Vitro Osteoclastogenesis üzerinde doğal uranyum etkileri analiz yöntemleri

Bu prosedürün genel amacı, doğal uranyum maruziyetinin osteoklast canlılığı, farklılaşması ve işlevi üzerindeki etkilerini araştırmaktır. Bu yöntem, uranyum maruziyetinin kemik fizyolojisi ve metabolizması üzerindeki etkisi hakkında çevresel toksisite alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, uranyum yaratıcılarının taranması için ilginç yeni bir araç sağlamasıdır.

RAW 264.7 hücre kültürü %85 ila %90 birleşmeye ulaştığında, hücreleri hücre kültürü şişesinin altından mekanik olarak kaldırmak ve hücreleri steril 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Topakları parçalamak ve elde edilen tek hücreli süspansiyonu saymak için hücre çözeltisini birkaç kez pipetleyin. Hücreleri, L-glutamin ve% 5 fetal sığır serumu ile desteklenmiş alfa modifiyeli Minimum Esansiyel Ortamda mililitre başına 10 ila dördüncü hücre konsantrasyonuna seyreltin ve 37 santigrat derecede altı saatlik bir inkübasyon için 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasına oyuk başına bir mililitre hücre ekleyin.

Osteoklast farklılaşması ve yeniden absorpsiyon testinin tekrarlanabilirliği için önemli bir parametre hücre tohumlama yoğunluğudur. Hücreleri kaplamadan önce hücre sayımına, hücresel süspansiyon hazırlığına ve homojenliğine özellikle dikkat edin. Pisuar tuzu çözeltisini hazırlamak için, steril hücre kültürü ile test edilmiş% 7.5 sodyum bikarbonat sulu çözeltisinden başlayarak, önce 100 milimolar bikarbonatı buz üzerinde su içinde hazırlayın ve soğutun ve bir hacim 100 milimolar pisuar asetat çözeltisi ekleyin, damla damla, hafifçe çalkalayarak dokuz hacim buz gibi bikarbonat çözeltisine

Çözeltinin oda sıcaklığında dengelenmesine izin verin. Üç saat sonra, istenen pisuar çalışma konsantrasyonu elde edilene kadar mililitre başına 50 nanogram RANKL içeren farklılaşma ortamına uygun pisuar solüsyonu hacmini damla damla seyreltin ve oda sıcaklığında üç saatlik bir dengelemeye izin verin. Pisuar tuzunun her seyreltilmesinden sonraki uzun inkübasyon adımları, çözeltilerdeki pisuar komplekslerinin stabilizasyonu için gereklidir.

İkinci dengeleme süresinin sonunda, her bir oyuktaki ortamı uygun şekilde bir mililitre pisuar ile muamele edilmiş veya kontrol ortamı ile nazikçe değiştirin ve hücreleri inkübatöre geri koyun. Çok çekirdekli osteoklastlar, kültürün üçüncü ve dördüncü günleri arasında ortaya çıkmalıdır. Yeni farklılaşmış osteoklastların boyutunu ve morfolojisini değerlendirmek için, hücreleri üreticinin talimatlarına göre tartarat dirençli asit fosfataz ile boyayın ve her bir oyuğun tüm yüzeyini hücre çekirdeklerini ayırt etmek için yeterli bir çözünürlükte görüntüleyin.

Tüm kuyuların görüntüsü alındığında, açık kaynaklı ImageJ yazılımıyla bir kuyunun görüntüsünü açın ve ölçek birimlerini doğrulayın. Ardından, yeni ölçek birimlerini sonraki tüm görüntülere uygulamak için açılır penceredeki Global kutusunu işaretleyin. Analiz menüsünde Ölçümleri Ayarla'yı seçin ve Alan ve Ekran etiketi kutularını işaretleyin.

Diğer tüm kutuların işaretini kaldırın. Analiz menüsü altında, Araçlar'ı ve ardından İlgi Bölgesi Yöneticisi'ni açın ve ana ImageJ penceresinde dikdörtgen seçim aracını seçin. Yaklaşık 1.000 x 1.000 mikrometre boyutlarında bir ilgi alanı belirleyin ve seçimi İlgi Bölgesi Yöneticisi'ne eklemek için Ekle düğmesine tıklayın.

Ardından bölgeyi kaydetmek için Diğer, Kaydet'i tıklayın. Analiz edilecek beş bölgeden birinin kopyasını oluşturmak için, İlgilenilen Bölge Yöneticisi'nde ilgilenilen bölgeyi seçin ve bölgeyi çoğaltmak için seçili alanın içine sağ tıklayın. Tümünü Göster ve Etiketler kutularını işaretleyin ve çoğaltılan ilgili bölgedeki osteoklastlardan birini manuel olarak özetlemek için çokgen seçim aracını seçin.

Bu anahattı İlgi Alanı Yöneticisi'ne eklemek için, İlgi Alanı Yöneticisi penceresinde Ekle'ye tıklayın. Tüm osteoklastlar eklendiğinde, tüm ana hatları seçin ve yüzeylerini ölçmek için Ölç'e tıklayın. Ardından, sonuçlar penceresinde görünen ölçümleri bir hesap tablosuna aktarın.

Pisuar ile tedavi edilen osteoklastların işlevini değerlendirmek için, farklılaşma ortamını eklemeden bir gün önce, RAW hücrelerini% 85 ila% 90'lık bir birleşik hücre kültüründen, az önce gösterildiği gibi, büyüme ortamındaki 24 oyuklu bir osteo tahlil plakasına plakalayın. Ertesi gün, süpernatanı nazikçe farklılaşma pisuarı içeren ortamla değiştirin ve RAW hücrelerinin az önce gösterildiği gibi osteoklastlara farklılaşmasına izin verin. Osteoklastogenezin beşinci gününde, hücreleri kemik mimetik yüzeyinden çıkarmak için pisuar içeren ortamı% 10 ağartıcı solüsyonla değiştirin.

Oda sıcaklığında beş dakika sonra, kuyuları iki kez deiyonize su ile yıkayın ve kurumaya bırakın. Daha sonra, her bir oyuğun emilmemiş bölgelerindeki kalsiyum tuzlarını% 1 Alizarin Red S sodyum tuzu çözeltisi ile boyayın. 10 ila 15 saniye sonra, Alizarin çözeltisini çıkarın ve kuyucukları üç ila dört kez suyla nazikçe yıkayın.

Alizarin lekeli kuyucukların RGB görüntüsünü gri tonlamalı, 8 bit formatına dönüştürmek için, Görüntü menüsünde Tür ve 8 bit'i seçin. Ardından, oval seçim aracını kullanarak, emilim için analiz edilecek kuyunun tüm yüzeyinin ana hatlarını çizin ve az önce gösterildiği gibi ilgilenilen bölgeyi kaydedin. Eşik seçimini kolaylaştırmak için, tanımlanan ilgi alanının dışındaki tüm özellikleri temizlemek için Düzenle ve Dışını Temizle'yi seçin.

İlgilendiğiniz bölgeyi az önce gösterildiği gibi çoğaltın ve uygun bir eşik seçmek için kaydırma çubuğunu ayarlayarak Görüntü menüsü altında Eşiği Ayarla'yı seçin. Emilen alanların tümü eşiğin üzerinde olmalı ve beyaz görünmeli, emilmeyen alanların tümü ise eşiğin altında olmalı ve kırmızı görünmelidir. Eşik seçimini sonlandırmak için, Eşik penceresinde Uygula'yı tıklatın ve son ikili görüntüyü ilgilendiğiniz uygun biçimde kaydedin.

İlgilenilen bölge içinde alınacak ölçümleri tanımlamak için, Analiz menüsü altında, Ölçümleri Ayarla'yı seçin ve Alan, Alan Fraksiyonu ve Eşik Sınırla kutularını işaretleyin ve diğer tüm kutuların işaretini kaldırın. Ardından, emilen alanın fraksiyonunu doğrudan sonuçlar penceresinde elde etmek için, Düzenle menüsü altında Ters Çevir'i seçerek çoğaltılan ikili görüntüyü ters çevirin ve son ikili görüntüde ilgilenilen ana bölgenin seçili olmasına dikkat edin ve emilen alan fraksiyonunu ölçün. Uranyuma yanıt olarak yeni farklılaşmış osteoklastların sayısı ve boyutundaki değişiklikler, tüm kuyucukların kompozit görüntülerinde ve ayrıca belirli ilgi bölgelerinin büyütülmüş resimlerinde kolayca görülebilir.

Farklı kültür koşulları altında yetiştirilen osteoklastların boyutu, her bir bölgedeki tüm osteoklastların ana hatlarını çizerek ve ana hatları çizilen her bir hücrenin alanını ölçerek gösterildiği gibi analiz edilebilir. Uranyumun osteoklast rezorpsiyon aktivitesi üzerindeki etkisini araştırmak için, RAW 264.7 hücreleri osteo mimetik yüzey plakaları üzerinde kaplanır ve farklılaştırılır. Testin sonunda, osteoklastlar çıkarılır ve emilmeyen alanlar boyanır ve gösterildiği gibi görüntülenir.

Görüntüler daha sonra 8 bit gri tonlamaya dönüştürülür ve emilen alanların hesaplanmasını kolaylaştırmak için eşiklenir. Bu prosedür aynı zamanda diğer ağır metallerin osteoklastogenez üzerindeki etkisinin incelenmesine de uygulanabilir.