitesinin, polimerik-elektroeğrilmiş liflerin, lif yüzeyinde yüksek oranda lokalize Griffithsin'e sabit bir iskele olarak kullanılmasıyla maksimize edilmesidir.

Bu tekniğin etkileri, Griffithsin'in çeşitli enfeksiyon türlerine karşı güçlü profilaktik ve terapötik potansiyeli nedeniyle diğer viral ve bakteri enfeksiyonlarının tedavisine kadar uzanır. Bu yöntem HIV-1 enfeksiyonunun önlenmesi konusunda fikir verebilse de, Griffithsin'in etki gösterdiği diğer viral veya bakteriyel enfeksiyonlar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu işleme başlamak için, 720 miligram 50/50 PLGA'yı 10 mililitrelik bir parıldama aşağılığına tartın.

Serolojik bir cam pipet kullanarak 3.0 mililitre HFIP ekleyin. Aşağılığı plastik filmle örtün. Ardından, aşağılık kütleyi ölçün ve kaydedin.

Polimerin tamamen çözünmesini sağlamak için polimer süspansiyonunu gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bundan sonra, elektrospinning aparatını metin protokolünde belirtildiği gibi hazırlayın. Polimer çözeltisini aspire etmek için üç mililitrelik bir şırınga kullanın.

Ardından, şırıngaya kör bir 18 gauge 0,5 inç iğne ucu bağlayın. İğnedeki boş kafa boşluğunu gidermek için fazla çözeltiyi dağıtın. Şırıngayı bir şırınga pompasına yerleştirin ve cihaz akış hızını saatte 2.0 mililitreye ayarlayın.

Güç kaynağını şırınga iğnesine bağlayın. Pozitif 27 kilovoltluk bir voltaj kullanarak polimer çözeltisini elektrospinleyin. Tüm çözelti elektrospütle çevrildikten sonra, güç kaynağını kapatın.

Çözücüyü tamamen buharlaştırmak için mandrilin 30 dakika daha dönmesine izin verin. Ardından, dönen mandril toplayıcıyı kapatın. Bir tıraş bıçağı kullanarak, lifi mandrilden nazikçe soyun.

Elektrospun PLGA elyafını etiketli bir petri kabına toplayın. Kalan çözücüyü çıkarmak için çanağı gece boyunca bir kurutucuya koyun. Başlamak için, PBS ve MES çözümlerini metin protokolünde belirtildiği gibi hazırlayın.

Ardından, EDC ve NHS'yi dondurucudan çıkarın. Oda sıcaklığına denk gelmeleri için dinlenmelerine izin verin. Bundan sonra, dört miligram EDC'yi 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne tartın.

Altı miligram NHS'yi farklı bir mikro santrifüj tüpüne tartın. Her tüpe bir mililitre MES tamponu ekleyin. Reaktiflerin tamamen çözündüğünden emin olmak için her iki tüpü de kuvvetlice vorteksleyin.

Ardından, 50 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne 70 miligram hidroksilamin tartın. 20 mililitre PBS ve girdap ekleyin. Uygun miktarda PLGA fiberini 15 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne koyun.

Fibere sekiz mililitre MES tamponu ekleyin. Ardından, hem EDC hem de NHS çözeltilerinden bir mililitre ekleyin. 15 mililitrelik konik santrifüj tüpünü kapatmak için plastik film kullanın.

Çözeltiyi oda sıcaklığında 15 dakika boyunca nazikçe ters çevirmek için tüpü bir döndürücü üzerine yerleştirin. Bundan sonra, reaksiyonu söndürmek için 14 mikrolitre beta-merkaptoetanol ekleyin. Tam karışımı sağlamak için tüpü birkaç kez ters çevirin.

Süpernatanı atın ve her yıkama için 10 mililitre PBS kullanarak PLGA elyafını iki kez durulayın. Metin protokolünde belirtildiği gibi tüpe uygun miktarda GRFT stok çözeltisi ekleyin. Ardından, son hacmi sekiz mililitreye getirmek için yeterli PBS ekleyin.

İyice karıştırmayı sağlamak için tüpü kapatın ve ters çevirin. Tüpü plastik film ile kapatın. Çözeltiyi iki saat boyunca nazikçe ters çevirmek için tüpü döndürücünün üzerine yerleştirin.

Bundan sonra, hazırlanan hidroksilamin çözeltisinden iki mililitre ekleyerek ve 30 saniye boyunca girdaplayarak reaksiyonu söndürün. Süpernatanı atın. Yüzey modifiye edilmiş PLGA elyafını 10 mililitre ultra saf su kullanarak ve her yıkama için girdap yaparak iki kez durulayın.

Daha sonra, yıkanmış lifi bir petri kabına aktarın. Lif tamamen kuruyana kadar petri kabını bir desikatörün içine yerleştirin. Ardından petri kabını dört santigrat derecede saklayın.

Başlamak için, üç adet 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpü yerleştirin. Her birine iki miligram lif ekleyin. Ardından, her tüpe bir mililitre DMSO ekleyin.

Lifi tamamen çözmek için oda sıcaklığında bir dakika girdaplayın. Bundan sonra, 10 mikrolitrelik bir alikotu TE tamponunda en az 100 kat seyreltin. Eliza ile yükleme karakterizasyonuna kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın.

5 ila 10 miligram yüzey modifiye edilmiş elyafı tartın ve bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Her tüpe yerleştirilen lif kütlesini kaydedin. Daha sonra, her bir numunenin fizyolojik ortamını taklit eden bir mililitre çözelti ekleyin.

Numuneleri bir saat boyunca 200 RPM ve 37 santigrat derecede dönen bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Bundan sonra, desorbe edilmiş GRFT'yi içeren çözeltinin yaklaşık bir mililitresini çıkarın ve küme tüplerine ayırın. Protein miktar tayini yapmaya hazır olana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Ardından numuneyi yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Bir mililitre taze tampon çözeltisi ekleyin ve metin protokolünde belirtildiği gibi bir sonraki zaman noktasına kadar inkübe edin. Bu çalışmada, PLGA elektroeğrilmiş elyafların imalatı için koşullar incelenmiştir.

Boş, 0.05 nanomol, 0.5 nanomol ve 5 nanomol GRFT liflerinin SEM analizi, GRFT modifikasyonunun lif morfolojisi üzerinde hiçbir etkisi olmadığını göstermektedir. Tüm oluşumların, yaklaşık 1.9 mikron gibi benzer ortalama çaplara sahip olduğu görülüyor ve bu da modifiye edilmiş imalat sürecinin partiler arasında tutarlılığını gösteriyor. Elektroeğrilmiş liflerde konjuge edilen GRFT miktarı daha sonra belirlenir.

5 nanomol modifikasyonu 373 nanogram GRFT içerirken, 0.5 ve 0.05 modifikasyonları sırasıyla 165 ve 42 içerir. Bu, daha yüksek teorik yüzey modifikasyon yoğunluğu ile konjuge edilmiş liflerin, fibere daha fazla GRFT konjuge ile sonuçlandığını göstermektedir. Bununla birlikte, ortaya çıkan konjugasyon verimliliğinde ters bir korelasyon görülebilir.

Daha sonra, elyafa kovalent olarak konjuge edilen GRFT miktarı değerlendirilir. İlk dört saat içinde, sırasıyla 5 nanomol, 0.5 nanomol ve 0.05 nanomol teorik modifikasyon konsantrasyonlarında miligram elektroeğrilmiş lif başına 113 nanogram, 25 nanogram ve 10 nanogram GRFT tespit edilir. Dört saat sonra, her üç formülasyon için de salım elütesinde ihmal edilebilir GRFT tespit edilir.

Bu veriler, GRFT'nin çoğunluğunun elektroeğrilmiş liflere kovalent olarak bağlı olduğunu ve yüzey tarafından emilen GRFT'nin ilk dört saat içinde serbest bırakıldığını göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık dört gün içinde yapılabilir. Polimer elyaf iskelesinin elektroeğirilmesi, polimer çözeltisinin hazırlanması ve elektrospinning için iki gün gerektirir.

Yüzey modifikasyonu, müteakip kurutma ve elyaf karakterizasyonu en az iki ek gün gerektiriyordu. Bu prosedürü denerken, optimum modifikasyonu sağlamak için uygun reaktif oranlarını korumayı unutmamak önemlidir. Ayrıca, uygun lif morfolojisini sağlamak için electospinning parametrelerinin doğru olduğunu doğrulamak da önemlidir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, ilaç dağıtımı alanındaki araştırmacıların, yalnızca lif içindeki antiviral ajanları kapsüllemekle kalmayıp, aynı zamanda lif yüzeyi boyunca aktif maddeleri konjuge etme kapasitesine sahip elektrospun lifleri üretmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, polimerik fiberin nasıl elektrospin yapılacağını, anti-viral protein Griffithsin ile elyafın yüzey modifikasyonunun nasıl gerçekleştirileceğini ve elyafa konjuge edilmiş kalitatif Griffithsin'in nasıl yapıldığını iyi anlamalısınız. HFIP, beta-merkaptoetanol, EDC ve NHS gibi reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Bu işlem yapılırken KKD'nin uygun şekilde uygulanması ve kimyasal çeker ocakların kullanılması gibi önlemler her zaman alınmalıdır.