Ateş, Drosophila modeli yetişkin tırmanma davranışı çözümlemek için bir otomatik hızlı yinelemeli negatif Geotaxis tahlil
12 Eylül 2017
Bu adım adım protokolü Drosophila negatif geotaxis davranışı sinekler yüzlerce ev sahipliği yapan ve eylemlerinin bir elektrik motoru ile eşitler otomatik çoklu silindir sistemi kullanarak çözümler. Eşitleme sinek negatif geotaxis davranış, dijital kaydedilen ve analiz kendi kendine tasarlanmış RflyDetection yazılım kullanarak denetlesinler.
Bu otomatik hızlı yinelemeli negatif geotaksi analiz yönteminin genel amacı, nörodejenerasyon ile ilişkili Drosophila yetişkin tırmanma eksikliklerini analiz etmektir. Bu yöntem, nörodejenerasyon ile ilişkili lokomotif eksikliklerin mekanizmasını da içeren sinirbilim alanındaki önemli sorulara cevap vermeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sinek tırmanma aktivitesinin otomatik ve yüksek hassasiyetli bir şekilde analiz edilebilmesidir.
Bu tekniğin uygulamaları, nörodejenerasyonun tedavisi ve teşhisine yöneliktir, çünkü nörodejeneratif hastalıklar sıklıkla ilerleyici hareket kabiliyeti kaybı ve kısalmış yaşam süresi ve yaşa bağlı nörodejenerasyon ile ilişkilidir. Bu yöntem için fikri ilk bizde vardı. Drosophila yetişkinlerin lokomotif aktivitesini daha doğru bir şekilde ölçmek istedik.
Sinek toplama işlemine başlamak için, sinekleri standart sinek mamasında, 25 derece Celsius, %70 nem ve 12 saat ışık, 12 saat karanlık döngüsünde tutun. UAS-Dicer2 DDC-GAL4 sinek bakirelerini karbon dioksit anestezisi altında toplayın. Bakireleri, aşağıdaki genotiplere sahip iki günlük yetişkin erkek sinekleri ile, erkek/dişi oranı bir-iki olarak çaprazlayın.
Her grup için yeni açılan erkek ve dişileri ayrı ayrı, her deney için üç şişede toplayın ve her normal sinek şişesine 10 sinek yerleştirin. Ardından şişeleri 25 derece Celsius'a ayarlayın. Otomatik RING analizini gerçekleştirmek için, her genotipte 10 toplanan cinsiyetsiz sinekle birlikte her şişeye aktarın.
Daha sonra vidayı bir vida ile sabitleyin. Kontrol sinekleri ve farklı genotipleri taşıyan sinekleri her deney seti için birlikte analiz edin. Cihazın önünde yer alan dijital kamerayı açın ve sinekleri yükledikten ve hazır olduktan sonra kaydı başlatın.
Kamera, tüm sinekleri nispeten doğru konumlarda yakalamaları için RING cihazına uygun bir mesafede yatay olarak yerleştirilmelidir. Sinekleri vidayı çözmek için bir dakika beklettikten sonra, adım sürücüyü kontrol eden adım kontrol cihazını açın. Bu, küçük elektrik motorunu, bağlı kaldıracı sürekli yükseltip ve iki saniye içinde cihazı dört kez hafifçe vurmasını sağlar.
Cihazı hafifçe vurduktan sonra, sinekleri duvarı tırmanmaya başladığını fark edeceksiniz. Kaydı hâlâ açık iken, gösterilen senkronizasyonu üç ila beş art arda deneme için 60 saniye aralıklarla tekrarlayın. Deneyi beş, 15, 25 ve 35 günlük sinekler için tekrarlayın.
Her grup için her deneyde en az üç bağımsız deney yapın, en az 30 toplanan sinek veya üç şişe ile. Verileri analiz etmek için, kaydedilen videoyu bilgisayara aktarın. Her deneme için, hafifçe vurduktan altı saniye sonra videodan bir anlık görüntü alın.
R-sinek algılama yazılımında, dosya menüsünü kullanarak anlık görüntüyü içe aktarın. Ardından, Araç Çubuğu'ndaki temel çizgi simgesini kullanarak, vidayı üst ve alt temel çizgilerini tam olarak ayarlayın ve ardından imleci kullanarak görüntü üzerindeki üst ve alt temel çizgileri işaretleyin. Ayarlar çubuğunda, Flies in Rect alanında her vidayı başına sinek sayısını ve Tüp Yüksekliği alanında vidayı uzunluğunu girin.
Her vidayı başına bireysel sinek pozisyonları, ekran üzerinde noktalarla işaretlenir. Her vidayı başına sinek sayısının tırmanma mesafesini otomatik olarak belirleyen yazılımın sağ paneldeki bir tabloda ortalama değerleri görebileceğinizi unutmayın. Verileri ortalama ± SEM olarak sunun.
Önem düzeylerinin P değerlerini, Bonferroni çoklu karşılaştırma testi ile birlikte tek yönlü bir ANOVA kullanarak hesaplayın. Bu videoda sunulan otomatik RING analizi kullanılarak Dicer2 atanmış sineklerin analizi, her iki erkek ve dişi sinek için altı saniyelik bir süre çerçevesinde yaşa bağlı bir tırmanma mesafesinde azalmayı gösterdi ve bu da dopaminerjik veya DA nöronlarında aux ekspresyonunun sinek lokomotor aktivitesi için kritik olduğunu öne sürdü. Climbing ability, DA nöronlarında auxGFP aşırı ekspresyonu ve auxR ve auxGFP'nin DA nöronlarında koekspresyonu RNAi fenomeninden kurtarıldığında etkilenmiyor gibi görünmektedir.
Bir kez ustalaşıldığında, bu doğru yapılırsa iki ila üç saat içinde yapılabilir. Bu gelişimi elde etmek şimdi sinirbilim alanındaki araştırmacıların Drosophila melanogaster'de nörodejenerasyonu keşfetmeleri için bir yol haline gelmiştir. Elektrikli RING cihazıyla çalışırken son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirmeden önce her onayın sıkıca sabitlenmesi ve dikkatlice kontrol edilmesi gerektiğini unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, nörodejenerasyonla ilişkili yetişkin tırmanma kusurlarına odaklanarak, Drosophila negatif jeotaksi davranışını analiz etmek için otomatik bir yöntemi ayrıntılandırmaktadır. Teknik, sinek hareketlerini senkronize etmek ve kaydetmek için çok silindirli bir sistem kullanarak lokomotor kusurlar hakkında içgörüler sağlar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Davranış Analizi
- Nörodejenerasyon
Arka Plan
- Drosophila, nörodejeneratif hastalıkların incelenmesinde model organizma olarak kullanılır.
- Negatif jeotaksi davranışı, sineklerde lokomotor yeteneğin bir ölçütüdür.
- Nörodejenerasyon genellikle hareket yeteneğinde ve yaşam süresinde progresif kayıplara yol açar.
- Otomatik sistemler, davranışsal analizlerin doğruluğunu artırır.
Çalışmanın Amacı
- Nörodejenerasyonla ilişkili Drosophila tırmanma kusurlarını analiz etmek.
- Lokomotor kusurların altında yatan mekanizmaları araştırmak.
- Sineklerin lokomotor aktivite ölçüm hassasiyetini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Sinek hareketlerinin senkronize edilmesi için otomatik çok silindirli sistem.
- Negatif geotaksi davranışının dijital kaydı.
- Özel olarak tasarlanmış RflyDetection yazılımı kullanılarak yapılan analiz.
- Yüksek kapasiteli veri toplama için hızlı iteratif analiz.
Temel Sonuçlar
- Doğru analiz için sinek hareketlerinin başarılı şekilde senkronizasyonu.
- Nörodejenerasyonla bağlantılı tırmanma eksikliklerinin belirlenmesi.
- Otomatik analizin verimli ve güvenilir olduğu kanıtlanmıştır.
- Nörodejeneratif hastalıkların tedavisi ve teşhisi için potansiyel etkiler.
Sonuçlar
- Otomatik analiz, Drosophila'da lokomotor davranışı incelemek için güçlü bir yöntem sunar.
- Elde edilen bulgular, nörodejenerasyon için terapötik yaklaşımlara bilgi sağlayabilir.
- Bu teknik, hareket ile nörodejeneratif durumlar arasındaki ilişkinin anlaşılmasını geliştirir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Bu otomatik yüksek kapasiteli analiz, nörodejenerasyonun Drosophila modellerindeki lokomotor eksikliklerin hızlı bir şekilde miktarının belirlenmesini sağlayarak, objektif ve tekrarlanabilir davranışsal okumalar sunup erken aşama hedef doğrulamasını destekler. Yöntem, birden fazla genotip ve yaş grubundaki yüzlerce sineğin eşzamanlı analizine olanak tanıyarak preklinik taramalarda öngörüsel güveni artırır ve bileşiklerin veya genetik modifikatörlerin verimli bir şekilde değerlendirilmesini kolaylaştırır. Keşif iş akışlarına entegrasyonu, standardize edilmiş ve ölçeklenebilir fenotipleme yoluyla nörodejeneratif hedeflerin mekanistik risklerinin azaltılmasına yardımcı olur.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Genetik modellerde nörodejenerasyonla ilişkili yaşa bağlı tırmanma defisitlerini nicelleştirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Nöronal bütünlüğe vekaleten lokomotor aktivitenin yüksek kapasiteli ölçümü yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamayı destekler.
- Öngörücü Değer: Belirgin motor bozulmaya sahip genotiplerin belirlenmesiyle portföy elemesini destekleyen nicel davranışsal veriler üretir.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Nörodejenerasyon odaklı tarama kampanyalarında analiz validasyonu için uygun olan standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir negatif geotaksi metrikleri üretir.
- Operasyonel Değer: Otomatik video yakalama ve RflyDetection yazılım analizi yoluyla genetik veya farmakolojik modifikatörlerin hızlı bir şekilde taranmasını sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: Çalışma başına yüzlerce sinekten veri işleyerek, manuel analizlerle karşılaştırıldığında işlem hacmini artırır ve değişkenliği azaltır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Uygunluk: Nörodejeneratif bozukluklardaki klinik hareket kısıtlılıklarıyla paralel olan lokomotor fenotiplerin değerlendirilmesi için hastalıkla ilişkili bir sistem sağlar.
- Preklinik Süreklilik: Progresif nörodejenerasyonu modellemek için sinek yaşları (5, 15, 25, 35 gün) boyunca boylamsal değerlendirmeyi destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: Hedef spesifisitesini ve yolak katılımını doğrulamak için genetik kurtarma deneylerinin (örneğin, auxR/auxGFP ko-ekspresyonu) değerlendirilmesine olanak tanır.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu analiz, hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya kadar uzanan keşif sürecine uyum sağlayarak, nörodejenerasyon modellerinde genetik manipülasyon ile fenotipik sonuç arasında köprü kuran kantitatif bir davranışsal son nokta sunar.
- Keşif Biyolojisi: Yinelemeli negatif geotaksi ölçümleri aracılığıyla gen ekspresyonunu (örneğin, dopaminerjik nöronlardaki aux) lokomotor fonksiyonla ilişkilendirerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Deneysel koşullar arasında güvenilir karşılaştırmalara olanak tanıyan, analiz için hazır ve standardize edilmiş çıktılar (6 saniyedeki tırmanma mesafesi) sağlar.
- Analitik: Gruplar arası karşılaştırmaları ve anlamlılık testlerini desteklemek amacıyla, istatistiksel titizlikle (tek yönlü ANOVA, Bonferroni düzeltmesi) ortalama ± SEM verileri üretir.
- Translasyonel Araştırma: Davranışsal okumaları nörodejeneratif mekanizmalarla ilişkilendirerek, preklinik modellerde biyobelirteç uyumlu fenotipik değerlendirmeyi destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla genotip, yaş ve tedavi grubu boyunca boylamsal davranışsal tarama için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Nicelenebilir, yüksek çözünürlüklü davranışsal fenotipleme yoluyla mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Otomatik senkronizasyon, dijital kayıt ve yazılım tabanlı analiz aracılığıyla tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu geliştirir.
- Stratejik Değer: Büyük örneklem boyutlarında lokomotor defisitlerin hızlı değerlendirmesine olanak tanıyarak go/no-go (devam/dur) karar verme verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Güçlü, yaşa bağımlı fenotipik ilerleme verilerine dayanarak hedeflerin riskle uyumlu önceliklendirilmesini kolaylaştırır.
Uygulama Hususları
- Drosophila bakımı, genetik çaprazlama sürdürme ve davranışsal analiz düzeneği kurulumu konularında uzmanlık gerektirir.
- Otomatik RING aparatı, basamak kontrolörü, dijital kamera ve uyumlu aydınlatma dahil olmak üzere özel enstrümantasyona bağlıdır.
- Videoların aktarımı, anlık görüntülerin çıkarılması ve RflyDetection yazılımının çalıştırılması için hesaplama altyapısı gerektirir.
- Çevresel koşulların standartlaştırılmasını (25°C, %70 nem, 12 saatlik ışık/karanlık döngüsü) ve flakon hazırlama protokollerini içerir.
- Elektrikli bileşenler nedeniyle güvenlik önlemlerini kapsar; aparat çalıştırılmadan önce sabitlenmeli ve doğrulanmalıdır.
