Ek V ve Propidyum İyodür Etiketleme
Hücrelerin Ek V ve propidyum iyodür (PI) etiketlemesi, hücre ölümünü tanımlamak ve farklı yollarını ayırt etmek için kullanılan bir tekniktir: apoptoz veya programlanmış hücre ölümü ve nekroz. Hücreler, yola bağlı olarak farklı morfolojik değişikliklere uğrar. Bilim adamları, bir hücrenin apoptoz veya nekroz geçirmesine neden olan spesifik koşulları belirleyerek, hücresel fizyoloji ve hastalığın patofizyolojisi hakkında fikir edinirler. Ek V ve PI etiketlemesi, ardından akış sitometrisi, hücre ölümünün türünü kategorize etmek için en etkili yöntemlerden biri olarak kurulmuştur.
Bugün, bu testin hücre ölüm yollarının tanımlanmasına nasıl yardımcı olduğunu, bu tekniğin nasıl uygulanacağını ve hücre biyolojisi alanındaki önemli soruları yanıtlamak için bu yöntemi kullanan bazı heyecan verici örnek deneyleri açıklayacağız.
İlk olarak, ek V ve PI boyamanın arkasındaki ilkelere bir göz atalım.
Daha önce de belirtildiği gibi, apoptotik hücreler kendine özgü morfolojik özellikler sergiler. Bunlar arasında hücre küçülmesi, zar kanaması, nükleer parçalanma ve apoptotik cisimlerin ortaya çıkması yer alır. Ek olarak, apoptozun indüksiyonunu takiben, yani erken apoptotik aşamada, zarda bazı karakteristik değişiklikler ortaya çıkar. Normal bir hücre zarı, iç broşürde tüm fosfatidilserin veya PS kalıntılarına sahiptir. Bununla birlikte, erken apoptotik hücrelerde bu PS kalıntılarının bir kısmı dış yüzeye translokasyon yapar - ama nasıl?
Bunu anlamak için bir adım geri gidelim. Apoptoz sırasında, sitozolik kaspazların aktive olduğu iyi bilinmektedir. Bu enzimler sırayla scramblase adı verilen zara bağlı bir enzimi aktive eder. Scramblase, PS kalıntılarını sitoplazmik taraftan dış yüzeye taşıyarak hücre zarını "karıştırır". Buna karşılık, nekroz sırasında PS kalıntıları oldukları yerde kalır, ancak zarın kendisi yırtılır. Ek V ve PI etiketlemesi, iki tip hücre ölümünün zar değişikliklerindeki bu farklılıklardan yararlanır.
Floresan boya ile konjuge edilen Annexin V, floresein izotiyosiyanat (yaygın olarak FITC olarak bilinir) gibi PS için zar geçirimsiz, doğal bir liganddır ve bu nedenle dışsallaştırılmış PS'ye bağlanarak erken apoptotik hücreleri kolayca tanımlar. Bununla birlikte, nekroz sırasında ve ayrıca apoptozun sonraki aşamalarında meydana gelen membran yırtılmasını takiben, annexin ayrıca iç yüzdeki PS'ye bağlanabilir ve yanlış pozitifler verebilir.
Bunu önlemek için, bilim adamları PI kullanır. Bu DNA bağlayıcı boya molekülü yine zar geçirimsizdir ve ancak zar yırtıldığında bir hücreye girebilir. Bu nedenle, bir hücre sadece eklin lekeliyse erken apoptotiktir, oysa hem PI hem de eklin lekeli bir hücre nekrotik veya geç apoptotik olabilir.
Artık bu testin arkasındaki temel ilkeleri öğrendiğinize göre, hücre ölümünü boyama ve analiz etme prosedürünü inceleyelim.
İlk olarak, hücreler herhangi bir morfolojik bozulmayı önlemek için düşük hızda toplanır ve santrifüjlenir ve PBS olarak da bilinen fosfat tamponlu salin gibi fizyolojik yıkama tamponunda yeniden süspanse edilir. Başka bir santrifüjleme adımını takiben, hücreler, PS'ye annexin bağlanması için gerekli olan kalsiyum içeren annexin V bağlama tamponunda yeniden süspanse edilir. FITC ile konjuge edilmiş annexin V daha sonra çözeltiye eklenir, bu da annexin ve PS birleşmesine izin vermek için karanlıkta oda sıcaklığında inkübe edilir. Bir sonraki adımda, PI doğrudan annexin boyama hücresi çözeltisine eklenir ve karanlıkta inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, hücreler santrifüjleme ile PBS'de yıkanır, yıkama tamponunda yeniden süspanse edilir ve buz üzerinde tutulur. Artık analize hazırlar.
Hücrelerin floresan aktivitesi, bir sıvı akışında asılı kalan tek hücrelerden floresan verilerini yakalayan lazer tabanlı bir teknik olan akış sitometrisi ile analiz edilir. Her boya ile ayrı ayrı boyanmış hücreler kullanılarak floresan kalibrasyonundan sonra, çift lekeli hücrelerden veriler elde edilir. Hücre popülasyonundan gelen floresan sinyalleri, eke bağlı FITC yoğunluğunun logaritmik X ekseninde ve PI'nin logaritmik Y ekseninde çizildiği bir çizim oluşturmak için kullanılır. Annexin-FITC pozitif ve PI negatif olan hücreler, erken apoptotik hücreleri temsil eden grafiğin sağ alt tarafında kümelenecek ve annexin-FITC ve PI için çift pozitif hücreler, geç apoptotik veya nekrotik hücreleri temsil eden sağ üstte meydana gelecektir. Hem annexin hem de PI için boyanmamış veya önemsiz derecede lekelenmiş kalan hücreler canlı hücrelerdir.
Artık hücre biyologlarının hücre ölümünü incelemek için neden bu tekniğe güvendiklerini bildiğinize göre, neden bazı uygulamalarını gözden geçirmiyoruz?
Bu prosedürü kullanarak, bilim adamları apoptozda hangi hücre içi proteinlerin yer aldığını takip edebilirler. Bu videoda araştırmacılar, bir anti-kanser ilacı olan sisplatinin, apoptozu indükleyip indüklemediğini görmek için normal böbrek hücreleri üzerindeki etkisini analiz ettiler. Bir hücre seti, enzim proteini kinaz C'nin veya PKC'nin aktif bir formunu aşırı eksprese etmek için transdüksiyona tabi tutuldu ve diğer set, fonksiyonel olmayan bir form olan baskın negatif PKC ile transdüksiyona tabi tutuldu. PKC'yi eksprese eden ve sisplatin ile tedavi edilen hücreler zamanla apoptoza maruz kaldı, ancak aktif olmayan dominant negatif PKC'yi eksprese eden hücreler apoptoza dirençliydi, bu da enzimin sisplatin kaynaklı apoptoz yolunda önemli bir oyuncu olduğunu gösteriyor.
Araştırmacılar ayrıca bu lekeleri spesifik T hücrelerinin sitotoksik potansiyelini test etmek için kullanırlar. Sitotoksik T hücreleri, hedef hücresindeki spesifik zar proteinlerini tanıyabilir ve ona bağlandıktan sonra ölümünü indükleyebilir. Burada, araştırmacılar antijene özgü T hücrelerini hedef tümör hücreleri ve annexin V ile inkübe ettiler ve daha sonra T hücresi katılımı ile tümör hücresi apoptozunun indüksiyonunu gözlemlediler. Flow sitometri verileri, sitotoksik T hücrelerinin varlığında ve yokluğunda hedef hücre ölümünün yüzdesini ortaya koydu.
Son olarak, bilim adamları, gen iletimini takiben hücre canlılığını değerlendirmek için bu yöntemi kullanırlar. Bu durumda, araştırmacılar, hücresel ve nükleer zarlarda geçici gözenekler oluşturmak için kimyasalların ve uygulanan bir elektrik alanının bir kombinasyonunu kullanan ve böylece gen iletimini kolaylaştıran bir yöntem olan nükleofeksiyondan sonra hücre sağkalımını değerlendirmek istediler. Ek V artı PI'nin DNA'ya bağlanmasına benzer şekilde 7-aminoaktinomisin D veya 7-AAD adı verilen bir boya kullanarak, nükleofeksiyonun apoptoz veya nekroz yoluyla düşük hücre ölümüne neden olduğunu gösterdiler.
Az önce JoVE'nin annexin V ve PI etiketleme hakkındaki videosunu izlediniz. Bu videoda, apoptotik ve nekrotik hücrelerin ayırt edici özelliklerini kısaca tartıştık, bu yöntemin arkasındaki prensipleri gözden geçirdik, yaygın olarak kullanılan bu teknik için genelleştirilmiş bir prosedür izledik ve bazı uygulamaları önizledik. Farklı hücrelerin farklı koşullar altında nasıl öldüğünü anlamanın önemi göz önüne alındığında, ek V ve PI etiketlemesi, bu fenomenle ilgilenen hücre biyologları için önemli bir araç olarak hizmet eder. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Ek V ve propidyum iyodür (PI) ile boyama, araştırmacılara nekroz veya apoptoz gibi farklı hücre ölümü türlerini tanımlamanın bir yolunu sağlar. Bu tek…
Hücrelerin Ek V ve propidyum iyodür (PI) etiketlemesi, hücre ölümünü tanımlamak ve farklı yollarını ayırt etmek için kullanılan bir tekniktir: apoptoz veya programlanmış hücre ölümü ve nekroz. Hücreler, yola bağlı olarak farklı morfolojik değişikliklere uğrar. Bilim adamları, bir hücrenin apoptoz veya nekroz geçirmesine neden olan spesifik koşulları belirleyerek, hücresel fizyoloji ve hastalığın patofizyolojisi hakkında fikir edinirler. Ek V ve PI etiketlemesi, ardından akış sitometrisi, hücre ölümünün türünü kategorize etmek için en etkili yöntemlerden biri olarak kurulmuştur.
Bugün, bu testin hücre ölüm yollarının tanımlanmasına nasıl yardımcı olduğunu, bu tekniğin nasıl uygulanacağını ve hücre biyolojisi alanındaki önemli soruları yanıtlamak için bu yöntemi kullanan bazı heyecan verici örnek deneyleri açıklayacağız.
İlk olarak, ek V ve PI boyamanın arkasındaki ilkelere bir göz atalım.
Daha önce de belirtildiği gibi, apoptotik hücreler kendine özgü morfolojik özellikler sergiler. Bunlar arasında hücre küçülmesi, zar kanaması, nükleer parçalanma ve apoptotik cisimlerin ortaya çıkması yer alır. Ek olarak, apoptozun indüksiyonunu takiben, yani erken apoptotik aşamada, zarda bazı karakteristik değişiklikler ortaya çıkar. Normal bir hücre zarı, iç broşürde tüm fosfatidilserin veya PS kalıntılarına sahiptir. Bununla birlikte, erken apoptotik hücrelerde bu PS kalıntılarının bir kısmı dış yüzeye translokasyon yapar - ama nasıl?
Bunu anlamak için bir adım geri gidelim. Apoptoz sırasında, sitozolik kaspazların aktive olduğu iyi bilinmektedir. Bu enzimler sırayla scramblase adı verilen zara bağlı bir enzimi aktive eder. Scramblase, PS kalıntılarını sitoplazmik taraftan dış yüzeye taşıyarak hücre zarını "karıştırır". Buna karşılık, nekroz sırasında PS kalıntıları oldukları yerde kalır, ancak zarın kendisi yırtılır. Ek V ve PI etiketlemesi, iki tip hücre ölümünün zar değişikliklerindeki bu farklılıklardan yararlanır.
Floresan boya ile konjuge edilen Annexin V, floresein izotiyosiyanat (yaygın olarak FITC olarak bilinir) gibi PS için zar geçirimsiz, doğal bir liganddır ve bu nedenle dışsallaştırılmış PS'ye bağlanarak erken apoptotik hücreleri kolayca tanımlar. Bununla birlikte, nekroz sırasında ve ayrıca apoptozun sonraki aşamalarında meydana gelen membran yırtılmasını takiben, annexin ayrıca iç yüzdeki PS'ye bağlanabilir ve yanlış pozitifler verebilir.
Bunu önlemek için, bilim adamları PI kullanır. Bu DNA bağlayıcı boya molekülü yine zar geçirimsizdir ve ancak zar yırtıldığında bir hücreye girebilir. Bu nedenle, bir hücre sadece eklin lekeliyse erken apoptotiktir, oysa hem PI hem de eklin lekeli bir hücre nekrotik veya geç apoptotik olabilir.
Artık bu testin arkasındaki temel ilkeleri öğrendiğinize göre, hücre ölümünü boyama ve analiz etme prosedürünü inceleyelim.
İlk olarak, hücreler herhangi bir morfolojik bozulmayı önlemek için düşük hızda toplanır ve santrifüjlenir ve PBS olarak da bilinen fosfat tamponlu salin gibi fizyolojik yıkama tamponunda yeniden süspanse edilir. Başka bir santrifüjleme adımını takiben, hücreler, PS'ye annexin bağlanması için gerekli olan kalsiyum içeren annexin V bağlama tamponunda yeniden süspanse edilir. FITC ile konjuge edilmiş annexin V daha sonra çözeltiye eklenir, bu da annexin ve PS birleşmesine izin vermek için karanlıkta oda sıcaklığında inkübe edilir. Bir sonraki adımda, PI doğrudan annexin boyama hücresi çözeltisine eklenir ve karanlıkta inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, hücreler santrifüjleme ile PBS'de yıkanır, yıkama tamponunda yeniden süspanse edilir ve buz üzerinde tutulur. Artık analize hazırlar.
Hücrelerin floresan aktivitesi, bir sıvı akışında asılı kalan tek hücrelerden floresan verilerini yakalayan lazer tabanlı bir teknik olan akış sitometrisi ile analiz edilir. Her boya ile ayrı ayrı boyanmış hücreler kullanılarak floresan kalibrasyonundan sonra, çift lekeli hücrelerden veriler elde edilir. Hücre popülasyonundan gelen floresan sinyalleri, eke bağlı FITC yoğunluğunun logaritmik X ekseninde ve PI'nin logaritmik Y ekseninde çizildiği bir çizim oluşturmak için kullanılır. Annexin-FITC pozitif ve PI negatif olan hücreler, erken apoptotik hücreleri temsil eden grafiğin sağ alt tarafında kümelenecek ve annexin-FITC ve PI için çift pozitif hücreler, geç apoptotik veya nekrotik hücreleri temsil eden sağ üstte meydana gelecektir. Hem annexin hem de PI için boyanmamış veya önemsiz derecede lekelenmiş kalan hücreler canlı hücrelerdir.
Artık hücre biyologlarının hücre ölümünü incelemek için neden bu tekniğe güvendiklerini bildiğinize göre, neden bazı uygulamalarını gözden geçirmiyoruz?
Bu prosedürü kullanarak, bilim adamları apoptozda hangi hücre içi proteinlerin yer aldığını takip edebilirler. Bu videoda araştırmacılar, bir anti-kanser ilacı olan sisplatinin, apoptozu indükleyip indüklemediğini görmek için normal böbrek hücreleri üzerindeki etkisini analiz ettiler. Bir hücre seti, enzim proteini kinaz C'nin veya PKC'nin aktif bir formunu aşırı eksprese etmek için transdüksiyona tabi tutuldu ve diğer set, fonksiyonel olmayan bir form olan baskın negatif PKC ile transdüksiyona tabi tutuldu. PKC'yi eksprese eden ve sisplatin ile tedavi edilen hücreler zamanla apoptoza maruz kaldı, ancak aktif olmayan dominant negatif PKC'yi eksprese eden hücreler apoptoza dirençliydi, bu da enzimin sisplatin kaynaklı apoptoz yolunda önemli bir oyuncu olduğunu gösteriyor.
Araştırmacılar ayrıca bu lekeleri spesifik T hücrelerinin sitotoksik potansiyelini test etmek için kullanırlar. Sitotoksik T hücreleri, hedef hücresindeki spesifik zar proteinlerini tanıyabilir ve ona bağlandıktan sonra ölümünü indükleyebilir. Burada, araştırmacılar antijene özgü T hücrelerini hedef tümör hücreleri ve annexin V ile inkübe ettiler ve daha sonra T hücresi katılımı ile tümör hücresi apoptozunun indüksiyonunu gözlemlediler. Flow sitometri verileri, sitotoksik T hücrelerinin varlığında ve yokluğunda hedef hücre ölümünün yüzdesini ortaya koydu.
Son olarak, bilim adamları, gen iletimini takiben hücre canlılığını değerlendirmek için bu yöntemi kullanırlar. Bu durumda, araştırmacılar, hücresel ve nükleer zarlarda geçici gözenekler oluşturmak için kimyasalların ve uygulanan bir elektrik alanının bir kombinasyonunu kullanan ve böylece gen iletimini kolaylaştıran bir yöntem olan nükleofeksiyondan sonra hücre sağkalımını değerlendirmek istediler. Ek V artı PI'nin DNA'ya bağlanmasına benzer şekilde 7-aminoaktinomisin D veya 7-AAD adı verilen bir boya kullanarak, nükleofeksiyonun apoptoz veya nekroz yoluyla düşük hücre ölümüne neden olduğunu gösterdiler.
Az önce JoVE'nin annexin V ve PI etiketleme hakkındaki videosunu izlediniz. Bu videoda, apoptotik ve nekrotik hücrelerin ayırt edici özelliklerini kısaca tartıştık, bu yöntemin arkasındaki prensipleri gözden geçirdik, yaygın olarak kullanılan bu teknik için genelleştirilmiş bir prosedür izledik ve bazı uygulamaları önizledik. Farklı hücrelerin farklı koşullar altında nasıl öldüğünü anlamanın önemi göz önüne alındığında, ek V ve PI etiketlemesi, bu fenomenle ilgilenen hücre biyologları için önemli bir araç olarak hizmet eder. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Hücrelerin Ek V ve propidyum iyodür (PI) etiketlemesi, hücre ölümünü tanımlamak ve farklı yollarını ayırt etmek için kullanılan bir tekniktir: apoptoz veya programlanmış hücre ölümü ve nekroz. Hücreler, yola bağlı olarak farklı morfolojik değişikliklere uğrar. Bilim adamları, bir hücrenin apoptoz veya nekroz geçirmesine neden olan spesifik koşulları belirleyerek, hücresel fizyoloji ve hastalığın patofizyolojisi hakkında fikir edinirler. Ek V ve PI etiketlemesi, ardından akış sitometrisi, hücre ölümünün türünü kategorize etmek için en etkili yöntemlerden biri olarak kurulmuştur.
Bugün, bu testin hücre ölüm yollarının tanımlanmasına nasıl yardımcı olduğunu, bu tekniğin nasıl uygulanacağını ve hücre biyolojisi alanındaki önemli soruları yanıtlamak için bu yöntemi kullanan bazı heyecan verici örnek deneyleri açıklayacağız.
İlk olarak, ek V ve PI boyamanın arkasındaki ilkelere bir göz atalım.
Daha önce de belirtildiği gibi, apoptotik hücreler kendine özgü morfolojik özellikler sergiler. Bunlar arasında hücre küçülmesi, zar kanaması, nükleer parçalanma ve apoptotik cisimlerin ortaya çıkması yer alır. Ek olarak, apoptozun indüksiyonunu takiben, yani erken apoptotik aşamada, zarda bazı karakteristik değişiklikler ortaya çıkar. Normal bir hücre zarı, iç broşürde tüm fosfatidilserin veya PS kalıntılarına sahiptir. Bununla birlikte, erken apoptotik hücrelerde bu PS kalıntılarının bir kısmı dış yüzeye translokasyon yapar - ama nasıl?
Bunu anlamak için bir adım geri gidelim. Apoptoz sırasında, sitozolik kaspazların aktive olduğu iyi bilinmektedir. Bu enzimler sırayla scramblase adı verilen zara bağlı bir enzimi aktive eder. Scramblase, PS kalıntılarını sitoplazmik taraftan dış yüzeye taşıyarak hücre zarını "karıştırır". Buna karşılık, nekroz sırasında PS kalıntıları oldukları yerde kalır, ancak zarın kendisi yırtılır. Ek V ve PI etiketlemesi, iki tip hücre ölümünün zar değişikliklerindeki bu farklılıklardan yararlanır.
Floresan boya ile konjuge edilen Annexin V, floresein izotiyosiyanat (yaygın olarak FITC olarak bilinir) gibi PS için zar geçirimsiz, doğal bir liganddır ve bu nedenle dışsallaştırılmış PS'ye bağlanarak erken apoptotik hücreleri kolayca tanımlar. Bununla birlikte, nekroz sırasında ve ayrıca apoptozun sonraki aşamalarında meydana gelen membran yırtılmasını takiben, annexin ayrıca iç yüzdeki PS'ye bağlanabilir ve yanlış pozitifler verebilir.
Bunu önlemek için, bilim adamları PI kullanır. Bu DNA bağlayıcı boya molekülü yine zar geçirimsizdir ve ancak zar yırtıldığında bir hücreye girebilir. Bu nedenle, bir hücre sadece eklin lekeliyse erken apoptotiktir, oysa hem PI hem de eklin lekeli bir hücre nekrotik veya geç apoptotik olabilir.
Artık bu testin arkasındaki temel ilkeleri öğrendiğinize göre, hücre ölümünü boyama ve analiz etme prosedürünü inceleyelim.
İlk olarak, hücreler herhangi bir morfolojik bozulmayı önlemek için düşük hızda toplanır ve santrifüjlenir ve PBS olarak da bilinen fosfat tamponlu salin gibi fizyolojik yıkama tamponunda yeniden süspanse edilir. Başka bir santrifüjleme adımını takiben, hücreler, PS'ye annexin bağlanması için gerekli olan kalsiyum içeren annexin V bağlama tamponunda yeniden süspanse edilir. FITC ile konjuge edilmiş annexin V daha sonra çözeltiye eklenir, bu da annexin ve PS birleşmesine izin vermek için karanlıkta oda sıcaklığında inkübe edilir. Bir sonraki adımda, PI doğrudan annexin boyama hücresi çözeltisine eklenir ve karanlıkta inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, hücreler santrifüjleme ile PBS'de yıkanır, yıkama tamponunda yeniden süspanse edilir ve buz üzerinde tutulur. Artık analize hazırlar.
Hücrelerin floresan aktivitesi, bir sıvı akışında asılı kalan tek hücrelerden floresan verilerini yakalayan lazer tabanlı bir teknik olan akış sitometrisi ile analiz edilir. Her boya ile ayrı ayrı boyanmış hücreler kullanılarak floresan kalibrasyonundan sonra, çift lekeli hücrelerden veriler elde edilir. Hücre popülasyonundan gelen floresan sinyalleri, eke bağlı FITC yoğunluğunun logaritmik X ekseninde ve PI'nin logaritmik Y ekseninde çizildiği bir çizim oluşturmak için kullanılır. Annexin-FITC pozitif ve PI negatif olan hücreler, erken apoptotik hücreleri temsil eden grafiğin sağ alt tarafında kümelenecek ve annexin-FITC ve PI için çift pozitif hücreler, geç apoptotik veya nekrotik hücreleri temsil eden sağ üstte meydana gelecektir. Hem annexin hem de PI için boyanmamış veya önemsiz derecede lekelenmiş kalan hücreler canlı hücrelerdir.
Artık hücre biyologlarının hücre ölümünü incelemek için neden bu tekniğe güvendiklerini bildiğinize göre, neden bazı uygulamalarını gözden geçirmiyoruz?
Bu prosedürü kullanarak, bilim adamları apoptozda hangi hücre içi proteinlerin yer aldığını takip edebilirler. Bu videoda araştırmacılar, bir anti-kanser ilacı olan sisplatinin, apoptozu indükleyip indüklemediğini görmek için normal böbrek hücreleri üzerindeki etkisini analiz ettiler. Bir hücre seti, enzim proteini kinaz C'nin veya PKC'nin aktif bir formunu aşırı eksprese etmek için transdüksiyona tabi tutuldu ve diğer set, fonksiyonel olmayan bir form olan baskın negatif PKC ile transdüksiyona tabi tutuldu. PKC'yi eksprese eden ve sisplatin ile tedavi edilen hücreler zamanla apoptoza maruz kaldı, ancak aktif olmayan dominant negatif PKC'yi eksprese eden hücreler apoptoza dirençliydi, bu da enzimin sisplatin kaynaklı apoptoz yolunda önemli bir oyuncu olduğunu gösteriyor.
Araştırmacılar ayrıca bu lekeleri spesifik T hücrelerinin sitotoksik potansiyelini test etmek için kullanırlar. Sitotoksik T hücreleri, hedef hücresindeki spesifik zar proteinlerini tanıyabilir ve ona bağlandıktan sonra ölümünü indükleyebilir. Burada, araştırmacılar antijene özgü T hücrelerini hedef tümör hücreleri ve annexin V ile inkübe ettiler ve daha sonra T hücresi katılımı ile tümör hücresi apoptozunun indüksiyonunu gözlemlediler. Flow sitometri verileri, sitotoksik T hücrelerinin varlığında ve yokluğunda hedef hücre ölümünün yüzdesini ortaya koydu.
Son olarak, bilim adamları, gen iletimini takiben hücre canlılığını değerlendirmek için bu yöntemi kullanırlar. Bu durumda, araştırmacılar, hücresel ve nükleer zarlarda geçici gözenekler oluşturmak için kimyasalların ve uygulanan bir elektrik alanının bir kombinasyonunu kullanan ve böylece gen iletimini kolaylaştıran bir yöntem olan nükleofeksiyondan sonra hücre sağkalımını değerlendirmek istediler. Ek V artı PI'nin DNA'ya bağlanmasına benzer şekilde 7-aminoaktinomisin D veya 7-AAD adı verilen bir boya kullanarak, nükleofeksiyonun apoptoz veya nekroz yoluyla düşük hücre ölümüne neden olduğunu gösterdiler.
Az önce JoVE'nin annexin V ve PI etiketleme hakkındaki videosunu izlediniz. Bu videoda, apoptotik ve nekrotik hücrelerin ayırt edici özelliklerini kısaca tartıştık, bu yöntemin arkasındaki prensipleri gözden geçirdik, yaygın olarak kullanılan bu teknik için genelleştirilmiş bir prosedür izledik ve bazı uygulamaları önizledik. Farklı hücrelerin farklı koşullar altında nasıl öldüğünü anlamanın önemi göz önüne alındığında, ek V ve PI etiketlemesi, bu fenomenle ilgilenen hücre biyologları için önemli bir araç olarak hizmet eder. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How does phosphatidylserine translocation distinguish apoptotic cells from necrotic cells?
During apoptosis, cytosolic caspases activate scramblase, an enzyme that translocates phosphatidylserine (PS) residues from the inner cell membrane to the outer surface. In necrosis, PS remains internal but the membrane ruptures. Annexin V binds externalized PS in early apoptotic cells, while propidium iodide enters only when membranes rupture, allowing researchers to differentiate between these death pathways.
Q2: Why is propidium iodide used alongside annexin V in cell death assays?
Propidium iodide (PI) is a membrane-impermeable DNA-binding dye that enters cells only when membranes rupture. Since annexin V alone cannot distinguish early apoptosis from late apoptosis or necrosis, PI provides critical differentiation. Cells positive for annexin V but negative for PI indicate early apoptosis, while double-positive cells represent late apoptotic or necrotic cells.
Q3: What are the key steps in preparing cells for annexin V and propidium iodide staining?
Cells are harvested and centrifuged at low speed, then resuspended in phosphate-buffered saline (PBS). After centrifugation, cells are resuspended in annexin V binding buffer containing calcium, which is necessary for annexin binding to phosphatidylserine. Annexin V conjugated with fluorescein isothiocyanate (FITC) is added and incubated in the dark, followed by propidium iodide addition and another dark incubation.
Q4: How does flow cytometry interpret annexin V and propidium iodide staining patterns?
Flow cytometry plots annexin-FITC intensity on the logarithmic X-axis and PI on the Y-axis. Cells positive for annexin-FITC but negative for PI cluster in the lower right quadrant, representing early apoptotic cells. Double-positive cells appear in the upper right, indicating late apoptotic or necrotic cells. Unstained or insignificantly stained cells in the lower left represent live cells.
Q5: How have researchers used annexin V and PI labeling to study protein kinase C in cisplatin-induced apoptosis?
Researchers compared kidney cells overexpressing active protein kinase C (PKC) with cells expressing inactive dominant-negative PKC. When treated with cisplatin, cells with active PKC underwent apoptosis over time, while dominant-negative PKC cells resisted apoptosis. This demonstrated that PKC is a key player in the cisplatin-induced apoptosis pathway, revealing important mechanisms of an introduction to cell death.
Q6: What do annexin V and PI staining reveal about cytotoxic T cell function?
Researchers incubate antigen-specific cytotoxic T cells with target tumor cells in the presence of annexin V and PI. Flow cytometry data reveals the percentage of target cell death induced by T cell engagement. This method demonstrates how cytotoxic T cells recognize specific membrane proteins on target cells and induce apoptosis upon binding.
Q7: How is annexin V and PI staining used to assess cell viability after nucleofection?
Nucleofection uses chemicals and electric fields to create transient pores in cell membranes for gene delivery. Researchers use annexin V plus 7-aminoactinomycin D (7-AAD), a DNA-binding dye similar to PI, to evaluate cell survival post-nucleofection. This staining approach quantifies cell death by apoptosis or necrosis, demonstrating nucleofection's impact on cell viability.
Bu videodaki bölümler
0:00
Overview
1:07
Principles Behind Annexin V/PI Staining
3:48
Generalized Protocol for Annexin V/PI Staining
5:58
Applications
8:23
Summary