Ateş, Drosophila modeli yetişkin tırmanma davranışı çözümlemek için bir otomatik hızlı yinelemeli negatif Geotaxis tahlil

Bu otomatik hızlı yinelemeli negatif jeotaksi testinin genel amacı, nörodejenerasyon ile ilişkili Drosophila yetişkin tırmanma eksikliklerini analiz etmektir. Bu yöntem, nörodejenerasyon ile ilişkili lokomotif eksikliklerinin mekanizması gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sinek tırmanma aktivitesinin otomatik ve yüksek kanıtlı bir meslekte analiz edilebilmesidir.

Bu tekniğin etkileri, nörodejenerasyonun tedavisi ve teşhisine kadar uzanır, çünkü nörodejeneratif hastalıklar sıklıkla ilerleyici bir hareket yeteneği kaybı ve azalmış yaşam süresi ve yaşa bağlı nörodejenerasyon ile ilişkilidir. İlk olarak bu yöntem için fikir aklımıza geldi. Drosophila yetişkininin lokomotif aktivitesini daha doğru bir şekilde ölçmek istedik.

Sinek toplama işlemini gerçekleştirmek için, sinekleri standart sinek yemi üzerinde 25 santigrat derece,% 70 nemde ve 12 saat aydınlıkta, 12 saatlik karanlık döngüde tutarak başlayın. Karbondioksit anestezisi altında UAS-Dicer2 DDC-GAL4 sinek bakirelerini toplayın. Bakireleri, erkek/dişi oranı bire iki olan aşağıdaki genotipleri taşıyan iki günlük yetişkin erkek sineklere çaprazlayın.

Yeni kapatılmış erkek ve dişileri deney başına her grup için üç şişede ayrı ayrı toplayın ve her normal sinek şişesine standart yiyeceklerle birlikte 10 sinek yerleştirin. Ardından şişeleri 25 santigrat dereceye ayarlayın. Otomatik RING testini gerçekleştirmek için, genotip başına toplanan 10 unisex sineği her bir şişeye aktarın.

Ardından şişeyi bir vidayla sabitleyin. Her deney seti için farklı genotipleri bir arada taşıyan kontrol sineklerini ve sinekleri analiz edin. Cihazın önüne yerleştirilen dijital kamerayı açın ve sinekler yüklenip hazır olduğunda kayda başlayın.

Kamera yatay olarak yerleştirilmeli ve kamera, tüm sineklerin nispeten doğru konumlarındaki konumları yakalamak için RING cihazından uygun bir mesafeye yerleştirilmelidir. Sineklerin şişelere yerleşmesi için bir dakika izin verdikten sonra, adım sürücüsünü kontrol eden adım kontrol cihazını açın. Bu, küçük elektrik motorunu takılı kolu kontrol etmek için çalıştırır, böylece art arda yükselir ve aparatı iki saniye içinde dört kez hafifçe vurur.

Cihaza dokunduktan sonra, sineklerin duvara tırmanmaya başladığını unutmayın. Kayıt hala açıkken, senkronizasyonu az önce gösterildiği gibi, art arda üç ila beş deneme için 60 saniyelik aralıklarla tekrarlayın. Deneyi beş, 15, 25 ve 35 günlük sinekler için tekrarlayın.

Her deney için her grup için en az 30 toplanan sinek veya üç şişe ile en az üç bağımsız deney yapın. Verileri analiz etmek için kaydedilen videoyu bilgisayara aktarın. Her deneme için, dokunduktan altı saniye sonra videonun anlık görüntüsünü alın.

R-fly algılama yazılımında, anlık görüntü görüntüsünü içe aktarmak için dosya menüsünü kullanın. Ardından, Araç Çubuğu'ndaki taban çizgisi simgesini kullanarak, şişenin üst ve alt taban çizgilerini hassas bir şekilde ayarlayın ve ardından görüntüdeki üst ve alt taban çizgilerini işaretlemek için imleci kullanın. Ayarlar çubuğunda, Rect'teki Sinekler alanına, flakon başına sinek sayısını girin ve Tüp Yüksekliği alanına flakon uzunluğunu girin.

Bireysel uçuş pozisyonları algılanır ve her flakon için ekranda noktalarla etiketlenir. Sağ paneldeki bir tabloda, yazılımın her sinek için tırmanma mesafesini otomatik olarak belirlediğini ve her şişedeki 10 sinekten elde edilen ortalama değerleri görüntülediğini unutmayın. Verileri ortalama artı veya eksi SEM olarak sunun.

Bonferroni çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü bir ANOVA kullanarak anlamlılık P değerlerini hesaplayın. Bu videoda sunulan otomatik RING testi kullanılarak Dicer2 tarafından belirlenen sineklerin analizi, hem erkek hem de dişi sinekler için altı saniyelik bir zaman diliminde tırmanma mesafesinde yaşa bağlı bir azalma gösterdi, bu da dopaminerjik veya DA nöronlarındaki aux ekspresyonunun sinek lokomotor aktivitesi için çok önemli olduğunu düşündürdü. Tırmanma yeteneği, DA nöronlarında auxGFP aşırı ekspresyonu ve RNAi fenotipinden kurtarılan DA nöronlarında auxR ve auxGFP'nin birlikte ekspresyonu üzerinde etkilenmemiş gibi görünmektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, düzgün bir şekilde yapılırsa bu iki ila üç saat arasında yapılabilir. Bu gelişmeye sahip olmak, sinirbilim alanındaki araştırmacıların Drosophila melanogaster'deki nörodejenerasyonu keşfetmeleri için bir yoldur. Elektrikli RING cihazı ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirmeden önce her onayın sıkıca sabitlenmesi ve dikkatlice kontrol edilmesi gerektiğini unutmayın.