Name: Vitro Osteoclastogenesis üzerinde doğal uranyum etkileri analiz yöntemleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Öğrenin, doğal uranyumun osteoklast canlılığı, farklılaşması ve işlevi üzerindeki etkilerini RAW 264.7 hücre kültürü kullanarak nasıl araştırılacağını. Bu yöntem çevre toksikolojisi ve kemik metabolizması çalışmaları için yeni bir tarama aracı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Chantal Cros yararlı teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma gelen hibe tarafından finanse edildi "Komiserliği à l'Energie Atomique et aux enerji alternatifleri" (URANOs - programı enine de Toxicologie du CEA ve CPRR CEA-AREVA) ve ANR üzerinden (uranyum toksisite: biomineralization çok düzeyli yaklaşım «««işlem) kemik, ANR-16-CE34-0003. Bu eser de CNRS ve güzel Sophia Antipolis Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.

1. Uranyl asetat çözüm hazırlanması
<ol><li>Uranyl asetat (UO2(OCOCH3)2, 2 H2O; 85 mg 2 mL 100 mM uranyl asetat çözeltisi hazırlamak için Ekle M 424 g.mol-1=) 5 mL plastik tüp için sağlam durumda.</li>
	<li>Plastik tüp 2 mL distile su ekleyin ve plastik bir tıpa ile uygun.</li>
	<li>Tüp katı toplam dağılmasına kadar şiddetle çalkalanır. Çözüm 24 h için buzdolabına koyun. Dikkat: Uranyl [U(VI)] manipülasyonu bazı kimyasal ve radyolojik tehlike sunar. Tüm örneklerini hazırlanan ve belirli laboratuarlarında özel ekipman ile karakterize. Tüm U VI içeren sıvılar ve özel olarak atanan atık kaplarda toplanan olmalıdır zehirli atık bertaraf. Kuru atık (pipets, tüpler, vb) 0.1 N HNO3 çözüm ile solubilize ve U(VI) kaldırmak yıkanmış.</li>
	<li>Bir elektrot ve pH-metre kullanarak çözüm pH doğrulayın. Not: Elektrot daha önce ticari tampon çözeltiler kullanarak ayarlanması (pH = 4 ve pH = 7).</li>
</ol>2. ham 264.7 hücre kültürü
<ol><li>
Bakım hücre.
	<ol>
<li>75 cm2 şişeler aşağıdaki büyüme orta ham 264.7 hücreler (ATCC, TIB-71) yetiştirmek: Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) %5 Fetal sığır Serum ve antibiyotik ile desteklenmiş: 100 IU/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin. Kuluçka 37 ° c, % 5 CO2hücreleri korumak.</li>
		<li>Orta 2-3 günde değiştirin. Hücreleri % 85-90 birleşmesi olduğunuzda, mekanik bir hücre kazıyıcı (ATCC tarafından önerilen gibi) kullanarak kültür şişeye onları kaldırmak ve 1:6 oranında bölüp. Not: yalnızca hücreleri pasajlar 3 ile 10 arasındaki farklılaşma denemeleri için kullanılır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Deneyler için hücreleri hazırlanması
	<ol>
<li>Yukarıda açıklandığı gibi şişesi substrat hücrelerden çıkarmak ve steril 50 mL tüp aktarabilirsiniz. Hücreleri yukarı ve aşağı kümeleri kırmaya pipetting tarafından karıştırın. Bir hemasitometre ile Sayın. 75 cm2 şişe başına 35-40 milyon hücre bekliyoruz.</li>
		<li>Birim hücre süspansiyon her deneme için gerekli, aşağıdaki gibi hesaplar: Deneysel sayısı x 3 (triplicates) x 1 mL/iyi + 3-4 mL (pipetting zararları) koşulları. Not: Bu protokol için açıklanan tüm deneyleri için yoğunluğu tohum 5000 hücre/cm2' dir. Bu nedenle, bir 24-şey plaka orta 1 mL bir kuyu başına 10.000 hücre anlamına gelir, ve hücre süspansiyon böylece 10.000 hücre/mL yoğunluğudur.</li>
		<li>Gerekli hacmi 10.000 hücre/mL hücre süspansiyon hazırlamak ve hücreleri 24-şey kalıplara temel olarak belirler. Sitotoksisite deneyleri için normal büyüme aracı kullanın. Farklılaşma ve rezorpsiyonu deneyleri için en az gerekli orta (2 mM L-glutamin, 5 ile desteklenmiş αMEM) kullanım Alfa değiştiren % FBS ve GST-RANKL1750 ng/mL. Not: GST-RANKL şirket içinde üretilen protein herhangi bir ticari olarak mevcut RANKL sitokin tarafından değiştirilebilir. Yeni bir RANKL toplu işlemi ile çalışırken, 20 ila 150 ng/mL aralığında değişen RANKL konsantrasyon ile bir doz yanıt deney yaparak osteoclastogenesis inducing etkinliğini test etmek yararlı olabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Kültür orta 100 mM Uranyl asetat çözümde seyreltme
Not: Uranyl iyonu [U(VI)] kültür orta onun hücresel toksisite18,19,20,21değiştirebilir orta diğer bileşenleri ile birden fazla kompleksler oluşturur. Bu nedenle, uranyl içeren medya altercations atlama veya denge adımları kısaltmak hazırlanmalıdır.
<ol><li>Pozlama konsantrasyonları uranyl seçti ve kültür (her koşul nüsha gerçekleştirilir dikkate alarak) deney için gerekli ortam birimleri hesaplamak.</li>
	<li>Steril hücre kültüründen başlayarak test % 7.5 sodyum bikarbonat sulu çözüm ([HCO3-] = 893 mM), 100 mM HCO3- çözüm su hazırlamak ve buz üzerinde sakin ol.</li>
	<li>Damla damla 1 birim uranyl asetat 100 mM hisse senedi çözüm buz gibi 100 mM HCO3- çözüm, hafifçe sallayarak karıştırma tüp 9 birimleri için ekleyin. Bu işlem uranyl asetat hisse senedi çözüm seyreltik ([UO22 +] = 100 mM, pH 4) 10 mm ve pH 7'ye getir.</li>
	<li>Buz gibi 100 mM HCO3- çözüm denetimi hazırlamak için hizmet edecek 90 mM HCO3- (HCO3- konsantrasyonu 10 mM uranyl çözümünde eşit), ulaşmak için 9 birimlerine steril su 1 birim ekleme Orta.</li>
	<li>Denge için (RT) oda sıcaklığında 3 h için durmak hazırlanan çözümleri sağlar.</li>
	<li>Bu arada, temel pozlama orta hazırlamak: 2 mM L-glutamin ve % 5 ile αMEM FBS. Not: farklılaşma ve rezorpsiyonu deneyleri için temel pozlama orta GST-RANKL 50 ng/mL ekleyin.</li>
	<li>3 saat sonra uygun miktarda 10 mM uranyl çözüm konsantrasyonları çalışma istenilen uranyl elde etmek için pozlama ortamda damla damla seyreltik. Aynı anda kontrol orta pozlama orta en yoğun uranyl tedavi durumda kullanılan bikarbonat miktarının ekleyerek hazırlayın.</li>
	<li>Denge için RT, 3 h için durmak hazırlanan medya izin.</li>
	<li>Kuyulardan büyüme ortamını çıkarın ve denetimi ve uranyl içeren medya ile değiştirin.</li>
</ol>4. analiz ham 264.7 öncüleri canlılık U(VI) (ÇMT sitotoksik deneyleri) huzurunda
Dikkat: Her iki MTT ve DMSO cilt neden ve tahriş göz. Eldiven ve göz koruma onları ele alırken giymek. Atık ürünler özel olarak atanan atık konteyner içinde toplamak.
<ol><li>Uygun bir miktar 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromür (MTT) toz içinde 5 mg/mL, 10 x hisse senedi çözüm elde etmek için PBS çözülür. 0,22 µm filtrenin filtrasyon tarafından sterilize ve aliquots-20 ° C'de depolayın</li>
	<li>24-şey plakaları (deneysel koşul plaka başına başına 3 Kuyu) plaka hücreleri. Spektrofotometre bulunmasını içeren sorulardan plaka başına 3 boş wells rezerve etmek unutmayın.</li>
	<li>22-24 h önce hücreleri eklemek bildirmek için uranyum pozlama için 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
	<li>Uranyl içeren medya madde 3 te açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
	<li>Uranyl ile içeren hücre numaralı seribaşı plakaları büyüme orta yerine medya. 24 saat kuluçkaya.</li>
	<li>1 x MTT çözüm gerekli hacmi aşağıdaki gibi hesaplar: (Deneysel koşullar + boşluk sayısı) x 3 (triplicates) x 0.4 mL/iyi + % 10 birim pipetting kayıplar için.</li>
	<li>1 x MTT çözüm gerekli hacmi 10 x hisse senedi MTT çözüm içinde kartal'ın en az gerekli orta (EMEM) fenol red olmadan sulandrarak hazırlayın. Not: başarılı bir Renkölçer tahlil için MTT ışıktan korunmalıdır. Bu arka plan sinyal sınırlamak için MTT EMEM içine DMEM ziyade sulandırmak için tavsiye edilir.</li>
	<li>Kuyulardan uranyl içeren medyayı çıkarın, PBS ile yıka ve 400 µL MTT çözüm (3 boş kuyular için boşluklar da dahil olmak üzere) her şey ekleyin. Karanlıkta 37 ° C'de 2,5 h kuluçkaya. Mikroskop altında koyu mor formazan kristalleri hücrelerin içinde oluşmuş doğrulayın.</li>
	<li>MTT çözüm atın ve dimetil sülfoksit iyi (DMSO) 220 µL ekleyin. Tabak gelen ışık onları korumak ve yavaşça formazan kristalleri çözülmeye 10 dakikadır kışkırtmak alüminyum folyo şal.</li>
	<li>Mikroplaka Spektrometre okuyucu 570, optik yoğunluk (OD) belirlemek için kullanın nm (formazan özel) ve 690 nm (arka plan). Her şey için olası belirsiz OD değer dalgalanma nedeniyle çizik veya bulanıklık22için ayarlamak için 570 nm OD dan 690 nm OD çıkarma.</li>
	<li>Her şey için boş düzeltilmiş OD önceki adımda elde OD dan boş demek OD çıkararak hesaplar. Demek OD değeri deneysel her koşul için belirleyin.</li>
	<li>Ayarla denetim durumu kötü OD ([UO22 +] = 0 mM) için % 100 canlılık ve hücre canlılığı diğer test uranyl konsantrasyonları için karşılık gelen yüzdesini hesaplamak. Bir doz-yanıt eğrisi çizmek. Sitotoksisite dizin 50 (CI50), uranyl konsantrasyonu % 50 hücre ölümüne 24 h maruz kaldıktan sonra lider olarak tanımlanan değerlendirin.</li>
</ol>5. analiz U(VI) huzurunda Osteoklast farklılaşma
<ol><li>
HAM 264.7 farklılaşma hücreleri uranyl ve tuzak varlığında (tartarat-dayanıklı asit fosfataz) boyama.
	<ol>
<li>Plaka ham 264.7 hücreleri deneysel koşul başına 3 Kuyu 24-şey tabakta. Yaklaşık 6 h, 37 ° C'de kuluçkaya hazırlamak ve uranyl içeren pozlama medya equilibrate vakti.</li>
		<li>Farklılaşma medya bölümünde 3 (GST-RANKL ortamına Ekle unutmayın) açıklandığı gibi istenen uranyl konsantrasyonları ile hazırlayın.</li>
		<li>Yavaşça uranyl içeren ile Wells temel orta yerine orta. Bu gün mediatörlerin farklılaşma günü 0 olarak kabul edilir.</li>
		<li>Orta günde 2 veya 3 mediatörlerin farklılaşma 5.1.2 ve 5.1.3 adımları yineleyerek değiştirin. Multinucleated Osteoklastlar 3 ve 4 gün arasında görünmelidir.</li>
		<li>TUZAK üreticinin yönergeleri izleyerek ticari olarak mevcut lökosit asit fosfataz kiti ile boyama gerçekleştirmek. Not: tartarat-asit fosfataz 5, tartarat dayanıklı (ACP5) olarak da adlandırılan dayanıklı asit fosfataz (tuzak) son derece olgun Osteoklastlar dile getirdi ve yoğun Osteoklast farklılaşma avans olarak kullanılan. Bu nedenle, tuzak boyama Osteoklastlar görselleştirmek için gerçekleştirilir. Deneysel koşullar ve osteoclastogenesis hızına bağlı olarak, 4 gün veya gün 5 farklılaşma süreci üzerinde yapılabilir.</li>
		<li>TUZAK lekeli wells (onlar 3 veya 4 hafta kadar bu koşullarda muhafaza edilebilir) daha fazla çözümleme için 4 ° C'de PBS içinde tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osteoklast boyutu/Morfoloji analizi.
	<ol>
<li>Her şey bütün yüzeyi görüntüsünü elde etmek. Resmin çözünürlüğünü hücre çekirdeği ayırt etmek için yeterli olmalıdır. TUZAK-pozitif hücreler ile 3 veya daha fazla hücre çekirdeği, Osteoklastlar düşünün.</li>
		<li>ImageJ yazılımında bir şey görüntüsünü açın: "Dosya" → "Aç".</li>
		<li>Görüntünün sol üst köşesinde ölçek birimlerini doğrulayın. Göreli miktar için herhangi bir birimi kullanılabilir. Osteoklast boyutu mutlak değerini gerekli ise, µm için ölçek birimlerini dönüştürün: "Resim" → "özellikleri". Daha sonra tüm resimlere uygulanan yeni ölçek birimler için açılan pencerede "küresel" kutuyu işaretleyin. Not: mikroskop resim alma için kullanıldıysa, düşsel bilgisayar yazılımı her amaç için µm piksel boyutunda gösterilir.</li>
		<li>Çözümlenmesi için ölçüm parametreleri belirtin: "→"ölçümleri ayarla"analiz". Ölçümler ayarla penceresinde "Alan" ve "Etiketi göster" kutuları işaretleyin ve diğerleri uncheck kutuları.</li>
		<li>Yatırım Getirisi (faiz bölgesi) Yöneticisi'ni açın: "→"Araçlar"analiz" → "ROI Yöneticisi".</li>
		<li>Ana penceresinde, dikdörtgen seçim aracını seçin. Yaklaşık 1000 x 1000 µm bir sektör anahat için görüntünün içinde her yerde kullanın. Bu seçim şimdi hangi Osteoklast boyutu analiz edilecek ilk bölge tanımlar.</li>
		<li>ROI Yöneticisi penceresinde, yörenin ilgi ROI Yöneticisi'ne ekleyin ve "Daha fazla" → "Kaydet" tıklayarak kaydetmek için "Ekle" düğmesini tıklayın. Kaydedilmiş ROI şimdi ROI Yöneticisi her zaman "Daha fazla" → "Aç" ı tıklatarak yeniden yüklenebilir.</li>
		<li>Aygıtlarından 5.2.5 - Osteoklast boyut analizi için 4 ek bölge tanımlamak için 5.2.6 (şekil 2A ve 2D). Not: Tüm görüntüleri boyutlarda Osteoklast çözümlemek için tanımlanmış bölgeleri kullanılacaktır.</li>
		<li>Analiz edilecek 5 bölgelerinden biri bir kopyasını oluşturun: Bu ROI (karşılık gelen seçimi ana görüntü görünür) ROI Yöneticisi ana açmadı → seçimi → "Yinelenen" içinde sağ tıklatın. Bu yinelenen daha ayrıntılı bir çözümleme için kullanın.</li>
		<li>ROI Yöneticisi penceresinde kutuları "Göstermek Al" l ve "Etiketler" kontrol.</li>
		<li>Ana pencerede bir seçimdeki Osteoklastlar anahatlarını el ile belirlemeniz çokgen seçim aracını seçin. Bu anahat ROI Yöneticisi için "Ekle" ROI Yöneticisi penceresinde tıklatarak ekleyin. Benzer şekilde tamamen seçilen bölge içinde yalan tüm Osteoklastlar için devam (şekil 2B ve 2E).</li>
		<li>ROI Yöneticisi penceresinde tüm anahatlar seçin ve "Ölçü" tıklayarak onların yüzey ölçmek. Yeni bir pencere (sonuçları penceresi, şekil 2C ve 2F) göründüğü ölçümleri bir e-tabloya aktarmak. Not: Bu noktada, analiz Osteoklastlar anahatları ile bölge bağımsız bir resim olarak kaydedilmiş olabilir: "Dosya" → "Farklı Kaydet" tercih biçimi.</li>
		<li>5.2.8 - 5.2.12'den analiz geçerli görüntünün kalan bölgeler için yineleyin. Sonra tüm diğer resimler için tüm prosedürü tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osteoklast numara analizi ImageJ yazılımı ile. Not: Osteoklast dağıtım iyi nadiren homojen olduğu gibi bütün iyi yerine birkaç seçilen bölgeler üzerinde sayım gerçekleştirin. Osteoklastlar formu ve boyut, hücre yöntemi sayma Hayır otomatik olarak heterojen verilen uygulanabilir 's.<ol>
<li>Bütün iyi görüntü ImageJ yazılım (çözümlenmek kullanım imge--dan önceki alt bölümde) açın.</li>
		<li>Hücre sayaç penceresini açın: "Eklentiler" → "analiz" → "Hücre Counter". Tıklayın "Başlat" ve "tip 1" onay kutusunu (ya da her türlü sen tercih etmek sayı yazın). "Numarasını göster" onay kutusunun seçili olduğundan ve "Silme modu" kutusunun işaretli olmadığından emin olun.</li>
		<li>Resmin üzerine tıklayın bir Osteoklast: tıklandığında nerede renkli nokta ve bir sayı görünür. Benzer şekilde tüm Osteoklastlar için devam edin. Veri işaretleyicilerini düzenli olarak yanında tıkırtı üstünde "Kaydetmek işaretleri" hücre sayaç penceresinde Kaydet Not: son nokta sayımdan kaldırılacak ise, "Delete" hücre sayaç penceresinde tıklatın. Kaldırmak için birden fazla nokta ise, "Silme modu" kutuyu işaretleyin ve tüm geçersiz yanında tıkırtı üstünde onları gösteriyor. O zaman sayımı devam etmek için "Silme modu" kutunun işaretini kaldırın.</li>
		<li>Hücre sayaç penceresinde sonuçları tıklayarak sayım sonucu görüntüler. Son sayım sonuçları elektronik tabloya aktarmak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Osteoklast işlevi U(VI) huzurunda analizi
<ol><li>
Çukur rezorpsiyonu tahlil.
	<ol>
<li>Plaka ham 264.7 hücreleri Osteoklastlar tarafından resorbed bir sentetik inorganik osteomimetic yüzey sağlar bir 24-şey osteo tahlil plaka üzerinde. Not: hücreleri biomimetic yüzeye eklemek amacıyla, bu kez onları farklılaşma orta eklemeden önce gün plaka daha iyi olur.</li>
		<li>HAM 246.7 hücre Osteoklastlar 5 (Adım 5.1.2 - 5.1.4) bölümünde açıklandığı gibi ayırt etmek</li>
		<li>Günü osteoclastogenesis 5, % 10 çamaşır suyu Çözümle uranyl içeren orta değiştirerek kemik mimetic yüzeyden Osteoklastlar kaldırın. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Wells iki kez deiyonize su ile yıkayın ve onlara kuruması.</li>
		<li>Bir % 1 Alizarin Red S sodyum tuz solüsyonu kalsiyum tuzları resorbed olmayan alanlarda leke wells ekleyin. Sonra 10-15 s, kuluçka alizarin çözümü kaldırmak ve yavaşça wells 3 - 4 kez su ile yıkayın. Kuyuları kurumasına izin verin. Not: yukarıda açıklanan boyama yordamı ardışık analiz kolaylaştırmak için resorbed ve resorbed olmayan alanları arasındaki kontrastı artırmak için tasarlanmıştır. Boyama önce kuyu tamamen kuru değilseniz, kalan kemik mimetic yüzey bölümlerini yanlışlıkla kaldırılmış olabilir çünkü bu yordamı dikkatle yapılmalıdır. Alizarin çözüm wells çok uzun süre bırakılırsa, Ayrıca, non-spesifik kalıcı bir boyama-ecek gözükmek. Bu bölümde anlatılan test uranyum etkisi mediatörlerin farklılaşma ve fonksiyonu ilişkili olduğu unutulmamalıdır. Uranyum etkisi rezorpsiyonu Osteoklast oluşumu bağımsız olarak çalışmaya, ham 264.7 hücreleri ile uranyl içeren tedavi edilebilir orta boy olgun Osteoklastlar (gününde 4 ya da 5 farklılaşma süreci) sadece oluşmuş bir kez 24 saat 23.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Çukur rezorpsiyonu analizi.
	<ol>
<li>Her şey osteo tahlil plaka tüm yüzeyi görüntüsünü elde etmek. Not: Görüntü edinme yöntemleri değişebilir ancak Çoğalt deneyler tutarlı olmalıdır. Onlar sabit bir kamera, yüksek çözünürlüklü bir tarama veya bir otomatik yüksek işlem hacmi mikroskobu ile yapılan bir mozaik görüntü makro amacı ile çekilen bir resim içerebilir.</li>
		<li>5.2.2-5.2.4'ten önceki bölümdeki adımları yineleyerek çözümlemesi'ni başlatmak.</li>
		<li>RGB görüntüyü gri tonlama 8 bit biçimine dönüştürme: "Resim" → "Yazın" → "8 bit".</li>
		<li>Ana penceresinde, oval seçim aracını seçin. Rezorpsiyonu için analiz edilecek şey tüm yüzeyini özetleyen bir daire çizmek için kullanın.</li>
		<li>Bu yeni yatırım Getirisi olduğu gibi adım 5.2.6 kaydedin.</li>
		<li>Eşik seçimi kolaylaştırmak için tüm özellikleri dışında tanımlanmış ROI temizleyin: "Düzenle" → "Dış açık". Not: Bu noktada, bu kez bir kaç resim kopyalarının yapmak daha iyi olur: ROI seçilen bölge → sağ tıklayın görüntü → "Yinelenen" dışında tıklatarak seçimini kaldırın. Bu eylem bir sonraki adımda seçilen eşik tatmin edici ise yukarıda açıklanan resim tedavi tekrarı önlemek yardımcı olur.</li>
		<li>"Resim" → "Ayarlama" → "eşik" seçin. Eşik penceresinde, uygun bir eşik seçmek için kaydırma çubuğunu kullanın. Tüm resorbed alanları (beyaz) eşiğin altına olmalıdır ve sigara-, (kırmızı) resorbed. Eşik seçimi sonuçlandırmak için "Uygula" eşik penceresinde tıklatın.</li>
		<li>Son ikili görüntü kaydetmek: "Dosya" → "Farklı Kaydet" → biçimini seçtiğiniz.</li>
		<li>Faiz bölgede alınacak ölçüler tanımlayın: "→"ölçümleri ayarla"analiz". Ölçümleri ayarla penceresinde "Alanı", "Alan kesir" ve "Eşik sınırı" kutuları kontrol edin ve diğerleri işaretini kaldırın.</li>
		<li>"Resorbed" alan sonuçları penceresinde doğrudan kısmını elde etmek için ("→"Ters"Edit") ikili görüntü tersine çevirin. Ana yatırım Getirisi üzerinde son ikili resim seçili olduğundan emin olun (aksi takdirde resorbed alan kesir hesaplanabilir dayalı tüm görüntü penceresinin yüzeyinde). Ölçü resorbed alan kesir yanında ikisinden biri "Ölçü" ROI Yöneticisi penceresinde tıkırtı üstünde ya da "→"Tedbir"analiz". Sonucu kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. Toxicological profile for uranium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKeith%2C+S+%22Agency+for+Toxic+Substances+and+Disease+Registry%22">Agency for Toxic Substances and Disease Registry</a>. , Atlanta, GA. (2013).</li>
<li>Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deposition+and+early+disposition+of+inhaled+233UO2%28NO3%292+and+232UO2%28NO3%292+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Phys%22%5BJournal%5D)">Deposition and early disposition of inhaled 233UO2(NO3)2 and 232UO2(NO3)2 in the rat.</a> Health Phys. 51 (6), 755-771 (1986).</li>
<li>Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uranium+in+the+tissues+of+an+occupationally+exposed+individual%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Phys%22%5BJournal%5D)">Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual.</a> Health Phys. 57 (1), 17-21 (1989).</li>
<li>Kurttio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+effects+of+uranium+in+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Renal effects of uranium in drinking water.</a> Environ.Health Perspect. 110 (4), 337-342 (2002).</li>
<li>Leggett, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basis+for+the+ICRP%27s+age-specific+biokinetic+model+for+uranium%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Phys%22%5BJournal%5D)">Basis for the ICRP's age-specific biokinetic model for uranium.</a> Health Phys. 67 (6), 589-610 (1994).</li>
<li>Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+as+target+organ+for+metals%3A+the+case+of+f-elements%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Bone as target organ for metals: the case of f-elements.</a> Chem. Res. Toxicol. 25 (6), 1161-1175 (2012).</li>
<li>Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modes+of+action+associated+with+uranium+induced+adverse+effects+in+bone+function+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development.</a> Toxicol. Lett. 236 (2), 123-130 (2015).</li>
<li>Ikeda, K., Takeshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+osteoclast+differentiation+and+function+in+skeletal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis.</a> J. Biochem. 159 (1), 1-8 (2016).</li>
<li>Teiltelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteoclast+and+its+unique+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The osteoclast and its unique cytoskeleton.</a> Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).</li>
<li>Nesbitt, S. A., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+matrix+collagens+through+bone-resorbing+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts.</a> Science. 276 (5310), 266-269 (1997).</li>
<li>Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+osteoclast+bone+resorption+products+by+transcytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis.</a> Science. 276 (5310), 270-273 (1997).</li>
<li>Pierrefite-Carle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+natural+uranium+on+the+UMR-106+osteoblastic+cell+line%3A+impairment+of+the+autophagic+process+as+an+underlying+mechanism+of+uranium+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity.</a> Arch. Toxicol. 91 (4), 1903-1914 (2017).</li>
<li>Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uranium+inhibits+bone+formation+in+physiologic+alveolar+bone+modeling+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Res%22%5BJournal%5D)">Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling.</a> Environ. Res. 54 (1), 17-23 (1991).</li>
<li>Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ethane-1-+hydroxy-1%2C1-bisphosphonate+%28EHBP%29+on+endochondral+ossification+lesions+induced+by+a+lethal+oral+dose+of+uranyl+nitrate%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate.</a> Arch. Toxicol. 79 (8), 475-481 (2005).</li>
<li>Kurttio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+as+a+possible+target+of+chemical+toxicity+of+natural+uranium+in+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water.</a> Environ. Health Perspect. 113 (1), 68-72 (2005).</li>
<li>Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANKL-mediated+osteoclast+formation+from+murine+RAW+264.7+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells.</a> Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).</li>
<li>Beranger, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+poly%28ADP-Ribose%29+polymerase-1+and+JunD%2FFra2+accounts+for+RANKL-induced+Tcirg1+gene+expression+during+osteoclastogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis.</a> J. Bone Miner. Res. 22 (7), 975-983 (2007).</li>
<li>Mirto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+uranium%28VI%29+speciation+for+the+evaluation+of+in+vitro+uranium+cytotoxicity+on+LLC-PK1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Exp.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells.</a> Hum. Exp. Toxicol. 18 (3), 180-187 (1999).</li>
<li>Carrière, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+uranium+speciation+on+normal+rat+kidney+%28NRK-52E%29+proximal+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity.</a> Chem. Res. Toxicol. 17 (3), 446-452 (2004).</li>
<li>Milgram, S., Carrière, M., Malaval, L., Gouget, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+accumulation+and+distribution+of+uranium+and+lead+in+osteoblastic+cells+as+a+function+of+their+speciation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation.</a> Toxicology. 252 (1-3), 26-32 (2008).</li>
<li>Milgram, S., Carrière, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+and+phenotypic+effects+of+uranium+and+lead+on+osteoblastic+cells+are+highly+dependent+on+metal+speciation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation.</a> Toxicology. 250 (1), 62-69 (2008).</li>
<li>Studzinski, G. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStudzinski%2C+GP+%22Cell+Growth%2C+Differentiation+and+Senescence+A+Practical+Approach%22">Cell Growth, Differentiation and Senescence A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. Oxford. (1999).</li>
<li>Gritsaenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+uranium+impairs+the+differentiation+and+the+resorbing+function+of+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Natural uranium impairs the differentiation and the resorbing function of osteoclasts.</a> Biochim Biophys Acta. 1861 (4), 715-726 (2017).</li>
<li>Motiur Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation-coupled+osteoclast+differentiation+by+RANKL%3A+Cell+density+as+a+determinant+of+osteoclast+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation.</a> Bone. 81, 392-399 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa yoktur

Bildiğimiz gibi doğal uranyum etkisi kemik hücreleri resorbing çalışmaya yönelik ayrıntılı yönerge açıklanan ilk kez bu. Bu yaklaşım uranyum etkisi kemik fizyolojisi üzerinde daha iyi bir anlayış elde etmek için yararlı olacağını ve uranyum şelatörlerin tarama için ilginç bir yeni bir araç sağlayabilir. Ayrıca, burada açıklanan protokol diğer ağır metaller osteoclatogenesis üzerinde etkisini incelemek için uygulanan olabilir inanıyoruz.
O uranyl complexed kültür medya18...

Uranyum doğal olarak meydana gelen radyoaktif element toprak, hava ve su mevcut olduğunu; Bu nedenle, insan ve hayvanlar doğal uranyum besinlerinde maruz kalır. Doğal kaynaklara ek olarak, uranyum antropojenik aktiviteler hangi ortamda onun bereket artar kaynaklanır. Uranyum kimyasal ve radyolojik tehlike teşkil etmektedir. (Bu bir izotopik karışımı içeren %99.27 238U, %0,72 235U ve %0,006 234U) doğal uranyum düşük özel etkinlik (25.103 Bq.g-1) olduğundan, ancak, sağlık üzerinde etkileri atfedilir onun kimyasal toksisitesi.
Ne olursa olsun onun giriş rota (inhalasyon, yenmesi veya dermal pozlama), çoğu uranyum, vücut girerek dışkı ile atılır ve yalnızca küçük bir bölümü sistemik dolaşım ulaşır. Uranyum kan yaklaşık % 67 sırayla böbrekler tarafından süzülür ve vücut idrar 24 h1içinde bırakır. Geri kalan, çoğunlukla böbrek ve kemikler, iki ana hedef organlar uranyum toksisite2,3,4yatırılır. İskelet uranyum uzun süreli saklama2,3,4,5,6birincil site belirlenmiştir çünkü çeşitli çalışmalar keşfetmek için yapılmıştır kemik Fizyoloji7uranyum etkisi.
Ömrü sürekli remodeled mineralized doku kemiktir. Kemik remodeling özel hücre tipleri üzerinde bağlıdır ve çoğunlukla iki aşamadan oluşmaktadır karmaşık bir süreç olduğunu: rezorpsiyonu önceden varolan eski Matrix Osteoklastlar tarafından takip de novo kemik İnşaat tarafından dokusunu tarafından. Osteoklastlar nerede onlar8kemik eklemek rezorpsiyonu sitelere göç öncül hücreleri hematopoetik kökenli füzyonu kaynaklanan büyük multinuclear hücrelerdir. Kendi eki aynı anda onların sitoiskeleti9kapsamlı bir yeniden yapılanma ile oluşur. Bu yeniden yapılanma içine Osteoklast salgılar proton, hidroksiapatit ve proteaz bozulması dahil dağılmasına yol açan kemik yüzeyi arasındaki hücre izole bir bölme kurulması için gereklidir Organik matris. Ortaya çıkan bozulma ürünleri endocytosed, membran alanı kemik yüzeyine ters hücreye aracılığıyla taşınan ve salgılanan, transcytosis10,11adı verilen bir işlem.
Vivo ve in vitro çalışmalar sonuçları uranyum kemik oluşumunu engeller ve numarayı ve etkinlik dokusunu7,12değiştirir gösterir. Buna ek olarak, kemik rezorpsiyonu ve Osteoklastlar uranyum etkileri kötü araştırılmalıdır. Çeşitli in vivo çalışmalarda kemik rezorpsiyonu bir donanım, fare ya da sıçan13,14uranyl nitrat yönetimi sonra bildirdin. Ayrıca, bir epidemiyolojik araştırma uranyum alımı içme suyu ile artış erkekler15kemik rezorpsiyonu işaretleyicisinde serum düzeyinde bir artış ile ilişkili olma eğilimi önerdi. Birlikte ele alındığında, bu bulgular kemik içinde biriken uranyum kemik rezorpsiyonu teşvik verebilecek sonuca yol açtı. Ancak, hücresel mekanizmaları uranyum bu potansiyel etkisi içinde yer alan bir açık soru kalır. Bu nedenle, uranyum kemik hücreleri resorbing davranışı üzerinde etkisini incelemeye karar verdik.
Burada, biz biz kurduk Protokolü tarif karakterize ve doğal uranyum etkileri öncesi Osteoklastlar canlılığı, Osteoklastlar farklılaşma ve resorptive etkinliği ölçmek için. Hangi kolayca ne zaman 4 veya 5 gün boyunca sitokin RANKL huzurunda kültürlü Osteoklastlar içine ayırt edebilir ve hangi klasik incelemek için kullanılır ham 264.7 fare dönüştürülmüş makrofaj hücre satırıyla, burada açıklanan deneyler yapmış Osteoklast16farklılaşma ve işlev. Geliştirilen yordamlar güvenilir, vermek son derece tekrarlanabilir sonuçlar ve are için birincil Osteoklastlar tam olarak uygulanabilir. Tüm bu nedenlerden dolayı bu metodoloji moleküler mekanizmaları kemik uranyum toksisite dahil daha iyi anlaşılmasını almak için yararlı olduğunu düşünüyoruz. Ayrıca, bu yaklaşım yeni uranyum şelat ajanlar tanımlamak için bir tarama aracı olarak adapte olabileceğini düşünüyorum.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>Fenol kırmızısı içermeyen EMEM</td><td>Lonza</td><td>12-668E</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü için su</td><td>Lonza</td><td>BE17-724F</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; L-Glutamin çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi Çözeltisi% 0.4</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>HyClone fetal sığır serumu</td><td>GE Yaşam Bilimleri</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>% 7.5 sodyum bikarbonat sulu çözelti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>Asit Fosfataz, Lekosit (TRAP) kiti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Tiazolil Mavi Tetrazolyum Bromür (MTT) tozu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5655</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin Kırmızı S sodyum tuzu, %1 w/v aq. sol.</td><td>Alfa Aeros</td><td>42746</td><td></td></tr><tr><td>Osteoassay kemik rezorpsiyon plakaları, 24 kuyulu plakalar</td><td>Corning Yaşam Bilimleri</td><td>3987</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 24 kuyulu plakalar</td><td>Falcon</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Şişesi 75 cm2</td><td>Falcon</td><td>353133</td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen Konik Tüpler 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Hücre sıyırıcılar 30 cm</td><td>TPP</td><td>90003</td><td></td></tr></tbody></table>

vitro osteoclastogenesis üzerinde doğal uranyum etkileri analiz yöntemleri

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Uranyum kemik fizyolojisi ile müdahale için gösterilmiştir ve de bu metal kemik içinde birikir kuruldu. Ancak, az kemik hücreleri davranışını doğal uranyum etkisi hakkında bilinir. Özellikle, uranyum Osteoklastlar, kemik matrisi rezorpsiyonu için sorumlu hücreler üzerinde etkisini belgelenmemiştir. Bu sorunu araştırmaya, uranyl asetat bir kaynak doğal uranyum ve fare ham 264.7 hücre satırı Osteoklast öncüleri bir model olarak kullanarak yeni bir protokol kurduk. Burada, uranyum sitotoksisite Osteoklast öncüleri üzerinde test etmek ve etkisini osteoclastogenesis ve olgun Osteoklastlar resorbing işlevini değerlendirmek için gerekli bütün testleri ayrıntılı. Koşullar biz geliştirdik, özellikle uranyl içeren kültür medya hazırlanması ve ham 264.7 tohum hücreleri güvenilir ve yüksek üreme sonuçları elde etmek için izin vermek. Ayrıca, Osteoklastlar boyutunu veya resorbed matris yüzdesi gibi çeşitli parametrelerin analiz kolaylaştırmak için yazılım araçları kullanımı optimize.

Tartarat dayanıklı asit fosfataz boyama Osteoklastlar 3 veya daha fazla hücre çekirdeği olan büyük mor hücreler olarak görselleştirmek için kullanıldı. Osteoklastlar temsilcisi görüntülerini RANKL huzurunda kültürlü ham 264.7 hücrelerden elde edilen ve uranyl iyonları şekil 1' de gösterilmiştir. Osteoklastlar uranyum yanıt boyutunu ve sayısını değişiklikleri bütün Wells bileşik görüntüler ve büyütülmüş resimler kolayca görülebilir.
<p class="jove_content"...

Uranyum kemik metabolizması etkilediği bilinmektedir. Burada, doğal uranyum pozlama etkisini canlılığı, farklılaşma ve Osteoklastlar, kemik rezorpsiyonu sorumlu hücrelerin fonksiyonlarını araştıran amaçlı bir iletişim kuralı mevcut.

Vitro Osteoclastogenesis üzerinde doğal uranyum etkileri analiz yöntemleri

Uranium has been shown to interfere with bone physiology and it is well established that this metal accumulates in bone. However, little is known about ...

Bu prosedürün genel amacı, doğal uranyum maruziyetinin osteoklast canlılığı, farklılaşması ve işlevi üzerindeki etkilerini araştırmaktır. Bu yöntem, uranyum maruziyetinin kemik fizyolojisi ve metabolizması üzerindeki etkisi hakkında çevresel toksisite alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, uranyum yaratıcılarının taranması için ilginç yeni bir araç sağlamasıdır.RAW 264.7 hücre kültürü %85 ila %90 birleşmeye ulaştığında, hücreleri hücre kültürü şişesinin altından mekanik olarak kaldırmak ve hücreleri steril 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Topakları parçalamak ve elde edilen tek hücreli süspansiyonu saymak için hücre çözeltisini birkaç kez pipetleyin. Hücreleri, L-glutamin ve% 5 fetal sığır serumu ile desteklenmiş alfa modifiyeli Minimum Esansiyel Ortamda mililitre başına 10 ila dördüncü hücre konsantrasyonuna seyreltin ve 37 santigrat derecede altı saatlik bir inkübasyon için 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasına oyuk başına bir mililitre hücre ekleyin.Osteoklast farklılaşması ve yeniden absorpsiyon testinin tekrarlanabilirliği için önemli bir parametre hücre tohumlama yoğunluğudur. Hücreleri kaplamadan önce hücre sayımına, hücresel süspansiyon hazırlığına ve homojenliğine özellikle dikkat edin. Pisuar tuzu çözeltisini hazırlamak için, steril hücre kültürü ile test edilmiş% 7.5 sodyum bikarbonat sulu çözeltisinden başlayarak, önce 100 milimolar bikarbonatı buz üzerinde su içinde hazırlayın ve soğutun ve bir hacim 100 milimolar pisuar asetat çözeltisi ekleyin, damla damla, hafifçe çalkalayarak dokuz hacim buz gibi bikarbonat çözeltisine damla damla.Çözeltinin oda sıcaklığında dengelenmesine izin verin. Üç saat sonra, istenen pisuar çalışma konsantrasyonu elde edilene kadar mililitre başına 50 nanogram RANKL içeren farklılaşma ortamına uygun pisuar solüsyonu hacmini damla damla seyreltin ve oda sıcaklığında üç saatlik bir dengelemeye izin verin. Pisuar tuzunun her seyreltilmesinden sonraki uzun inkübasyon adımları, çözeltilerdeki pisuar komplekslerinin stabilizasyonu için gereklidir.İkinci dengeleme süresinin sonunda, her bir oyuktaki ortamı uygun şekilde bir mililitre pisuar ile muamele edilmiş veya kontrol ortamı ile nazikçe değiştirin ve hücreleri inkübatöre geri koyun. Çok çekirdekli osteoklastlar, kültürün üçüncü ve dördüncü günleri arasında ortaya çıkmalıdır. Yeni farklılaşmış osteoklastların boyutunu ve morfolojisini değerlendirmek için, hücreleri üreticinin talimatlarına göre tartarat dirençli asit fosfataz ile boyayın ve her bir oyuğun tüm yüzeyini hücre çekirdeklerini ayırt etmek için yeterli bir çözünürlükte görüntüleyin.Tüm kuyuların görüntüsü alındığında, açık kaynaklı ImageJ yazılımıyla bir kuyunun görüntüsünü açın ve ölçek birimlerini doğrulayın. Ardından, yeni ölçek birimlerini sonraki tüm görüntülere uygulamak için açılır penceredeki Global kutusunu işaretleyin. Analiz menüsünde Ölçümleri Ayarla'yı seçin ve Alan ve Ekran etiketi kutularını işaretleyin.Diğer tüm kutuların işaretini kaldırın. Analiz menüsü altında, Araçlar'ı ve ardından İlgi Bölgesi Yöneticisi'ni açın ve ana ImageJ penceresinde dikdörtgen seçim aracını seçin. Yaklaşık 1.000 x 1.000 mikrometre boyutlarında bir ilgi alanı belirleyin ve seçimi İlgi Bölgesi Yöneticisi'ne eklemek için Ekle düğmesine tıklayın.Ardından bölgeyi kaydetmek için Diğer, Kaydet'i tıklayın. Analiz edilecek beş bölgeden birinin kopyasını oluşturmak için, İlgilenilen Bölge Yöneticisi'nde ilgilenilen bölgeyi seçin ve bölgeyi çoğaltmak için seçili alanın içine sağ tıklayın. Tümünü Göster ve Etiketler kutularını işaretleyin ve çoğaltılan ilgili bölgedeki osteoklastlardan birini manuel olarak özetlemek için çokgen seçim aracını seçin.Bu anahattı İlgi Alanı Yöneticisi'ne eklemek için, İlgi Alanı Yöneticisi penceresinde Ekle'ye tıklayın. Tüm osteoklastlar eklendiğinde, tüm ana hatları seçin ve yüzeylerini ölçmek için Ölç'e tıklayın. Ardından, sonuçlar penceresinde görünen ölçümleri bir hesap tablosuna aktarın.Pisuar ile tedavi edilen osteoklastların işlevini değerlendirmek için, farklılaşma ortamını eklemeden bir gün önce, RAW hücrelerini% 85 ila% 90'lık bir birleşik hücre kültüründen, az önce gösterildiği gibi, büyüme ortamındaki 24 oyuklu bir osteo tahlil plakasına plakalayın. Ertesi gün, süpernatanı nazikçe farklılaşma pisuarı içeren ortamla değiştirin ve RAW hücrelerinin az önce gösterildiği gibi osteoklastlara farklılaşmasına izin verin. Osteoklastogenezin beşinci gününde, hücreleri kemik mimetik yüzeyinden çıkarmak için pisuar içeren ortamı% 10 ağartıcı solüsyonla değiştirin.Oda sıcaklığında beş dakika sonra, kuyuları iki kez deiyonize su ile yıkayın ve kurumaya bırakın. Daha sonra, her bir oyuğun emilmemiş bölgelerindeki kalsiyum tuzlarını% 1 Alizarin Red S sodyum tuzu çözeltisi ile boyayın. 10 ila 15 saniye sonra, Alizarin çözeltisini çıkarın ve kuyucukları üç ila dört kez suyla nazikçe yıkayın.Alizarin lekeli kuyucukların RGB görüntüsünü gri tonlamalı, 8 bit formatına dönüştürmek için, Görüntü menüsünde Tür ve 8 bit'i seçin. Ardından, oval seçim aracını kullanarak, emilim için analiz edilecek kuyunun tüm yüzeyinin ana hatlarını çizin ve az önce gösterildiği gibi ilgilenilen bölgeyi kaydedin. Eşik seçimini kolaylaştırmak için, tanımlanan ilgi alanının dışındaki tüm özellikleri temizlemek için Düzenle ve Dışını Temizle'yi seçin.İlgilendiğiniz bölgeyi az önce gösterildiği gibi çoğaltın ve uygun bir eşik seçmek için kaydırma çubuğunu ayarlayarak Görüntü menüsü altında Eşiği Ayarla'yı seçin. Emilen alanların tümü eşiğin üzerinde olmalı ve beyaz görünmeli, emilmeyen alanların tümü ise eşiğin altında olmalı ve kırmızı görünmelidir. Eşik seçimini sonlandırmak için, Eşik penceresinde Uygula'yı tıklatın ve son ikili görüntüyü ilgilendiğiniz uygun biçimde kaydedin.İlgilenilen bölge içinde alınacak ölçümleri tanımlamak için, Analiz menüsü altında, Ölçümleri Ayarla'yı seçin ve Alan, Alan Fraksiyonu ve Eşik Sınırla kutularını işaretleyin ve diğer tüm kutuların işaretini kaldırın. Ardından, emilen alanın fraksiyonunu doğrudan sonuçlar penceresinde elde etmek için, Düzenle menüsü altında Ters Çevir'i seçerek çoğaltılan ikili görüntüyü ters çevirin ve son ikili görüntüde ilgilenilen ana bölgenin seçili olmasına dikkat edin ve emilen alan fraksiyonunu ölçün. Uranyuma yanıt olarak yeni farklılaşmış osteoklastların sayısı ve boyutundaki değişiklikler, tüm kuyucukların kompozit görüntülerinde ve ayrıca belirli ilgi bölgelerinin büyütülmüş resimlerinde kolayca görülebilir.Farklı kültür koşulları altında yetiştirilen osteoklastların boyutu, her bir bölgedeki tüm osteoklastların ana hatlarını çizerek ve ana hatları çizilen her bir hücrenin alanını ölçerek gösterildiği gibi analiz edilebilir. Uranyumun osteoklast rezorpsiyon aktivitesi üzerindeki etkisini araştırmak için, RAW 264.7 hücreleri osteo mimetik yüzey plakaları üzerinde kaplanır ve farklılaştırılır. Testin sonunda, osteoklastlar çıkarılır ve emilmeyen alanlar boyanır ve gösterildiği gibi görüntülenir.Görüntüler daha sonra 8 bit gri tonlamaya dönüştürülür ve emilen alanların hesaplanmasını kolaylaştırmak için eşiklenir. Bu prosedür aynı zamanda diğer ağır metallerin osteoklastogenez üzerindeki etkisinin incelenmesine de uygulanabilir.

methods-for-analyzing-impacts-natural-uranium-on-vitro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu videoda, farklı anti-c-fms antikor konsantrasyonlarının, osteoklast progenitörlerinden osteoklast oluşum süreci olan osteoklastogenez üzerindeki etkisini gösteriyoruz.

Anti C-fms Antikorunun Fare Kemik İliği Hücrelerinde Osteoklastogenez Üzerine Etkisi İn Vitro

Osteoklastlar vücutta ana kemik-rezorbe hücresi vardır. Çok sayıda osteoklastlar izole etmek için bir yeteneği osteoklast biyoloji anlama konusunda önemli ilerlemelere yol açmıştır. Bu protokol, yetiştirilmesi ve in vitro olarak osteoklast aktivitesi miktarının, izole edilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır.

Fare Kemik İliği osteoklast türetilmesi

Üretim kanama suyu (PBW), bakır oksit nanopartikülleri (CuO-NP'ler) ile muamele edildi ve kültürlenmiş insan hücrelerinde hücresel toksisite değerlendirildi. Bu protokolün amacı, doğal çevresel numuneyi, CuO-NP işlemine bağlı toksisitedeki değişiklikleri değerlendiren bir hücre kültürü formatına entegre etmekti.

Uranyum dan Bakır Oksit Nanopartiküller tarafından İz Elementlerin çıkarılması<em&gt; In Situ</em&gt; Kurtarma Bleed Su ve Hücre Canlılığı Üzerine Etkisi

Biz iki kemiğin insan hücre hatları ile yayımlanan veziküller mineraller durumunu karşılaştırmak için bir iletişim kuralı mevcut: hFOB 1.19 ve SAO'lar-2. Qafqaz profillerini Alizarin Red-boyama, ultraviyole (UV) ışık görselleştirme, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüleme ve enerji dağıtıcı x-ışını microanalysis (EDX) tarafından S (AR-S) analiz edildi.

Mineraller hFOB 1.19 tarafından üretilen ve SAO'lar-2 hücreleri kullanarak transmisyon elektron mikroskobu ile enerji dağıtıcı x-ışını Microanalysis Analizi

Osteokuzlar, hematopoetik kök hücrelerin monosit-makrophaj soylarından elde edilen dokuya özgü makrophaj polykaryonlarındadır. Bu protokol, kemik iliği hücrelerinin nasıl yalıtılmasını açıklar, böylece geleneksel yöntemlerde bulunan kazaların riskini azaltarak büyük miktarlarda osteocsürer elde edilir.

Sıçan kemik Iliği Osteoclast precursors yalıtım, arıtma ve farklılaşma

Bu iletişim kuralı fare uzun kemik ve kemik iliği makrofajlar oluşturup Osteoklastlar makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve reseptör aktivatör nükleer faktör Kappa B ligand (RANKL) kullanarak üretmek için kemik iliği yalıtım, diseksiyon içerir veya tümör nekroz faktör alfa (TNF-α) ve anti-c-fms antikor, M-CSF reseptör tarafından onların tutuklama.

Osteoklast oluşumu ve hızla çoğalmak-in Vitro Osteoklast habercisi Anti-c-fms antikor etkisi

Bu protokol, birincil hücrelerde veya izole kemiklerde amino asit tüketimini değerlendirmek için yararlı olan radyoişaretli bir amino asit alım testi sunar.

Kültürlenmiş Kemik Hücrelerinde ve İzole Kemik Şaftlarında Amino Asit Tüketiminin Değerlendirilmesi

Gerçek zamanlı hücre metabolik akısı testi, pH ve oksijen sensörlerini kullanarak mitokondriyal ve glikolitik adenozin trifosfat üretimine karşılık gelen oksijen tüketim oranını ve hücre dışı asitleşme oranını ölçer. Bu yazıda osteoblastların enerji durumunu ve hücresel biyoenerjetik durumun karakterizasyonu ve yorumlanmasını anlamak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Osteoblast Biyoenerjetik Teknolojilerini İzlemek için Gerçek Zamanlı Hücre Metabolik Akı Analizörünü Kullanma

Burada, kalsiyum fosfat kaplı hücre kültürü plakaları kullanılarak rezorpsiyon çukuru testleri için basit ve etkili bir tahlil prosedürü sunuyoruz.

Osteoklastik Rezorpsiyonu In Vitro Görselleştirmek ve Ölçmek için Basit Bir Pit Tahlil Protokolü

Burada, oligodendrosit öncü hücrelerini, merkezi sinir sistemi miyelinasyonunun in vitro modeli aracılığıyla oligodendrositlerdeki rollerini spesifik olarak sorgulamak amacıyla, ilgilenilen proteinleri aşırı eksprese etmek üzere viral olarak manipüle etmek için esnek ve stratejik bir temel sunan protokoller sunuyoruz.

Üretim ve seçici transduce İlköğretim Oligodendrosit Öncü Hücreler için Lentivirüste kullanımı için İn Vitro Myelinasyon Tahliller

Öğrenin, doğal uranyumun osteoklast canlılığı, farklılaşması ve işlevi üzerindeki etkilerini RAW 264.7 hücre kültürü kullanarak nasıl araştırılacağını. Bu yöntem çevre toksikolojisi ve kemik metabolizması çalışmaları için yeni bir tarama aracı sunar.

Vitro Osteoclastogenesis üzerinde doğal uranyum etkileri analiz yöntemleri

Daha fazla video keşfet