4.15: Ek V ve Propidyum İyodür Etiketleme

Hücrelerin Ek V ve propidyum iyodür (PI) etiketlemesi, hücre ölümünü tanımlamak ve farklı yollarını ayırt etmek için kullanılan bir tekniktir: apoptoz veya programlanmış hücre ölümü ve nekroz. Hücreler, yola bağlı olarak farklı morfolojik değişikliklere uğrar. Bilim adamları, bir hücrenin apoptoz veya nekroz geçirmesine neden olan spesifik koşulları belirleyerek, hücresel fizyoloji ve hastalığın patofizyolojisi hakkında fikir edinirler. Ek V ve PI etiketlemesi, ardından akış sitometrisi, hücre ölümünün türünü kategorize etmek için en etkili yöntemlerden biri olarak kurulmuştur.

Bugün, bu testin hücre ölüm yollarının belirlenmesine nasıl yardımcı olduğunu, bu tekniğin nasıl uygulanacağını ve hücre biyolojisi alanındaki önemli soruları yanıtlamak için bu yöntemi kullanan bazı heyecan verici örnek deneyleri açıklayacağız.

İlk olarak, annexin V ve PI boyamanın arkasındaki ilkelere bir göz atalım.

Daha önce de belirtildiği gibi, apoptotik hücreler kendine özgü morfolojik özellikler sergiler. Bunlar arasında hücre küçülmesi, zar kanaması, nükleer parçalanma ve apoptotik cisimlerin ortaya çıkması yer alır. Ek olarak, apoptozisin indüksiyonunu takiben, yani erken apoptotik evrede, zarda bazı karakteristik değişiklikler ortaya çıkar. Normal bir hücre zarı, iç broşürde tüm fosfatidilserin veya PS kalıntılarına sahiptir. Bununla birlikte, erken apoptotik hücrelerde bu PS kalıntılarının bir kısmı dış yüzeye translokasyon yapar, ama nasıl?

Bunu anlamak için bir adım geri gidelim. Apoptoz sırasında, sitozolik kaspazların aktive olduğu iyi bilinmektedir. Bu enzimler sırayla scramblase adı verilen zara bağlı bir enzimi aktive eder. Scramblase ?karıştırma? PS kalıntılarını sitoplazmik taraftan dış yüzeye translokasyon yaparak hücre zarı. Buna karşılık, nekroz sırasında PS kalıntıları oldukları yerde kalır, ancak zarın kendisi yırtılır. Ek V ve PI etiketlemesi, iki tip hücre ölümünün zar değişikliklerindeki bu farklılıklardan yararlanır.

Yaygın olarak FITC olarak bilinen floresein izotiyosiyanat gibi floresan boya ile konjuge edilen Annexin V, PS için zar geçirimsiz, doğal bir liganddır ve bu nedenle dışsallaştırılmış PS'ye bağlanarak erken apoptotik hücreleri kolayca tanımlar. Bununla birlikte, nekroz sırasında ve ayrıca apoptozun sonraki aşamalarında meydana gelen membran yırtılmasını takiben, annexin ayrıca iç yüzdeki PS'ye bağlanabilir ve yanlış pozitifler verebilir.

Bunu önlemek için, bilim adamları PI kullanır. Bu DNA bağlayıcı boya molekülü yine zar geçirimsizdir ve ancak zar yırtıldığında bir hücreye girebilir. Bu nedenle, bir hücre sadece eklin lekeliyse erken apoptotiktir, oysa hem PI hem de eklin lekeli bir hücre nekrotik veya geç apoptotik olabilir.

Artık bu tahlilin arkasındaki temel prensipleri öğrendiğinize göre, hücre ölümünü boyama ve analiz etme prosedürünü inceleyelim.

İlk olarak, hücreler herhangi bir morfolojik bozulmayı önlemek için düşük hızda toplanır ve santrifüjlenir ve PBS olarak da bilinen fosfat tamponlu salin gibi fizyolojik yıkama tamponunda yeniden süspanse edilir. Başka bir santrifüjleme adımını takiben, hücreler, PS'ye annexin bağlanması için gerekli olan kalsiyum içeren annexin V bağlama tamponunda yeniden süspanse edilir. FITC ile konjuge edilmiş annexin V daha sonra çözeltiye eklenir, bu da annexin ve PS birleşmesine izin vermek için karanlıkta oda sıcaklığında inkübe edilir. Bir sonraki adımda, PI doğrudan annexin boyama hücresi çözeltisine eklenir ve karanlıkta inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, hücreler santrifüjleme ile PBS'de yıkanır, yıkama tamponunda yeniden süspanse edilir ve buz üzerinde tutulur. Artık analize hazırlar.

Hücrelerin floresan aktivitesi, bir sıvı akışında asılı kalan tek hücrelerden floresan verilerini yakalayan lazer tabanlı bir teknik olan akış sitometrisi ile analiz edilir. Her boya ile ayrı ayrı boyanmış hücreler kullanılarak floresan kalibrasyonundan sonra, çift lekeli hücrelerden veriler elde edilir. Hücre popülasyonundan gelen floresan sinyalleri, eke bağlı FITC yoğunluğunun logaritmik X ekseninde ve PI'nin logaritmik Y ekseninde çizildiği bir çizim oluşturmak için kullanılır. Annexin-FITC pozitif ve PI negatif olan hücreler, erken apoptotik hücreleri temsil eden grafiğin sağ alt tarafında kümelenecek ve annexin-FITC ve PI için çift pozitif hücreler, geç apoptotik veya nekrotik hücreleri temsil eden sağ üstte meydana gelecektir. Hem annexin hem de PI için boyanmamış veya önemsiz derecede lekelenmiş kalan hücreler canlı hücrelerdir.

Artık hücre biyologlarının hücre ölümünü incelemek için neden bu tekniğe güvendiklerini bildiğinize göre, neden bazı uygulamalarını gözden geçirmiyoruz?

Bu prosedürü kullanarak, bilim adamları apoptozda hangi hücre içi proteinlerin yer aldığını takip edebilirler. Bu videoda araştırmacılar, bir anti-kanser ilacı olan sisplatinin, apoptozu indükleyip indüklemediğini görmek için normal böbrek hücreleri üzerindeki etkisini analiz ettiler. Bir hücre seti, enzim proteini kinaz C'nin veya PKC'nin aktif bir formunu aşırı eksprese etmek için transdüksiyona tabi tutuldu ve diğer set, fonksiyonel olmayan bir form olan baskın negatif PKC ile transdüksiyona tabi tutuldu. PKC'yi eksprese eden ve sisplatin ile tedavi edilen hücreler zamanla apoptoza maruz kaldı, ancak aktif olmayan dominant negatif PKC'yi eksprese eden hücreler apoptoza dirençliydi, bu da enzimin sisplatin kaynaklı apoptoz yolunda önemli bir oyuncu olduğunu gösteriyor.

Araştırmacılar ayrıca bu lekeleri spesifik T hücrelerinin sitotoksik potansiyelini test etmek için kullanırlar. Sitotoksik T hücreleri, hedef hücresindeki spesifik zar proteinlerini tanıyabilir ve ona bağlandıktan sonra ölümünü indükleyebilir. Burada, araştırmacılar antijene özgü T hücrelerini hedef tümör hücreleri ve annexin V ile inkübe ettiler ve daha sonra T hücresi katılımı ile tümör hücresi apoptozunun indüksiyonunu gözlemlediler. Flow sitometri verileri, sitotoksik T hücrelerinin varlığında ve yokluğunda hedef hücre ölümünün yüzdesini ortaya koydu.

Son olarak, bilim adamları, gen iletimini takiben hücre canlılığını değerlendirmek için bu yöntemi kullanırlar. Bu durumda, araştırmacılar, hücresel ve nükleer zarlarda geçici gözenekler oluşturmak için kimyasalların ve uygulanan bir elektrik alanının bir kombinasyonunu kullanan ve böylece gen iletimini kolaylaştıran bir yöntem olan nükleofeksiyondan sonra hücre sağkalımını değerlendirmek istediler. Ek V artı PI'nin DNA'ya bağlanmasına benzer şekilde 7-aminoaktinomisin D veya 7-AAD adı verilen bir boya kullanarak, nükleofeksiyonun apoptoz veya nekroz yoluyla düşük hücre ölümüne neden olduğunu gösterdiler.

Az önce JoVE'nin annexin V ve PI etiketleme ile ilgili videosunu izlediniz. Bu videoda, apoptotik ve nekrotik hücrelerin ayırt edici özelliklerini kısaca tartıştık, bu yöntemin arkasındaki prensipleri gözden geçirdik, yaygın olarak kullanılan bu teknik için genelleştirilmiş bir prosedür izledik ve bazı uygulamaları önizledik. Farklı hücrelerin farklı koşullar altında nasıl öldüğünü anlamanın önemi göz önüne alındığında, ek V ve PI etiketlemesi, bu fenomenle ilgilenen hücre biyologları için önemli bir araç olarak hizmet eder. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!